劉改霞 邱銓鵬 任博博 張浩為 劉輝 李雯 石晨 佘軍軍

結(jié)直腸癌是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率以及死亡率分別居于全球腫瘤的第3 位和第4 位，每年有近90 萬人因其死亡[1]。在中國，近年來隨著經(jīng)濟(jì)水平的發(fā)展和飲食結(jié)構(gòu)的改變，結(jié)直腸癌發(fā)病率和死亡率持續(xù)增高[2]。腸道菌群紊亂在結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展以及預(yù)后轉(zhuǎn)歸中起著重要作用。結(jié)直腸癌組織中富集的細(xì)菌如具核梭桿菌（Fusobacterium nucleatum）、厭氧消化鏈球菌（Peptostreptococcus anaerobius）、產(chǎn)腸毒素擬桿菌（Enterotoxigenic bacteroides）等可以通過直接誘導(dǎo)DNA 損傷，激活某些致癌信號通路等促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)生[3]。而腸道中某些有益的細(xì)菌，如勞氏菌屬可以產(chǎn)生短鏈脂肪酸，其具有抗炎，修復(fù)腸道上皮損傷，維持腸道穩(wěn)態(tài)的功能[3]。

近年來大量研究顯示，闌尾切除也會增加術(shù)后結(jié)直腸癌的發(fā)生率。Mcvay 等[4]最早通過患者死亡后尸檢研究發(fā)現(xiàn)，因結(jié)直腸癌死亡的病例中闌尾切除率遠(yuǎn)高于因其他疾病（心血管疾病、其他惡性腫瘤等）死亡病例中的闌尾切除率，從而提出闌尾可能作為腸道抵抗惡性病變的一種重要結(jié)構(gòu)與腸道惡性疾病密切相關(guān)。Lai 等[5]回顧性研究從1998年至2003年醫(yī)院確診的急性闌尾炎患者，發(fā)現(xiàn)40 歲以上有過闌尾炎病史的人群患結(jié)直腸癌的風(fēng)險比是普通人群的38.5 倍。且有研究表明，長期隨訪闌尾切除后人群，其腸道菌群多樣性和豐富度明顯降低，糞便菌群組成發(fā)生明顯改變[6]。隨著對闌尾角色與功能研究的不斷深入，大量闌尾與結(jié)直腸癌關(guān)系的相關(guān)研究相繼被報道和開展中[7]，但是闌尾切除與其后結(jié)直腸癌預(yù)后之間的關(guān)系，目前尚未明確，其潛在機(jī)制也需要進(jìn)一步探索。

本研究回顧了西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院收治的結(jié)直腸癌患者的臨床資料，旨在探究既往闌尾切除與結(jié)直腸癌預(yù)后的相關(guān)關(guān)系。進(jìn)一步基于小鼠闌尾切除模型，誘導(dǎo)炎癥相關(guān)結(jié)直腸癌，闡明小鼠糞便菌群組成變化，進(jìn)行初步機(jī)制探索。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床資料 回顧性收集2013年1月至2016年12月期間于西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院就診的1 092 例結(jié)直腸癌患者的臨床以及病理資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：1）年齡20～80 歲；2）經(jīng)病理組織學(xué)診斷為結(jié)直腸腺癌；3）未合并其他類型腫瘤；4）臨床及病理資料信息完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：1）結(jié)直腸癌診斷前既往患有其他腫瘤的患者；2）既往有炎癥性腸病、家族性腺瘤性息肉病、遺傳性非息肉性結(jié)直腸癌等遺傳性結(jié)直腸癌的患者；3）闌尾切除后一年之內(nèi)發(fā)生結(jié)直腸癌的病例；4）因闌尾腫瘤行闌尾切除術(shù)或結(jié)腸切除的病例。根據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)，最終納入763 例病例。根據(jù)患者在結(jié)直腸癌診斷前是否存在闌尾切除史，將其分為闌尾切除組（89 例）和非闌尾切除組（674 例）。通過病歷記錄中既往闌尾切除病史及住院期間腹部CT 等影像學(xué)檢查評價結(jié)直腸癌診斷前闌尾切除史。

1.1.2 動物實驗材料 氧化偶氮甲烷和葡聚糖硫酸鈉購自美國sigma-aldrich 公司，糞便DNA 基因組提取試劑盒購自德國Qiagen 公司，qRT-PCR 引物由中國生工生物工程公司合成及測序，相關(guān)引物序列：普氏菌屬：F：5'-AATAAGGACCGGCTAATTCCGT-3'，R：5'-CTACGCTCCCTTTAAACCCAAT-3'；擬桿菌屬：F：5'-CGGTAATACGGAGGATCCGA-3'，R：5'-CCTACG CTCCCTTTAAACCC-3'；布氏菌屬：F：5'-GACGGTA CCTGACTAAGAAGCC-3'，R：5'-TCAACAGTTTCCA ATGCAGTCC-3'；細(xì)菌通用引物：F：5'-GCAGGCCT AACACATGCAAGTC-3'，R： 5'-CTGCTGCCTCCCGT AGGAGT-3'[8]。

1.2 方法

1.2.1 臨床數(shù)據(jù)分析 通過西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院于生物樣本信息資源中心收集結(jié)直腸癌患者去隱私化相關(guān)臨床信息，包括：性別、年齡、診斷、既往史、吸煙飲酒史、家族史、治療方法、術(shù)后是否放化療、是否R0 切除；其中吸煙飲酒史進(jìn)行分級，將吸煙狀態(tài)分為3 個等級：不吸煙者，戒煙者，現(xiàn)在吸煙者；將飲酒狀態(tài)分為2 個狀態(tài)：不飲酒者，飲酒者（包括輕、中、重度飲酒者）[9]。腫瘤臨床病理特征：病理診斷、腫瘤位置、腫瘤病理分期、腫瘤臨床分期（采用第8 版國際抗癌聯(lián)盟/美國癌癥聯(lián)合委員會的TNM 分期）、腫瘤分化程度（采用世界衛(wèi)生組織消化系統(tǒng)腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)）；其中腫瘤位置根據(jù)國際腫瘤學(xué)疾病分類，分為近端結(jié)腸（盲腸-結(jié)腸脾曲）、遠(yuǎn)端結(jié)腸（降結(jié)腸-乙狀結(jié)腸）、直腸（直乙交界-直腸）[10]。預(yù)后信息：存活狀態(tài)、是否復(fù)發(fā)、是否轉(zhuǎn)移、死亡原因、死亡日期。

1.2.2 隨訪 隨訪信息采集方式包括門診復(fù)查及電話隨訪。隨訪內(nèi)容包括患者的疾病發(fā)展情況、生存狀態(tài)及死亡原因等。隨訪終點為2020年3月1 日或患者死亡。納入研究的763 例患者中，64 例患者因聯(lián)系方式變更等原因失訪，總失訪率為8.39%。

1.2.3 動物實驗 1）動物分組和模型建立：無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級雄性C57BL/6 小鼠30 只，8～10 周齡，體重為20～26 g。所有小鼠均飼養(yǎng)于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部動物實驗中心SPF 級動物實驗室，每籠5 只，飼養(yǎng)溫度嚴(yán)格控制在（22±2）℃，光暗循環(huán)（光照12 h，黑暗12 h），小鼠均自由攝取食物和飲水。參照本課題組已發(fā)表研究制作小鼠闌尾切除模型，其中對照組進(jìn)行假手術(shù)處理。手術(shù)操作后正常飼養(yǎng)7 天后，均進(jìn)行氧化偶氮甲烷（AOM）+ 葡聚糖硫酸鈉（DSS）結(jié)直腸癌誘導(dǎo)（圖1）[11]。2）動物標(biāo)本采集和處理：實驗第11 周，所有小鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉后，采集小鼠全段結(jié)直腸，剖開腸腔，收取所有糞便顆粒于-80℃凍存，在顯微鏡下進(jìn)行腸黏膜大體觀察，留取疑似腫瘤的部分腸段進(jìn)行福爾馬林固定，石蠟包埋切片后行H&E 染色，進(jìn)行病理診斷。3）qPCR 糞便細(xì)菌定量：根據(jù)病理結(jié)果，隨機(jī)選取闌尾切除組發(fā)生結(jié)直腸癌小鼠5 只，未發(fā)生結(jié)直腸癌小鼠5 只，對照組發(fā)生結(jié)直腸癌小鼠5 只，未發(fā)生結(jié)直腸癌小鼠5 只。采用糞便DNA 基因組提取試劑盒進(jìn)行糞便DNA 提取。選擇細(xì)菌屬水平16 S rRNA 基因的保守區(qū)域（V3-V4 區(qū)域）進(jìn)行引物設(shè)計，目標(biāo)菌屬的豐度用2?ΔCt（其中ΔCt=每個目標(biāo)菌屬的平均Ct 值-細(xì)菌總數(shù)的平均Ct 值）作進(jìn)行計算。兩組之間的差異比較采用t檢驗。

圖1 小鼠闌尾切除后結(jié)直腸癌誘導(dǎo)模型制作流程圖[11]

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理及統(tǒng)計學(xué)分析。正態(tài)分布的計量資料采用±s 表示，非正態(tài)分布的計量資料用中位數(shù)（范圍）表示，計數(shù)資料用頻數(shù)和百分比表示?？傮w生存率的分析采用Kaplan-Meier 法，組間生存比較采用Log-rank 檢驗。采用Cox 回歸分析明確闌尾切除史是否為結(jié)直腸癌獨立預(yù)后危險因素。以P<0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基本臨床資料

闌尾切除組患者和非闌尾切除組患者臨床基本特征如表1 所示，兩組在年齡分布、性別組成、吸煙飲酒史、糖尿病史、腫瘤臨床分期、腫瘤TNM 分期、術(shù)后放化療、是否R0 切除方面差異無統(tǒng)計學(xué)意義（表1）。

表1 闌尾切除組與非闌尾切除組基本臨床資料 例（%）

表1 闌尾切除組與非闌尾切除組基本臨床資料 （續(xù)表1）

2.2 闌尾切除與結(jié)直腸癌預(yù)后的關(guān)系

Kaplan-Meier 生存分析顯示，闌尾切除組中位生存時間為55.000（95%CI：38.654～71.346）月；闌尾切除組的1、3、5年總體生存率分別為：88.8%、61.8%、46.4%，非闌尾切除組的1、3、5年總體生存率分別為：89.5%，75.1%，69.3%，兩組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=13.777，P<0.01，圖2）。Cox 單因素分析顯示：年齡、闌尾切除、腫瘤病理分期、腫瘤臨床分期、腫瘤分化、腫瘤位置、糖尿病、R0 切除、術(shù)后放/化療均與結(jié)直腸癌預(yù)后相關(guān)（P<0.05，表2）；將以上危險因素和性別納入Cox 多因素分析，結(jié)果顯示闌尾切除是結(jié)直腸癌預(yù)后獨立危險因素[HR=1.475，95%CI：1.030～2.114；P=0.034，表2]。根據(jù)性別、年齡、腫瘤分化、腫瘤臨床分期、腫瘤位置、糖尿病、R0 切除、術(shù)后放化療進(jìn)行校正，Cox 多因素回歸結(jié)果顯示：闌尾切除后1～3年內(nèi)發(fā)生結(jié)直腸癌的患者其死亡風(fēng)險是無闌尾切除史的結(jié)直腸癌患者的2.772 倍（95%CI：1.272～6.043，表3）。

表2 不同因素對于結(jié)直腸癌總生存率影響的Cox 單因素與多因素回歸分析

表2 不同因素對于結(jié)直腸癌總生存率影響的Cox 單因素與多因素回歸分析 （續(xù)表2）

表3 闌尾切除暴露時間與結(jié)直腸癌總生存率相關(guān)關(guān)系的Cox 單因素與多因素回歸分析

圖2 闌尾切除與非闌尾切除結(jié)直腸癌患者總生存率曲線

2.3 闌尾切除后結(jié)直腸癌小鼠的糞菌變化

利用qPCR 檢測腸道細(xì)菌屬水平變化，在發(fā)生結(jié)直腸癌的小鼠中，相比于未行闌尾切除的小鼠糞菌，闌尾切除的小鼠腸道中普氏菌屬明顯富集（P<0.01）。闌尾切除小鼠，經(jīng)AOM+DSS 誘導(dǎo)發(fā)生結(jié)直腸癌其糞菌中，相比于未發(fā)生結(jié)直腸癌的小鼠，普氏菌屬（圖3A)、擬桿菌屬（圖3B）的相對豐度明顯升高、布氏菌屬（圖3C）明顯減少。而對于未行闌尾切除的小鼠，經(jīng)AOM+DSS 誘導(dǎo)后不管是否發(fā)生結(jié)直腸癌，3 個菌屬豐度差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

圖3 闌尾切除后結(jié)直腸癌誘導(dǎo)小鼠模型糞便中普氏菌屬、擬桿菌屬、布氏菌屬相對豐度

3 討論

近年來，隨著對闌尾功能認(rèn)識的不斷深入，大量研究表明其在腸道免疫和維持腸道菌群的動態(tài)平衡中起重要作用[12]。闌尾作為腸道相關(guān)淋巴組織重要的一部分，對腸道疾病以及腸外疾病的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸具有一定的影響[13]。目前，越來越多的研究表明闌尾切除會增加術(shù)后罹患結(jié)直腸癌的風(fēng)險[14]，本研究目的在于進(jìn)一步探究闌尾切除與結(jié)直腸癌預(yù)后之間的關(guān)系以及可能潛在的機(jī)制。

本研究回顧性分析了763 例結(jié)直腸癌患者的（闌尾切除組89 例，非闌尾切除組674 例）預(yù)后情況，發(fā)現(xiàn)既往切除闌尾的結(jié)直腸癌患者較無闌尾切除史的結(jié)直腸癌患者，死亡風(fēng)險比更高，同時，闌尾切除是影響結(jié)直腸癌預(yù)后的獨立危險因素。本課題組通過建立小鼠闌尾切除模型，進(jìn)行AOM+DSS 炎癥相關(guān)結(jié)直腸癌誘導(dǎo)后，發(fā)現(xiàn)闌尾切除后發(fā)生結(jié)直腸癌的小鼠相比于闌尾未切除發(fā)生結(jié)直腸癌的小鼠，其糞便中普氏菌屬豐度明顯增加。多項研究表明普氏菌屬與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，其在右半結(jié)腸癌中豐度明顯增高，且與其不良預(yù)后相關(guān)[15]；正常人口腔中也富含普氏菌屬，研究表明來源于口腔中的普氏菌屬在腸道定植增加會引起腸道菌群的紊亂，招募更多的“壞細(xì)菌”富集，在腸黏膜上形成菌斑，引起腸道炎癥，增加結(jié)直腸癌的發(fā)生[16]。

本研究認(rèn)為闌尾-免疫-腸道細(xì)菌三者相互作用，相互影響，在結(jié)直腸癌發(fā)展、預(yù)后中起重要作用。闌尾黏膜層中富含Treg 細(xì)胞、M 細(xì)胞、T 細(xì)胞和B 細(xì)胞[12]，闌尾作用失調(diào)或者完全喪失，使腸道局部免疫監(jiān)視功能減弱，以及腫瘤組織中免疫微環(huán)境改變，相比于無闌尾切除史的同年齡段結(jié)直腸癌患者，闌尾切除的結(jié)直腸癌患者其腸道局部免疫能力較為低下，造成其預(yù)后不良。腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞由不同比例T 淋巴細(xì)胞、B 淋巴細(xì)胞、NK 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞組成。大量研究表明，腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞代表宿主腫瘤免疫防御機(jī)制，其在腫瘤組織中的豐度與癌癥患者的生存率相關(guān)，包括結(jié)直腸癌[17]有研究指出腸道共生微生物可在腸道黏膜定植形成生物膜，其形成需要免疫系統(tǒng)的參與，其中IgA 對微生物在腸黏膜上的定植、調(diào)節(jié)和穩(wěn)態(tài)維持起主要作用[18]；而闌尾是腸道分泌IgA 的主要器官，其功能的缺失會影響腸道黏膜生物膜的形成，進(jìn)而影響腸道菌群以及腫瘤組織中菌群微環(huán)境的結(jié)構(gòu)。而某些腸道細(xì)菌又可以通過調(diào)節(jié)腫瘤免疫微環(huán)境、腫瘤代謝等進(jìn)一步導(dǎo)致腫瘤不良預(yù)后[19]。

本研究表明，闌尾切除1～3年內(nèi)發(fā)生結(jié)直腸癌的患者其死亡風(fēng)險比明顯高于闌尾切除暴露時間>3年的結(jié)直腸癌患者；其可能與腸道相關(guān)淋巴組織代償能力有關(guān)。Masahata 等[20]將無菌小鼠進(jìn)行闌尾切除后發(fā)現(xiàn)其全結(jié)直腸以及糞便中的IgA 分泌細(xì)胞數(shù)量顯著降低，且糞菌發(fā)生變化；將闌尾切除后小鼠常規(guī)飼養(yǎng)8 周后，發(fā)現(xiàn)其大腸孤立淋巴組織數(shù)量變多，體積變大，IgA 分泌細(xì)胞數(shù)量回升，與假手術(shù)組無顯著差異。

根據(jù)初步研究結(jié)果，闌尾切除可能是結(jié)直腸癌不良預(yù)后的獨立危險因素，其潛在機(jī)制可能與闌尾切除可以改變腸道細(xì)菌有關(guān)，但其具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。