范曉麗，夏穗瑞，孫 莉

(桂林醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，廣西 桂林 541199)

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一種常見的神經(jīng)退行性疾病，主要特征表示為行動遲緩、靜息性震顫等運動障礙和非運動障礙[1-2]。PD的發(fā)生受遺傳、環(huán)境等因素影響，發(fā)病機制復(fù)雜，其中線粒體功能障礙在PD發(fā)生中具有重要作用[3]。研究表明，線粒體功能相關(guān)基因Parkin和PINK1的突變與家族性PD有關(guān)[4]。PINK1突變可導(dǎo)致線粒體功能受損，從而引起相關(guān)的神經(jīng)毒性，進而引起細胞凋亡[5]。Wnt信號通路能調(diào)節(jié)細胞周期、生長和增殖[6]，并參與調(diào)控神經(jīng)元的凋亡[7]。Wnt6是經(jīng)典的Wnt信號傳導(dǎo)分子，研究表明Wnt6參與胚胎早期發(fā)育和器官形成[8]，但其對帕金森病的作用尚不清楚。筆者探討Wnt6對帕金森病果蠅的生物學(xué)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

果蠅品系W1118野生型、UAS-Wnt6 OE均購自美國Bloomington果蠅中心；果蠅品系UAS-PINK1B9/FM7-MHC-GAL4為中南大學(xué)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)國家重點實驗室饋贈。

1.2 果蠅構(gòu)建

構(gòu)建MHC-GAL4/UAS系統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因果蠅。正常對照組： 將MHC-GAL4 處女蠅與W1118 雄蠅雜交，收取 F1 代，基因為(W1118/+； MHC-GAL4/+)的目標果蠅。PINK1B9疾病組： 將(UAS-PINK1B9/FM7； MHC-GAL4)的處女蠅與 W1118 雄蠅雜交， 收取 F1代，基因型為(UAS-PINK1B9/y； MHC-GAL4/+)。Wnt6 過表達(Wnt6 overexpression，Wnt6 OE)干預(yù)組： 將(UAS-PINK1B9/ FM7； MHC-GAL4)的處女蠅與UAS-Wnt6 OE 果蠅的雄蠅雜交，收取 F1 代，基因型為(UAS-PINK1B9/y； MHC-GAL4/Wnt6 OE)。

1.3 Real-Time PCR檢測mRNA表達

每組30只轉(zhuǎn)基因目標雄果蠅，第5天取其胸部組織，分別提取總mRNA，逆轉(zhuǎn)錄得cDNA，再以cDNA為模板，使用 7500 Fast Real-Time PCR System( Applied Biosystems) 儀器進行PCR反應(yīng)，檢測基因mRNA表達水平，引物序列如下：18S上游5’-TCTAGC AAT ATG AGA TTG AGC AAT AAG-3’，下游5’-AAT ACA CGT TGA TAC TTT CAT TGT AGC-3’；PINK1上游5’-GTG CCT TCA ATG TGA CTT CT-3’，下游5’-TGC TCT GGA TGT CGT AGT T-3’；Wnt6上游5’-TGC GTT TGC TCA TGG TAA TTG-3’，下游5’-TTG GAT CGA GAA GGA TGT TGG-3’，引物由上海生工生物工程有限公司設(shè)計合成。

1.4 果蠅形態(tài)學(xué)觀察

隨機挑選第5天的雄蠅，每組100只，置于挑蠅板上，CO2麻醉后，每5只裝入1個透明的玻璃管中，視為一個觀察單位，待果蠅1 h后完全蘇醒。觀察每組果蠅翅膀形態(tài)，并計算其異翅率；輕輕敲擊玻璃管壁，觀察果蠅的飛行能力，計數(shù)每管飛行果蠅數(shù)目，計算每組飛行率。重復(fù)至少3次。

1.5 Western blot檢測蛋白表達

隨機挑選第5天雄性目標果蠅，每組30 只，取其胸部，加入RIPA 組織裂解液及蛋白磷酸酶抑制劑，提取總蛋白；經(jīng)聚丙烯酰氨凝膠電泳后轉(zhuǎn)移到 PVDF 膜上，5% 脫脂牛奶封閉；一抗Ndufs3(1∶1 000)、Wnt6(1∶1 000)、 內(nèi)參Tubulin(1∶1 000)孵育，4 ℃過夜；洗滌后，加入相應(yīng)二抗(1∶5 000，中杉金橋)孵育；洗滌后，加化學(xué)發(fā)光試劑(Thermo Fisher 公司)發(fā)光， Image Lab 5.1 顯影；PVDF膜掃描后用Image J 圖像軟件進行蛋白條帶分析。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 PINK1 B9疾病果蠅和UAS-Wnt6 OE果蠅

PINK1B9疾病組，PINK1和Wnt6的mRNA表達水平低于對照組(P<0.05)，見圖1a-b；Wnt6 OE干預(yù)組，Wnt6的mRNA表達水平明顯增高(P<0.05)。UAS-Wnt6 OE果蠅中的Wnt6蛋白表達高于對照組，見圖2a-b。

與正常對照組比較，*P<0.05圖1 PINK1B9疾病組PINK1和Wnt6的mRNA表達

與正常對照組比較，*P<0.05圖2 Wnt6 OE干預(yù)組Wnt6的 mRNA及蛋白表達

2.2 Wnt6對PINK1B9疾病組果蠅表型的影響

與正常對照組果蠅比較，PINK1B9疾病組果蠅出現(xiàn)明顯的翅膀異常：下垂、豎立、殘翅等，異翅率明顯升高、飛行能力減弱(P<0.05)。與PINK1B9疾病組比較，Wnt6 OE干預(yù)組果蠅翅膀異常的表型明顯改善，異翅率降低、飛行率提高(P<0.05)，見圖3a-b。

與正常對照組比較，*P<0.05；與PINK1B9疾病組比較，#P<0.05圖3 果蠅的異翅率和飛行率分析

2.3 Wnt6對PINK1B9疾病組果蠅線粒體復(fù)合物Ⅰ亞基關(guān)鍵蛋白的影響

與正常對照組相比，PINK1B9疾病組中 Ndufs3 蛋白的表達量明顯降低(P<0.05)；與PINK1B9疾病組相比，Wnt6 OE干預(yù)組中Ndufs3蛋白表達水平升高(P<0.05)，見圖4。

與正常對照組比較，*P<0.05；與PINK1B9疾病組比較，#P<0.05圖4 Western blot 法檢測Ndufs3蛋白表達

3 討論

帕金森病(PD)是全球第二大神經(jīng)退行性疾病，但病因及發(fā)病機制等仍不明確，研究表明線粒體功能障礙相關(guān)的神經(jīng)毒性是帕金森病發(fā)病機制之一[9]。線粒體是細胞生命活動中心，它不僅是細胞呼吸鏈和氧化磷酸化的中心，而且是細胞凋亡調(diào)控中心[10]。相關(guān)基因突變對線粒體形態(tài)、功能具有重要影響[11]，如PINK1突變導(dǎo)致線粒體功能障礙、多巴胺能神經(jīng)元變性伴隨著果蠅模型的運動障礙[12]。

Wnt是一個分泌型糖蛋白家族，在細胞增殖、存活、遷移以及細胞的極性和自我更新的調(diào)節(jié)中具有重要作用。研究表明， Wnt信號異常可能是成年人神經(jīng)退行性疾病的病因[13]。Wnt6是Wnt家族成員之一，與其他的Wnt蛋白一樣，Wnt6也具有多種生理功能，如器官生成與胚胎發(fā)育等[8]。近年來Wnt6基因的研究主要集中在腫瘤，如食管癌和骨肉瘤等[14-15]，但在神經(jīng)退行性疾病方面的研究很少。為了明確Wnt6對PINK1突變引起的帕金森病果蠅模型的作用，本研究構(gòu)建了Wnt6過表達的PINK1B9疾病果蠅，觀察其表型的變化。研究發(fā)現(xiàn)Wnt6過表達改善了PINK1B9疾病組果蠅的表型，異翅率降低，飛行運動能力提高。為進一步明確Wnt6過表達對PINK1B9疾病組果蠅的保護作用是否與改善線粒體功能有關(guān)，筆者檢測了各組線粒體ComplexⅠ亞基Ndufs3蛋白的表達水平。結(jié)果表明，Wnt6過表達對PINK1B9疾病組果蠅的保護作用可能與改善線粒體ComplexⅠ的功能有關(guān)。但其涉及的具體機制及相關(guān)的通路尚不清楚，有待進一步探索。

綜上所述，Wnt6過表達能改善PINK1突變果蠅的運動能力，這可能與改善線粒體ComplexⅠ的功能有關(guān)。