張 巖，吳 丹，徐海洋，徐淋香,3**

(1.江蘇海洋大學(xué)，江蘇連云港 222005；2.江蘇省海洋生物資源與環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇連云港 222005；3.江蘇省海洋生物產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇連云港 222005)

0 引言

右旋糖酐酶是一類(lèi)特異性水解右旋糖酐中α-1,6糖苷鍵的葡聚糖酶，在醫(yī)藥及食品領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[1,2]。在醫(yī)藥領(lǐng)域，利用右旋糖酐酶制備低分子量的右旋糖酐可用于治療腦梗死、改善病患機(jī)體的凝血性能，也可作為代血漿或光學(xué)相干斷層掃描的造影劑[3-5]；右旋糖酐酶還可以水解牙菌斑生物膜中的右旋糖酐，破壞生物膜的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，讓細(xì)菌無(wú)法黏附，從而防治齲齒[6]。在食品領(lǐng)域，利用右旋糖酐酶可以清除制糖過(guò)程中所產(chǎn)生的高分子量右旋糖酐，防止機(jī)器堵塞并提高得糖率和生產(chǎn)效率[7,8]；也可利用右旋糖酐酶制備低聚異麥芽糖，并作為益生元添加到食品中。

目前已報(bào)道產(chǎn)右旋糖酐酶的菌株大多是真菌，雖然酶活較高，但其發(fā)酵周期長(zhǎng)，作用條件偏酸性，且部分真菌發(fā)酵液中含有抗生素或有毒代謝產(chǎn)物，使得該類(lèi)酶很難應(yīng)用于口腔護(hù)理類(lèi)產(chǎn)品中。得益于海洋的特殊環(huán)境，海洋來(lái)源的右旋糖酐酶通常具有生產(chǎn)周期短、最適反應(yīng)溫度低、在中性或偏堿性條件下有很好的活性、無(wú)有毒次級(jí)代謝產(chǎn)物等特點(diǎn)，因而這類(lèi)酶在口腔護(hù)理方面的研究?jī)r(jià)值較高[9-11]。

目前有關(guān)提升右旋糖酐酶產(chǎn)酶能力的報(bào)道已有很多，例如朱慧霞等[12]利用正交試驗(yàn)法將繩狀青霉菌產(chǎn)的右旋糖酐酶的酶活力提高約4.4倍；黃瑞杰等[13]通過(guò)響應(yīng)面法提高圓弧青霉的產(chǎn)酶能力，相較于優(yōu)化前提高30.1%；楊齊等[14]亦是通過(guò)響應(yīng)面法使得腐皮鐮刀菌產(chǎn)的右旋糖酐酶酶活力提高1.3倍。單因素法是通過(guò)對(duì)單一目標(biāo)因素進(jìn)行實(shí)驗(yàn)安排，找到最優(yōu)或者近似最優(yōu)條件。響應(yīng)面法不僅計(jì)算簡(jiǎn)單，而且可以在尋求最佳發(fā)酵條件時(shí)對(duì)試驗(yàn)中的各個(gè)因素進(jìn)行連續(xù)分析，同時(shí)還考慮了試驗(yàn)的隨機(jī)誤差。本研究利用單因素法結(jié)合響應(yīng)面法對(duì)一株產(chǎn)右旋糖酐酶的海洋細(xì)菌THN1進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化，并初步研究該酶的酶學(xué)性質(zhì)，旨在為該酶的進(jìn)一步研究及應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑及樣品來(lái)源

胰蛋白胨和酵母粉購(gòu)自O(shè)xoid公司，其他試劑購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

產(chǎn)右旋糖酐酶的海洋纖維化纖維菌(Cellulosimicrobiumcellulans)THN1為本實(shí)驗(yàn)室從連云港田灣核電站附近海泥中篩選得到，已保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCC M2020430。

1.1.2 培養(yǎng)基

2216E固體培養(yǎng)基：胰蛋白胨5 g/L，酵母粉1 g/L，瓊脂15 g/L，pH自然，陳海水配置。

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 10 g/L，pH自然，去離子水配置。

初始產(chǎn)酶培養(yǎng)基：胰蛋白胨5 g/L，酵母粉1 g/L，右旋糖酐T20 10 g/L，pH自然，陳海水配置。

1.2 儀器與設(shè)備

超凈工作臺(tái)(SW-CJ-1D)購(gòu)自蘇州凈化設(shè)備有限公司；高壓滅菌鍋(GI54DWS)和生化培養(yǎng)箱(SPX-250B-Z)購(gòu)自上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；恒溫?fù)u床(Innova 44R)購(gòu)自美國(guó)Eppendorf公司；酶標(biāo)儀(1510)和臺(tái)式離心機(jī)(Legend Micro 17R)購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的活化、發(fā)酵及粗酶液制備

在2216E固體培養(yǎng)基上使用三區(qū)劃線法對(duì)保藏于-80℃冰箱的菌株THN1進(jìn)行劃線，置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48-72 h。挑取單菌落于LB培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)20 h后，以4%的接種量接種于初始產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)24 h。將發(fā)酵液于10 000 r/min、4℃條件下離心15 min，收集上清液，即為粗酶液。

1.3.2 酶活力測(cè)定

取50 μL粗酶液，加入150 μL 3%右旋糖酐T20溶液(20 mol/L pH值為7.5的Tris-HCl緩沖液配置)，40℃水浴15 min后加入200 μL 3，5-二硝基水楊酸(DNS)終止反應(yīng)，沸水浴5 min后迅速冷卻，加入3 mL去離子水，震蕩搖勻，吸取100 μL反應(yīng)液于540 nm處測(cè)定吸光值[15]。對(duì)照組為先加DNS再加底物，其他操作同實(shí)驗(yàn)組。

酶活力定義：每分鐘產(chǎn)生1 μmol還原糖所需要的酶量為一個(gè)酶活力單位(U)。

1.3.3 單因素實(shí)驗(yàn)

將初始產(chǎn)酶培養(yǎng)基中的酵母粉改為1 g/L其他碳源(乳糖、蔗糖、玉米淀粉、麩皮、葡萄糖、糊精、馬鈴薯淀粉、大麥粉、麥芽糖)，其他條件不變，按照1.3.1節(jié)方法提取粗酶液并按照1.3.2節(jié)方法測(cè)定酶活力，確定最佳碳源。

在最佳碳源的基礎(chǔ)上，用5 g/L的其他氮源(酵母粉、魚(yú)粉蛋白胨、豆粕、氯化銨、硫酸銨、花生粕、尿素、干酪素、硝酸鈉)代替胰蛋白胨，其他條件同上，測(cè)定酶活力，確定最佳氮源。

在最優(yōu)碳源、氮源基礎(chǔ)上，分別改變碳源的添加量(1，5，10，15，20 g/L)、氮源添加量(5，8，10，15，20 g/L)、培養(yǎng)溫度(15，20，25，30，37，40，45℃)、右旋糖酐T20的添加量(0，1，2，3，4，5，8，10，15 g/L)、初始pH值 (5.0，6.0，7.0，7.5，8.0，9.0，10.0)以及NaCl的添加量(0，5，10，15，20，30，40，50 g/L)，研究這些因素對(duì)菌株THN1產(chǎn)酶的影響。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)實(shí)驗(yàn)組均做3組平行，每組平行測(cè)3組數(shù)據(jù)，計(jì)算酶活力平均值及誤差。采用Origin 2018進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和繪圖。

1.3.5 響應(yīng)面Box-Behnken (BB)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

基于單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取胰蛋白胨添加量(A)、NaCl添加量(B)、初始pH值 (C)3個(gè)因素，以右旋糖酐酶酶活力(R1)作為響應(yīng)值，通過(guò)Design-Expert 12軟件設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)組合優(yōu)化發(fā)酵條件(表1)。

表1 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)各因素和水平值

1.3.6 菌株THN1生長(zhǎng)曲線及產(chǎn)右旋糖酐酶時(shí)間進(jìn)程

根據(jù)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，獲得產(chǎn)右旋糖酐酶的最優(yōu)發(fā)酵條件，在此條件下培養(yǎng)菌株THN1。期間每2 h取一次發(fā)酵液樣品，測(cè)定樣品在波長(zhǎng)600 nm處的吸光值，根據(jù)1.3.2節(jié)的方法測(cè)定酶活力。

1.3.7 酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定

最適反應(yīng)溫度及溫度穩(wěn)定性：將粗酶液與底物混合后置于不同溫度下(20，25，30，35，40，45，50，55，60℃)反應(yīng)15 min，測(cè)定酶活力，確定該酶的最適反應(yīng)溫度；將粗酶液分別置于30，40，50℃水浴中孵育，每隔1 h取出適量粗酶液，在最適反應(yīng)溫度下測(cè)定殘余酶活力。

最適pH值及pH穩(wěn)定性：配置終濃度為50 mmol/L不同pH值(3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，7.5，8.0，8.5，9.0)的3%右旋糖酐T20底物，將粗酶液與上述底物混合后，在最適反應(yīng)溫度下測(cè)定酶活力，確定該酶的最適反應(yīng)pH值；在粗酶液中加入終濃度為50 mmol/L的不同pH值(3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，7.5，8.0，8.5，9.0)緩沖液放置于4℃冰箱24 h后，在最適反應(yīng)溫度和pH條件下測(cè)定殘余酶活力。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)篩選結(jié)果

由圖1a-h可知，在碳源為麩皮、氮源為胰蛋白胨、麩皮添加量為5 g/L、胰蛋白胨添加量為15 g/L、培養(yǎng)溫度為30℃、誘導(dǎo)劑右旋糖酐T20添加量為5 g/L、培養(yǎng)基初始pH值為7.5、NaCl添加量為15 g/L等單因素條件下，菌株THN1產(chǎn)右旋糖酐酶的能力分別達(dá)到最優(yōu)。其中，當(dāng)改變氮源添加量(5→15 g/L)和NaCl添加量(0→15 g/L)，發(fā)酵液測(cè)得的酶活力分別從0.28 U/mL提升到1.17 U/mL以及從1.79 U/mL提升到2.33 U/mL，菌株THN1產(chǎn)右旋糖酐酶能力均顯著提升。

圖1 各因素對(duì)菌株THN1產(chǎn)右旋糖酐酶的影響

氮源是構(gòu)成生物體蛋白質(zhì)、酶、核酸及其他氮素化合物的重要基礎(chǔ)物質(zhì)，因而氮源添加量的選擇對(duì)微生物生長(zhǎng)尤為重要。在本研究中，當(dāng)?shù)刺砑拥揭欢舛群?，繼續(xù)添加反而使酶活力降低(圖1d)，這與張彥君等[16]以及侯殿志等[17]的研究結(jié)果相似。本研究中的右旋糖酐酶產(chǎn)自一株海洋細(xì)菌THN1，該菌株有一定的嗜鹽性，因此在一定范圍內(nèi)該菌產(chǎn)右旋糖酐酶能力會(huì)隨著NaCl濃度的增加而增強(qiáng)，但超過(guò)峰值后產(chǎn)酶能力急劇下降(圖1h)，這與Lai等[15]的研究結(jié)果相似。此外，初始pH值會(huì)直接影響到微生物的營(yíng)養(yǎng)吸收以及代謝過(guò)程中酶的活性(圖1g)。因此，后續(xù)選擇胰蛋白胨添加量、NaCl添加量和初始pH值進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的優(yōu)化因素。

2.2 Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取胰蛋白胨添加量(A)、NaCl添加量(B)、初始pH值 (C) 3個(gè)主要影響因素，以右旋糖酐酶酶活力(R1)作為響應(yīng)值，進(jìn)行發(fā)酵條件響應(yīng)面優(yōu)化。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，建立回歸模型如下：

R1=3.21+0.4713A-0.67B+0.9178C-

0.293AB+0.292AC+0.0905BC-0.7493A2-

0.8463B2-1.06C2。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

方差分析(表3)顯示，所建立模型具有極顯著性(P=0.000 6)，決定系數(shù)R2=0.956，失擬項(xiàng)不顯著(P=0.125 4)，說(shuō)明試驗(yàn)?zāi)Ｐ蛿M合度較好。各因素對(duì)產(chǎn)右旋糖酐酶的影響由大到小排序?yàn)槌跏紁H值(C)>NaCl添加量(B)>胰蛋白胨添加量(A)。

表3 回歸模型方差分析

圖2是各影響因素與右旋糖酐酶酶活力關(guān)系的三維響應(yīng)面圖。通過(guò)分析得到菌株THN1的最佳產(chǎn)酶條件為胰蛋白胨19.97 g/L，NaCl 10.43 g/L，pH值為8.22，結(jié)合回歸模型計(jì)算得出最大酶活力為3.70 U/mL。為方便實(shí)際研究，選取胰蛋白胨20 g/L，NaCl 10 g/L，pH值為8.2進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，獲得右旋糖酐酶酶活力為(3.71 ± 0.01) U/mL，是初始酶活力(0.12 U/mL)的31倍，并且與預(yù)測(cè)值無(wú)顯著差異(P>0.05)，說(shuō)明該模型能較好地預(yù)測(cè)實(shí)際發(fā)酵情況。

圖2 胰蛋白胨、NaCl和pH值對(duì)菌株THN1產(chǎn)酶影響的響應(yīng)面

2.3 菌株THN1細(xì)胞生產(chǎn)和產(chǎn)酶時(shí)間關(guān)系

圖3是菌株THN1在最佳產(chǎn)右旋糖酐酶條件下的生長(zhǎng)曲線及產(chǎn)酶時(shí)間進(jìn)程。菌株THN1在發(fā)酵12 h后生長(zhǎng)進(jìn)入對(duì)數(shù)期，在30 h后進(jìn)入穩(wěn)定期。在12 h前，右旋糖酐酶酶活力幾乎為0；在12-26 h期間，右旋糖酐酶酶活力隨著菌體量的增長(zhǎng)而提高，并在25 h左右達(dá)到最高；在26 h后，右旋糖酐酶酶活力隨著發(fā)酵時(shí)間的增長(zhǎng)而呈下降趨勢(shì)。以上結(jié)果表明菌株THN1在培養(yǎng)24 h左右達(dá)到最高產(chǎn)酶水平。

圖3 菌株THN1細(xì)胞生長(zhǎng)及產(chǎn)右旋糖酐酶的時(shí)間進(jìn)程曲線

2.4 酶學(xué)性質(zhì)

如圖4a和4b所示，菌株THN1產(chǎn)右旋糖酐酶的最適反應(yīng)溫度為40℃，在25-50℃時(shí)相對(duì)酶活力超過(guò)70%，在30℃時(shí)有較好的溫度穩(wěn)定性，放置5 h基本沒(méi)有活力損失，這與張宇琪等[18]有關(guān)細(xì)菌來(lái)源右旋糖酐酶的報(bào)道一致。菌株THN1產(chǎn)右旋糖酐酶的最適pH值為7.5，在pH值為7.0-9.0條件下能保持60%以上的相對(duì)酶活力(圖4c)。此外，右旋糖酐酶在pH值為5.0-9.0條件下放置24 h (4℃)，相對(duì)酶活力仍能保持50%以上，其中，pH值為5.5的乙酸鈉緩沖液、pH值為7.0的磷酸鹽緩沖液和pH值為9.0的Tris-HCl緩沖液中均能保持80%以上的相對(duì)酶活力(圖4d)，表明該酶在中性以及弱堿性條件下穩(wěn)定性較好。

圖4 菌株THN1右旋糖酐酶酶學(xué)性質(zhì)

菌株THN1產(chǎn)右旋糖酐酶的最適溫度、pH值分別是40℃和7.5，這與Ren等[10]以及Deng等[19]發(fā)現(xiàn)的海洋來(lái)源的右旋糖酐酶性質(zhì)相似。上述文獻(xiàn)中均有右旋糖酐酶對(duì)牙菌斑生物膜的清除和抑制作用的相關(guān)實(shí)驗(yàn)。因此，為拓展右旋糖酐酶在口腔護(hù)理方面的應(yīng)用，后續(xù)研究可探索THN1右旋糖酐酶對(duì)牙菌斑生物膜的抑制和清除效果，以及研究市售口腔護(hù)理產(chǎn)品中化學(xué)試劑之間對(duì)該酶的功效是否存在協(xié)同或拮抗作用。

3 結(jié)論

菌株THN1產(chǎn)右旋糖酐酶的最佳條件為麩皮5 g/L，胰蛋白胨20 g/L，右旋糖酐T20 5 g/L，NaCl 10 g/L，pH值為8.2，陳海水配置，30℃培養(yǎng)24 h，在此條件下右旋糖酐酶的酶活力為(3.71±0.01) U/mL，是初始產(chǎn)酶培養(yǎng)基酶活力的31倍左右，這將有利于右旋糖酐酶生產(chǎn)周期的縮短和生產(chǎn)成本降低。該酶的最適反應(yīng)溫度為40℃，在25-50℃條件下有較好的活性；最適反應(yīng)pH值為7.5，在30℃和40℃條件下有很好的穩(wěn)定性，對(duì)口腔牙菌斑生物膜的清理具有良好的應(yīng)用潛能。