李立章，柴子舒，汝 梅，蘇本偉，朱開昕，李永華**，陸海琳**

(1.廣西中醫(yī)藥大學藥學院，廣西南寧 530200；2.欽州市中醫(yī)醫(yī)院，廣西欽州 535000)

0 引言

桑寄生，又稱桑上寄生，是桑寄生科Loranthaceae鈍果寄生屬Taxillus植物廣寄生Taxilluschinensis的干燥帶葉莖枝，是現行《中華人民共和國藥典》(一部)(以下簡稱《藥典》)收載的藥材品種之一?！端幍洹分猩＜纳幉臑槎嗉闹鱽碓?，而桑樹寄生為單一寄主來源，即寄主僅為?？芃oraceae桑屬Morus植物桑樹Morusalba[1]。

近年來，圍繞寄主對寄生藥材質量的影響，學者們做了大量的研究工作，從藥材顯微特征[2]、化學成分[3-8]、毒理[9]、藥理藥效[10,11]等多個方面展開研究，取得多項研究成果。研究發(fā)現，不同寄主植物的桑寄生總黃酮、槲皮素、槲皮苷等含量不同[3,4]，特別是寄主會通過它們之間的寄生關系，將寄主的特有成分向寄生藥材傳輸，從而對寄生藥材質量產生影響[12,13]。目前，對于桑寄生藥材的質量檢查，《藥典》僅規(guī)定了強心苷的排除性檢查，即藥材不得檢出強心苷，才可作為桑寄生藥材使用[1]。但自然條件下的桑寄生藥材寄主來源復雜廣泛，除了含強心苷類型的有毒寄主外，還有大量的非強心苷類型的其他有毒寄主，如果只是完全按《藥典》執(zhí)行標準，就會造成一些非強心苷類型的毒性寄主成為桑寄生藥材的來源寄主，使有毒的桑寄生藥材合法進入流通和使用領域[9，14，15]。

本研究擬從寄主和寄生藥材成分的傳輸關系切入，以桑樹寄生藥材為研究對象，在參考《藥典》桑寄生藥材質量標準的基礎上，以柳樹、肉桂等寄主來源的寄生藥材作對照，通過高效液相色譜法同時對桑樹寄生藥材槲皮苷和桑辛素“雙指標”成分含量進行檢測，探討桑樹寄生藥材質量控制的有效途徑，為科學指導臨床用藥，進一步完善《藥典》桑寄生藥材質量標準提供科學參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

桑樹寄生、柳樹寄生和肉桂寄生與其寄主植物桑枝、柳枝和桂枝藥材樣品均采自廣西野生環(huán)境區(qū)域，各種寄生藥材基源植物經廣西中醫(yī)藥大學藥學院郭敏副教授鑒定為桑寄生科植物廣寄生Taxilluschinensis(DC.) Danser，寄主分別為桑科植物桑MorusalbaL.、楊柳科植物垂柳SalixbabylonicaL.、樟科植物肉桂CinnamomumcassiaPresl，樣品采集信息見表1。

表1 樣品采集信息表

1.1.2 實驗試劑

甲醇(Fisher Scientific，色譜純)、乙腈(Fisher Scientific，色譜純)、磷酸(成都金山化學試劑有限公司，分析純)；槲皮苷對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：11538-201606，純度≥90.6%)；桑辛素對照品(成都麥德生科技有限公司，批號：RP190214，純度≥99.0%)。

1.1.3 儀器與設備

Waters e2695-2998/2489型高效液相色譜儀，KQ-5200B超聲波清洗儀(江蘇昆山超聲儀器有限公司),十萬分之一電子分析天平(賽多利斯科學儀器有限公司，型號：CPA225D),電熱恒溫水浴鍋(北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司，型號：BHS-6),16K臺式離心機(珠海黑馬醫(yī)學儀器有限公司),實驗室超純水儀器(廣西南寧市博美生物科技有限公司，型號：Direct-Q5UV)。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件

色譜柱：Waters C18柱(5 μm，4.6×250 mm);流速：1.0 mL/min;柱溫：30℃;進樣量:10 μL;流動相：乙腈(A)-0.1%磷酸(C);梯度洗脫：0-40 min，18%A-72%A，82%C-28%C，40-55 min，72%A，28%C)；檢測波長：0-30 min，256 nm(槲皮苷)，30-55 min，269 nm(桑辛素)。

1.2.2 對照品溶液制備

精密稱取槲皮苷標準品16.78 mg、桑辛素16.25 mg分別置于10 mL和500 mL的容量瓶中，加入75%甲醇定容到刻度，即得1.678 mg/mL槲皮苷、0.032 mg/mL桑辛素的單一對照品溶液，精密吸取上述溶液各1 mL，定容到同一10 mL容量瓶中，得到每毫升含槲皮苷167.800 μg、桑辛素3.250 μg的混合對照品溶液。

1.2.3 供試品溶液制備

依照蘇本偉等[16]最佳槲皮苷提取工藝，取桑樹寄生藥材粉末(SSJS-1) 0.50 g，精密稱定，置于100 mL具塞錐形瓶中，加入75%甲醇25 mL，稱量，浸泡1 h，超聲45 min，冷卻，補足失重，經0.45 μm微孔濾膜過濾，即得供試品溶液。

2 結果與分析

2.1 系統(tǒng)適應性試驗

取1.2.2節(jié)的混合對照品溶液10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖(圖1)。槲皮苷的保留時間為12.126 min，桑辛素的保留時間為45.207 min，槲皮苷和桑辛素之間的分離度為9.1，大于2.0，達到良好的分離效果，該方法可用于同時檢測槲皮苷和桑辛素的含量。

1.槲皮苷Quercitrin,2.桑辛素Morusin

2.2 檢測限和定量限

分別取1.2.2節(jié)的槲皮苷和桑辛素對照品溶液適量，加溶劑溶解并稀釋成每毫升約含10 μg對照品的溶液，用溶劑逐級稀釋后，按1.2.1節(jié)的色譜條件進樣測定。檢測限為信噪比≥3時所對應的濃度，定量限為信噪比≥10時所對應的濃度。得出槲皮苷和桑辛素檢測限分別為0.044，0.021 μg/mL，定量限分別為0.319，0.162 μg/mL。

2.3 標準曲線的繪制

精密吸取1.2.2節(jié)混合對照品溶液，用75%甲醇稀釋成一系列質量濃度的混合對照品溶液。其中，槲皮苷質量濃度為5.034，12.585，20.975，41.950，83.900，125.850和167.800 μg/mL，桑辛素質量濃度為0.098，0.244，0.406，0.813，1.625，2.438和3.250 μg/mL。取10 μL混合對照品溶液進樣，測定峰面積，以對照品溶液的濃度為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)，計算得出線性回歸方程(表2)。表明槲皮苷、桑辛素在上述濃度范圍呈良好線性關系。

表2 槲皮苷、桑辛素線性回歸方程

2.4 精密度試驗

精密吸取1.2.2節(jié)混合對照品溶液，在色譜條件下連續(xù)進樣6次，計算對照品中槲皮苷的平均峰面積與桑辛素的平均峰面積，得到槲皮苷的RSD值為0.18%，桑辛素RSD值為0.85%，測量方法的精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗

精密稱取桑樹寄生(SSJS-1)粉末6份，每份0.5 g，精密稱定，依照1.2.3節(jié)的方法平行制備，按照1.2.1節(jié)的色譜條件，每隔5 h進行一次含量測定，計算24 h內供試品溶液中槲皮苷與桑辛素的含量。槲皮苷RSD值為0.89%，桑辛素RSD值為1.75%，結果表明供試品溶液中槲皮苷與桑辛素在24 h內保持穩(wěn)定。

2.6 重復性試驗

精密稱取桑樹寄生(SSJS-1)粉末6份，每份0.5 g，精密稱定，依照1.2.3節(jié)的方法平行制備，按照1.2.1節(jié)的色譜條件進樣測定，計算供試品溶液中槲皮苷與桑辛素的含量，結果顯示槲皮苷RSD值為0.64%，桑辛素RSD值為2.86%，表明該方法重復性良好。

2.7 加樣回收試驗

精密稱取已知槲皮苷含量(2.29 mg/g)，桑辛素含量(3.56 μg/g)的桑樹寄生(SSJS-1)粉末6份，分別精密加入槲皮苷0.567 mg、桑辛素0.765 μg，依照1.2.3節(jié)的方法平行制備，按照1.2.1節(jié)的色譜條件進樣測定，計算得出槲皮苷平均回收率為99.50%，RSD值為2.95%;桑辛素平均回收率為94.61%，RSD值為2.49%。

2.8 樣品測定

將表1中桑樹寄生、柳樹寄生、肉桂寄主與其寄主樣品依照1.2.3節(jié)的方法平行制備，按照1.2.1節(jié)的色譜條件進樣測定，計算槲皮苷和桑辛素的平均含量。10批桑樹寄生均能檢測到槲皮苷和桑辛素，寄主桑枝也能檢測到桑辛素，柳樹寄生和肉桂寄生僅檢測到槲皮苷而檢測不到桑辛素。寄生樣品中槲皮苷的含量為1.98-3.11 mg/g，桑辛素的含量為0.27-4.27 μg/g (表3、圖2)。

表3 桑樹寄生、柳樹寄生、肉桂寄生與其寄主中槲皮苷和桑辛素的含量測定(n=3)

1.槲皮苷Quercitrin,2.桑辛素Morusin

3 討論

3.1 槲皮苷屬于桑樹寄生藥材基源植物廣寄生專屬性成分

現行《藥典》用槲皮素定性檢測來進行桑寄生藥材質量控制。研究發(fā)現，在桑寄生中游離槲皮素含量很低，在不酸解的情況下主要以槲皮苷的形式存在[17,18]。槲皮苷為黃酮類化合物,與人血清白蛋白的相互作用關系密切[19]，具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化、降血糖、降血壓、抗心律失常等藥理作用[20]，槲皮苷符合作為桑樹寄生藥材質量控制指標成分的要求。本研究對桑樹寄生、柳樹寄生、肉桂寄生與其寄主中槲皮苷的含量進行測定，結果顯示10批不同產地桑樹寄生與對照藥材柳樹寄生和肉桂寄生均能檢測到槲皮苷，而寄主桑枝、柳枝和桂枝則檢測不到槲皮苷，表明桑樹寄生中的槲皮苷與寄主無關，屬于藥材基源植物專屬性成分，即無論來自什么寄主，寄生藥材都含有這個成分。槲皮苷可作為桑樹寄生藥材質量控制中“雙指標”成分之一。

3.2 寄主桑樹特有成分桑辛素能傳輸到桑樹寄生藥材

研究發(fā)現，寄主會通過其與寄生之間的特殊關系，將寄主的一些次生代謝物質傳輸到寄生藥材中并達到一定量的累積[14,15]，這也是寄主影響寄生藥材質量的關鍵所在。在本研究中，桑枝、桑樹寄生均可檢測到桑辛素，而柳枝和柳樹寄生、桂枝和肉桂寄生均檢測不到桑辛素，說明桑辛素為寄主桑樹的特有成分，桑樹寄生的桑辛素是由寄主桑樹傳輸而來。研究結果進一步揭示了寄主會通過向其寄生傳輸寄主的特有成分，從而對寄生藥材質量產生影響。通過對桑寄生藥材進行桑辛素成分檢測，可以鑒定其是否屬于桑樹寄主來源，桑辛素可作為桑樹寄生藥材質量控制中“雙指標”成分之二。

4 結論

本方法同時對槲皮苷和桑辛素“雙指標”成分進行含量檢測，方法簡便、可行。作為一種新的鑒別方法，本方法能鑒別寄主來源，實現對桑樹寄生藥材的質量控制。同時，“雙指標”成分檢測方法為其他寄主來源的寄生藥材質量控制提供可借鑒的技術方法。