易徐航，張鈺祺，楊恢檢

萍鄉(xiāng)市食品藥品檢驗(yàn)所，萍鄉(xiāng) 江西 337000

大活絡(luò)丸是由血竭、麝香、牛黃、烏梢蛇、蘄蛇、兩頭尖、防風(fēng)、羌活、全蝎等48 味藥材研成細(xì)粉，混合均勻加煉蜜制成的丸劑。具有祛風(fēng)止痛、舒筋活絡(luò)等功效，臨床上常用于中風(fēng)痰厥引起的癱瘓，足痿痹痛，腰腿疼痛，跌打損傷，胸痹等癥狀［1］。大活絡(luò)丸中含有多味傳統(tǒng)的名貴中藥材，其中，血竭更是被譽(yù)為“活血療傷之良藥”。血竭作為處方中的臣藥，具有生肌斂瘡，活血定痛，化瘀止血之功效［2］，其主要活性成分為血竭素［3］。現(xiàn)代研究表明，血竭素具有活血與止血的雙向調(diào)節(jié)作用［4-7］。目前大活絡(luò)丸的執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)多為衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第六冊(cè)WS3-B-1082-92［8］，該標(biāo)準(zhǔn)已經(jīng)執(zhí)行多年，僅有簡(jiǎn)單的丸劑通則檢查，并不能對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行有效地控制。近年來(lái)，高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）在中成藥中有效成分的含量測(cè)定中應(yīng)用日益廣泛［9-10］。本試驗(yàn)采用LC-MS/MS 法測(cè)定大活絡(luò)丸中血竭素的含量，以期為控制和提高大活絡(luò)丸的質(zhì)量提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 試藥

血竭素高氯酸鹽對(duì)照品（批號(hào)：110811-201707，含量：96.3%），購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；甲醇（HPLC 級(jí)，購(gòu)于ThermoFisher 公司）；甲酸（HPLC 級(jí)，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；水為屈臣氏蒸餾水。樣品信息見(jiàn)表1。

表1 樣品信息

1.2 儀器

安捷倫6460 型高效液相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀；CP-225D 型電子天平（十萬(wàn)分之一，SARTORIUS 公司）；ME-204 型電子天平（萬(wàn)分之一，METTLER TOLEDO 公司）；KQ-500DB 型超聲儀（江蘇昆山市超聲儀器有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

選擇Agilent Poroshell 120 EC-C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，2.7 μm）；流動(dòng)相為甲醇（A）-0.1% 甲酸（B），梯度洗脫（0～3 min，40% A；3～8 min，40% A →100% A；8～10 min，100% A；10～10.5 min，100% A →40% A；10.5～15 min，40% A）；流速0.2 mL/min；柱溫為35 ℃；進(jìn)樣量10 μL。血竭素對(duì)照品和大活絡(luò)丸供試品的總離子流色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 總離子流色譜圖：A.血竭素對(duì)照品；B.供試品

2.2 質(zhì)譜條件

采用電噴霧離子源（ESI）正離子檢測(cè)，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）方式進(jìn)行掃描。干燥氣和霧化器均為高純氮?dú)?，毛?xì)管電壓4 000 V；干燥氣溫度300 ℃；干燥氣流量8 L/min；霧化氣壓力30 psi。選擇質(zhì)荷比（m/z）267.0 →222.9 作為定量離子對(duì)，m/z 267.0 →251.0、m/z 267.0 →196.9 作為定性離子對(duì)。傳輸電壓（Fragmentor）為135 V，碰撞能量（Collision Energy）為34 V。血竭素對(duì)照品和大活絡(luò)丸供試品的二級(jí)質(zhì)譜見(jiàn)圖2。

圖2 二級(jí)質(zhì)譜圖：C.血竭素對(duì)照品；D.供試品

2.3 溶液的配制

2.3.1 對(duì)照品儲(chǔ)備液的制備 精密稱取血竭素高氯酸鹽對(duì)照品10.66 mg，置100 mL 量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得含血竭素74.6 μg/mL的儲(chǔ)備溶液（血竭素重量=血竭素高氯酸鹽重量/1.377）［2］。

2.3.2 供試品溶液的制備 取樣品大蜜丸2 丸，剪碎，加入等量硅藻土，研勻，取約7 g（相當(dāng)于1 丸量）置具塞錐形瓶中，加入甲醇25 mL，稱定重量，超聲處理（功率：500 W，頻率：40 kHz）30 min，放冷至室溫，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，4 000 r/min 離心10 min，取上清液用0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.3.3 陰性樣品溶液的制備 按工藝方法制備缺少血竭藥材的陰性樣品，按“2.3.2”項(xiàng)下方法操作，制成陰性樣品溶液，依法測(cè)定，結(jié)果顯示陰性樣品的總離子流色譜圖中，無(wú)呈現(xiàn)與血竭素對(duì)照品保留時(shí)間相同的色譜峰，見(jiàn)圖3。

圖3 陰性樣品總離子流圖

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察 精密吸取上述血竭素對(duì)照品儲(chǔ)備液，加甲醇逐級(jí)稀釋得系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度分別為37.3、74.6、373.0、746.0、1 492.0、3 730.0 ng/mL。按“2.1”“2.2”項(xiàng)下的色譜和質(zhì)譜條件進(jìn)行測(cè)定，以血竭素對(duì)照品的進(jìn)樣濃度（ng/mL）為橫坐標(biāo)（X），相應(yīng)的峰面積值為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程：Y=328.53X+57 753，r=0.999 8。結(jié)果表明，血竭素的進(jìn)樣濃度在37.3～3 730.0 ng/mL 呈良好線性關(guān)系。

2.4.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取血竭素對(duì)照品溶液（373.0 ng/mL）10 μL，按“2.1”“2.2”項(xiàng)下的色譜和質(zhì)譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 針，測(cè)定峰面積。血竭素峰面積的RSD 為0.40%，表明儀器的精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一份大活絡(luò)丸供試品溶液（編號(hào)S1），分別于制備后0、2、4、6、8、10、12、24 h 精密吸取10 μL 進(jìn)樣，按“2.1”“2.2”項(xiàng)下的色譜和質(zhì)譜條件，測(cè)定血竭素的峰面積，其RSD 為1.28%，結(jié)果表明大活絡(luò)丸供試品溶液在室溫下24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)（編號(hào)S1）樣品六份，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備大活絡(luò)丸供試品溶液，按“2.1”“2.2”項(xiàng)下的色譜和質(zhì)譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算血竭素的含量（μg/g）。結(jié)果計(jì)算得血竭素含量的RSD 為1.02%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.5 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量（編號(hào)S1：3.97 μg/g）的大活絡(luò)丸樣品2 丸，剪碎，加入等量硅藻土，研勻，取約3.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入血竭素對(duì)照品溶液（3.73 μg/mL）適量，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備大活絡(luò)丸加樣回收溶液，按“2.1”“2.2”項(xiàng)下的色譜和質(zhì)譜條件進(jìn)樣測(cè)定含量，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果表明血竭素的平均回收率為100.09%，RSD 為1.42%，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.4.6 檢測(cè)限與定量限 取血竭素對(duì)照品溶液加甲醇逐級(jí)稀釋后進(jìn)樣測(cè)定，以信噪比3∶1的對(duì)照品溶液濃度為檢測(cè)限（LOD），以信噪比10∶1的對(duì)照品溶液濃度為定量限（LOQ）。結(jié)果血竭素檢測(cè)限為1.33 ng/g；定量限為4.00 ng/g。

2.4.7 耐用性試驗(yàn) 取同一批號(hào)（編號(hào)S1）樣品，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備大活絡(luò)丸供試品溶液，分別選擇Agilent Poroshell 120 EC-C18（2.1 mm×100 mm，2.7 μm）；Waters XBridge BEH C18（2.1 mm×100 mm，2.5 μm）；Welch Ultimate XB-C18（2.1 mm×100 mm，3 μm）3 種品牌的色譜柱，按“2.1”“2.2”項(xiàng)下的色譜和質(zhì)譜條件測(cè)定，結(jié)果無(wú)明顯差別。

2.5 樣品測(cè)定

取不同廠家的10 批大活絡(luò)丸（編號(hào)S1-10），按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備大活絡(luò)丸供試品溶液。分別精密吸取血竭素對(duì)照品溶液與大活絡(luò)丸供試品溶液各10 μL 注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 大活絡(luò)丸樣品中血竭素含量測(cè)定結(jié)果（n=3）

3 討論

3.1 紫外與質(zhì)譜檢測(cè)器的比較

本文曾采用高效液相紫外檢測(cè)器對(duì)大活絡(luò)丸中血竭素進(jìn)行含量測(cè)定，由于大活絡(luò)丸處方龐大，成分復(fù)雜，通過(guò)優(yōu)化流動(dòng)相以及改進(jìn)提取方式等方法，其樣品中的主峰分離效果均不理想，且血竭素在處方中的含量較低，紫外檢測(cè)器難以滿足分析要求。質(zhì)譜檢測(cè)器具有專屬性強(qiáng)、靈敏度高等［11-12］優(yōu)勢(shì)，故本試驗(yàn)建立了LC-MS/MS 法測(cè)定大活絡(luò)丸中血竭素含量的方法。

3.2 流動(dòng)相的選擇

在試驗(yàn)中還考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%甲酸水溶液、甲醇-0.01 mol/L 醋酸銨溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液、乙腈-0.01 mol/L 醋酸銨溶液等多組流動(dòng)相體系，結(jié)果表明，流動(dòng)相為甲醇-0.1%甲酸時(shí)梯度洗脫能得到較好的峰型和分離度。

3.3 提取方法及時(shí)間的考察

本次收集的大活絡(luò)丸樣品均為大蜜丸，采用加入等量的硅藻土研勻的方式，以便于目標(biāo)成分的溶出。提取條件采用超聲提取法分別考察了甲醇、50%甲醇、乙醇、50%乙醇四種提取溶劑，結(jié)果表明甲醇提取效率最高。在此基礎(chǔ)上，分別考察了超聲和回流2 種提取方式，結(jié)果顯示超聲與回流提取效率相當(dāng)，故選用提取簡(jiǎn)便的超聲提取方式。同時(shí)對(duì)甲醇溶液用量10、25、50 mL，以及超聲時(shí)間10 min、30 min、1 h 進(jìn)行考察，最后確定采用甲醇超聲（500 W，40 kHz）處理30 min 為宜。

3.4 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

在對(duì)質(zhì)譜條件進(jìn)行優(yōu)化時(shí)，分別考察了毛細(xì)管電壓、干燥氣溫度、干燥氣流量和霧化氣壓力對(duì)含量測(cè)定的影響，最終確定毛細(xì)管電壓4 000 V，干燥氣溫度300 ℃，干燥氣流量8 L/min，霧化氣壓力30 psi 為最優(yōu)狀態(tài)。采用ESI 電離模式，分別比較了血竭素在正離子掃描和負(fù)離子掃描模式下的響應(yīng)信號(hào)，發(fā)現(xiàn)血竭素在正離子化模式下響應(yīng)值較高。通過(guò)全掃模式（Full Scan），確定血竭素的母離子。通過(guò)選擇單離子檢測(cè)模式（SIM）和子離子檢測(cè)模式（Product Ion Scan）對(duì)傳輸電壓和碰撞能量等關(guān)鍵參數(shù)的優(yōu)化，以確保定量檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

3.5 小結(jié)

從對(duì)10 批大活絡(luò)丸中血竭素的含量測(cè)定結(jié)果來(lái)看，血竭素的含量為0.29～7.15 μg/g。不同廠家生產(chǎn)的大活絡(luò)丸血竭素含量相差較大，提示血竭原藥材的質(zhì)量或廠家的生產(chǎn)工藝存在差異。為避免由原藥材或生產(chǎn)工藝引起中成藥的療效差異，建議廠家進(jìn)一步完善質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)和生產(chǎn)工藝，確保產(chǎn)品質(zhì)量的均一性和有效性。本文建立了LC-MS/MS 法測(cè)定大活絡(luò)丸中血竭素含量的方法，經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，該方法結(jié)果準(zhǔn)確、快速，重復(fù)性好，操作簡(jiǎn)便，可用于大活絡(luò)丸中血竭素的含量測(cè)定。