周穎，昝珂，鄭成

（1.浙江省食品藥品檢驗(yàn)研究院，國家藥品監(jiān)督管理局中成藥質(zhì)量評價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310052；2.中國食品藥品檢定研究院，北京 100050）

藏藥獨(dú)一味來源于唇形科植物獨(dú)一味Lamiophlomis rotate (Benth) Kudo 的地上干燥部分，主產(chǎn)于西藏、青海、云南西北部、四川西部等地，其藥材來源主要依靠野生資源，屬于一級瀕危藏藥［1-2］。獨(dú)一味具有止血、鎮(zhèn)痛消腫、活血化淤、抗菌消炎、增強(qiáng)免疫力等功效［3］，是我國藏、蒙古等民族常用草藥之一，也是臨床上常用于術(shù)后刀口疼痛、外傷骨折等的重要藏藥。

獨(dú)一味的主要成分有黃酮類、環(huán)烯醚萜類、苯乙醇苷類3 大類，以及苯丙素類等其它成分［4-5］。獨(dú)一味中的黃酮類成分具有一定的抗炎功效［6］，代表物質(zhì)是木犀草苷，具有抗氧化、抗炎活性而成為獨(dú)一味重要的活性成分［7］；山梔苷甲酯、8-O-乙酰山梔苷甲酯是環(huán)烯醚萜類代表性成分，具有鎮(zhèn)痛、抗炎、止血的功效［8-9］；連翹酯苷B、毛蕊花糖苷是苯乙醇苷類物質(zhì)，具有一定的鎮(zhèn)痛活性［10］；綠原酸是苯丙素類物質(zhì)，可減少炎癥因子及自由基生成，進(jìn)一步減輕炎癥反應(yīng)［11］。因此可選擇山梔苷甲酯、綠原酸、8-O-乙酰山梔苷甲酯、連翹酯苷B、毛蕊花糖苷和木犀草苷作為獨(dú)一味主要活性成分的測定指標(biāo)。

獨(dú)一味軟膠囊現(xiàn)執(zhí)行國家食品藥品監(jiān)督管理總局國家藥品標(biāo)準(zhǔn)（YBZ 02122005-2014Z-2），其相關(guān)制劑以總黃酮（以蘆丁計(jì)）的含量為質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，采用紫外-可見分光光度法測定。目前已有文獻(xiàn)采用高效液相色譜（HPLC）法同時(shí)測定獨(dú)一味軟膠囊中的山梔苷甲酯、8-O-乙酰山梔苷甲酯、蘆丁、木犀草苷、毛蕊花糖苷、槲皮素的含量，均采用單一波長檢測模式［12-15］。獨(dú)一味軟膠囊雖然為單方制劑，但其成分相對較為復(fù)雜，在單一波長下難以反映多種成分在最大吸收波長下的特征，因此可采用波長切換技術(shù)測定目標(biāo)成分的含量。目前未見采用HPLC 波長切換技術(shù)同時(shí)測定獨(dú)一味軟膠囊中山梔苷甲酯、綠原酸、8-O-乙酰山梔苷甲酯、連翹酯苷B、毛蕊花糖苷和木犀草苷的含量。筆者利用梯度洗脫、波長切換技術(shù)建立同時(shí)測定山梔苷甲酯、綠原酸、8-O-乙酰山梔苷甲酯、連翹酯苷B、毛蕊花糖苷和木犀草苷含量的HPLC 分析方法，對6 種成分在各自的最大吸收波長下進(jìn)行含量分析，提高了檢測靈敏度，實(shí)現(xiàn)了獨(dú)一味軟膠囊中多指標(biāo)、多成分的質(zhì)量評價(jià)，為獨(dú)一味軟膠囊的質(zhì)量評價(jià)及臨床合理應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

超 高 效 液 相 色 譜 儀：Ultimate3000 型，配Chromeleon 7.2 SR5 色譜工作站、SRD-3600 型真空在線脫氣機(jī)、DGP-360 型雙三元梯度泵、WPS-3000TRS 型自動(dòng)進(jìn)樣儀、TCC-3000R 型柱溫箱、DAD-3000RS 型二極管陣列檢測器、VWD-3400RS型可變波長檢測器，美國Thermo Fisher 公司。

電子天平：XPE-2015 型，感量為0.01 g，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

超聲儀：ELMA SONIC P 型，德國ELMA 公司。

尼龍-66 微孔濾膜：孔徑為0.45 μm，天津市科億隆實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

超 純 水 儀：Milli PAK advantage A10 型，美 國Millipore 公司。

獨(dú)一味軟膠囊：批號分別為20042301、20042502、20042703，購自某藥業(yè)有限公司。

山梔苷甲酯、綠原酸、8-O-乙酰山梔苷甲酯、連翹酯苷B、毛蕊花糖苷、木犀草苷對照品：純度分別為98.3%、96.8%、90.3%、93.5%、94.4%、94.9%，批號分別為111873-201103、111753-201817、111872-201703、111811-201001、111530-201411、111720-201609，均購自中國食品藥品檢定研究院。

甲醇：分析純，北京國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

乙腈：色譜純，美國Merck 公司。

實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 溶液配制

分別精密稱取山梔苷甲酯、綠原酸、8-O-乙酰山梔苷甲酯、連翹酯苷B、毛蕊花糖苷和木犀草苷對照品適量，加甲醇溶解，稀釋，定容，制成山梔苷甲酯、綠原酸、8-O-乙酰山梔苷甲酯、連翹酯苷B、毛蕊花糖苷和木犀草苷儲備液，質(zhì)量濃度分別為307.09、186.34、379.44、280.69、478.04、370.60 μg／mL。

分別精密量取上述儲備液適量，用甲醇稀釋并搖勻，制成山梔苷甲酯、綠原酸、8-O-乙酰山梔苷甲酯、連翹酯苷B、毛蕊花糖苷和木犀草苷混合溶液，質(zhì)量濃度分別為61.42、18.63、18.97、56.14、47.80 、37.60 μg／mL。

1.3 樣品處理

取樣品內(nèi)容物約0.2 g，精密稱定，置于25 mL容量瓶中，加入70%甲醇20 mL，超聲處理(250 W，50 kHz)1 h，放置降溫，用甲醇定容至標(biāo)線，用0.45 μm 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

1.4 色譜條件

色譜柱：Symmetry Shield RP18 柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，美國waters 公司)；流量：1 mL／min；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣體積：10 μL；檢測波長：0～11 min 為235 nm；11～16 min 為330 nm；16～20.5 min 為235 nm；20.5～27.5 min 為330 nm；27.5～55 min 為360 nm。流動(dòng)相：乙腈（A）-0.3%磷酸水溶液（B），梯度洗脫程序列于表1。

表1 梯度洗脫程序

2 結(jié)果與討論

2.1 波長的選擇

通過紫外全波長掃描山梔苷甲酯、綠原酸、8-O-乙酰山梔苷甲酯、連翹酯苷B、毛蕊花糖苷和木犀草苷對照品，得到6 種待測成分的最大吸收波長分別為235、327、235、332、330、355 nm，為保證6 種成分的最高檢測靈敏度，采用波長切換方法進(jìn)行檢測，最終選擇在0～11 min 和16～20.5 min，采用235 nm檢測山梔苷甲酯、8-O-乙酰山梔苷甲酯；在11～16 min 和20.5～27.5 min，采用330 nm 檢測綠原酸、連翹酯苷B、毛蕊花糖苷；在27.5～55 min，采用336 nm 檢測木犀草苷。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

對乙腈-水、乙腈-0.3%磷酸水系統(tǒng)作為流動(dòng)相進(jìn)行考察，結(jié)果表明乙腈-0.3%磷酸水作為流動(dòng)相可使獨(dú)一味軟膠囊中6 種成分較好的分離，峰形尖銳且出峰穩(wěn)定，故選擇乙腈-0.3%磷酸水系統(tǒng)為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，混合溶液色譜圖見圖1，樣品溶液色譜圖見圖2。

圖1 混合溶液色譜圖

圖2 樣品溶液色譜圖

2.3 樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

分別對稱樣量（0.1、0.2、0.5 g）、提取方法（超聲、回流）、提取溶劑（甲醇、70%甲醇）、提取時(shí)間（30、45、60、80 min）進(jìn)行單因素考察。結(jié)果顯示，當(dāng)樣品取樣量為0.1～0.2 g 時(shí)，提取較為完全；加熱回流60 min 與超聲60 min 提取效果相當(dāng)，鑒于超聲方法簡便易操作，故選用超聲作為提取方法；山梔苷甲酯和木犀草苷在甲醇中提取效率相對較低，故選擇70%甲醇作為提取溶劑；超聲60 min 和80 min 提取較為完全，故選擇超聲60 min。綜合上述結(jié)果最終確定了樣品溶液的制備方法：取樣品內(nèi)容物約0.2 g，精密稱定，置于25 mL 容量瓶中，加入70%甲醇20 mL，超聲處理(250 W、50 kHz) 1 h。

2.4 線性關(guān)系

精密吸取混合溶液各2、4、6、8、10、12 μL，按優(yōu)化的色譜條件測定。以待測物的進(jìn)樣量（x）為橫坐標(biāo)，色譜峰面積（y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，計(jì)算得線性范圍、回歸方程和相關(guān)系數(shù)，結(jié)果列于表2。由表2 可知，各化合物的進(jìn)樣量與色譜峰面積線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)不小于0.999 0。

表2 線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)

2.5 精密度試驗(yàn)

取混合溶液連續(xù)進(jìn)樣6 次，每次10 μL，記錄色譜峰面積，計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果列于表3。由表3 可知，山梔苷甲酯、綠原酸、8-O-乙酰山梔苷甲酯、連翹酯苷B、毛蕊花糖苷和木犀草苷色譜峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.21%～0.69%，表明儀器精密度良好。

表3 精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

稱取約0.2 g 獨(dú)一味軟膠囊（批號：20042502），按1.3 平行制備樣品溶液6 份，分別進(jìn)行測定，結(jié)果列于表4。由表4 可知，每克樣品中山梔苷甲酯、綠原酸、8-O-乙酰山梔苷甲酯、連翹酯苷B、毛蕊花糖苷和木犀草苷分別為3.19、0.84、7.89、3.33、2.73、3.44 mg／g，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2.0%、1.6%、1.3%、2.1%、1.7%、2.0% (n=6)，表明提取方法的重復(fù)性良好。

表4 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取供獨(dú)一味軟膠囊（批號：20042502）按照1.3配制成樣品溶液，分別在1、2、4、6、10、15、20、24 h進(jìn)樣，測定各化合物色譜峰面積，計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果表明山梔苷甲酯、綠原酸、8-O-乙酰山梔苷甲酯、連翹酯苷B、毛蕊花糖苷和木犀草苷相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.17%、1.25%、1.04%、1.59%、1.48%和1.13%，結(jié)果列于表5。由表5 可知，樣品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表5 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.8 加標(biāo)回收試驗(yàn)

精密稱取約0.1 g 已知含量的獨(dú)一味軟膠囊樣品（批號：20042502）6 份，分別精密加入山梔苷甲酯、綠原酸、8-O-乙酰山梔苷甲酯、連翹酯苷B、毛蕊花糖苷和木犀草苷儲備液各1、0.5、2、2、1、0.5 mL，按1.3 制備樣品溶液并測定，計(jì)算加標(biāo)回收率，結(jié)果列于表6。由表6 可知，6 種化合物的平均加標(biāo)回收率分別為94.0%～101.1%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.6%～2.0%，說明方法的準(zhǔn)確性良好。

表6 加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

2.9 樣品的測定

取3 批獨(dú)一味軟膠囊，按1.3 方法制備樣品溶液，分別進(jìn)樣20 μL，并按1.4 色譜條件測定，計(jì)算各批樣品中化合物的含量，結(jié)果列于表7。根據(jù)3批樣品測定結(jié)果，每克獨(dú)一味軟膠囊內(nèi)容物中山梔苷甲酯不少于3.0 mg／g，綠原酸不少于0.8 mg／g，8-O-乙酰山梔苷甲酯不少于7.8 mg／g，連翹酯苷B不少于2.4 mg／g，毛蕊花糖苷不少于1.9 mg／g，木犀草苷不少于3.4 mg／g，但各項(xiàng)指標(biāo)的合理限度需要進(jìn)一步積累數(shù)據(jù)進(jìn)行規(guī)范和制定。

表7 3 批樣品含量測定結(jié)果 mg／g

3 結(jié)語

建立了高效液相色譜-波長切換法同時(shí)測定獨(dú)一味軟膠囊中山梔苷甲酯、綠原酸、8-O-乙酰山梔苷甲酯、連翹酯苷B、毛蕊花糖苷和木犀草苷含量的方法，涵蓋多類活性指標(biāo)成分，包括1 種黃酮、2 種環(huán)烯醚萜苷、2 種苯乙醇苷、1 種苯丙素，該方法操作簡單、準(zhǔn)確可靠、專屬性好、精密度高，可為獨(dú)一味軟膠囊的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供參考。