羅 川，馬建江，繆震元，吳岳林 （. 安徽華潤金蟾藥業(yè)股份有限公司，安徽 淮北 5000；. 上海應(yīng)用技術(shù)大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，上海 048；. 海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院，上海 004）

活性天然產(chǎn)物是藥物研發(fā)重要的先導(dǎo)化合物來源之一，基于天然產(chǎn)物已成功開發(fā)出很多臨床治療藥物。從我國傳統(tǒng)中藥中分離有效活性成分，已成為國內(nèi)外發(fā)現(xiàn)先導(dǎo)化合物的一個有效途徑。蟾蜍是我國特有中藥材，具有解毒、消腫、止痛、強心利尿、抗癌等作用[1-3]?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)中藥蟾蜍含有多種抗腫瘤活性成分，其中，主要化學(xué)成分之一的沙蟾毒精（圖1）具有優(yōu)秀的體內(nèi)外抗腫瘤活性，但其心臟毒性使得沙蟾毒精治療窗窄，無法作為抗腫瘤藥物進行后續(xù)開發(fā)[4-7]。早期研究表明，沙蟾毒精的3 位羥基對活性和毒性有較大影響[8]。Deng等對沙蟾毒精的3 位進行了修飾，設(shè)計了一類成纖維細(xì)胞活化蛋白-α 靶向沙蟾毒精前藥衍生物，不僅在體內(nèi)外顯示出優(yōu)異的抗腫瘤活性，而且降低了心臟毒性[9]。果德安等也對沙蟾毒精的3 位羥基進行了結(jié)構(gòu)修飾，設(shè)計得到一類3-氮取代氨基甲酸酯類衍生物，對A549、HCT116、Calu-6、PANC-1、SW620和NSCLC 等6 種細(xì)胞株均顯示出優(yōu)秀的活性，其IC50值在10 nmol/L 以下[10]。因此，筆者設(shè)計3 位酯基取代的沙蟾毒精衍生物，進一步探討沙蟾毒精的構(gòu)效關(guān)系，從中篩選獲得高活性的候選化合物。

1 儀器與試劑

核磁共振儀為Bruker 300 或600 型，TMS 為內(nèi)標(biāo)，CD3OD、DMSO-d6 或者CDCl3為溶劑?；瘜W(xué)位移（δ）和偶合常數(shù)（J）分別以×10-6（ppm）和Hz 為單位。在API-3000LC-MS 型質(zhì)譜儀上完成ESI 質(zhì)譜。TLC 分析所用硅膠板為GF254（青島海洋化工有限公司）。硅膠柱層析采用60G 硅膠（青島海洋化工有限公司）。商品化溶劑皆為市售分析純或化學(xué)純。

2 實驗方法

2.1 化合物2a-2j 的合成方法

圖1 沙蟾毒精及其代表性衍生物的化學(xué)結(jié)構(gòu)

將沙蟾毒精（83 mg, 0.2 mmol）、酸（0.3 mmol）、DMAP（24.4 mg, 0.2 mmol）和5 ml 干燥的二氯甲烷加入到25 ml 燒瓶中，氬氣保護下逐份加入EDCI（115 mg, 0.6 mmol）。室溫反應(yīng)過夜，反應(yīng)完全后蒸去溶劑，殘余物經(jīng)柱色譜純化后得目標(biāo)產(chǎn)物2a-2j (洗脫劑為二氯甲烷∶甲醇=100∶1)。

2a: 白色固體，收率13.9%。1H NMR (500 MHz,CDCl3) δ: 7.68 (d, 1H), 7.36 (s, 1H), 6.28 (d,1H),5.43 (s,1H), 5.18 (d,1H), 4.14 (d, 1H), 4.05 (d, 2H),3.91 (q, 1H), 2.15 (d, 2H), 2.02～2.11 (m, 1H), 1.86(m, 9H), 1.40 (s, 4H), 1.26 (d, 2H), 1.14 (s, 3H), 0.97(s, 3H)。

2b: 白色固體，收率為55.5%。1H NMR: (CDCl3,500 MHz) δ: 7.76 (d, 1H), 7.41 (s, 1H), 6.27 (d, 1H),5.30 (s, 1H), 4.33 (d,1H), 4.11 (d,1H), 3.84 (s, 1H),2.43 (d, 1H), 2.30 (t, 2H), 2.05～2.09 (m, 2H),1.86～1.94 (m, 2H), 1.75～1.80 (m, 5H), 1.63～1.73(m, 4H), 1.45 (d,1H), 1.33～1.44 (m,15H), 1.27 (s,3H), 0.86～0.88 (m, 3H)。

2c: 白色固體，收率15.2%。1H NMR (500 MHz,CDCl3) δ: 7.74 (d, 1H), 7.40 (d, 1H), 6.30 (d, 1H),5.08 (s, 1H), 4.35 (d, 1H), 4.11 (m, 1H), 3.84 (d, 1H),2.45 (d, 1H), 2.08 (s, 3H), 1.65～1.92 (m, 11H),1.46～1.53 (m, 1H), 1.26～1.42 (m, 5H), 1.21 (s,3H), 0.92 (s, 3H)。

2d: 白色固體，收率46.7%。1H NMR: (CDCl3,500MHz) δ: 8.85 (s, 1H), 8.40 (m, 2H), 7.62～7.77(m, 2H), 7.41 (s, 1H), 6.29 (d, 1H), 5.38 (s, 1H), 4.36(m, 1H), 4.13 (d, 1H), 3.86 (d, 1H), 2.56 (d, 1H),1.72～2.24 (m, 11 H), 1.32～1.51 (m, 6H), 1.23(s,3 H), 0.94 (s, 3H)。

2e: 白色固體，收率43.5%。1H NMR (500 MHz,CDCl3) δ: 7.66～7.74 (m, 1H), 7.37 (d, 1H), 7.08～7.20 (m, 3H), 6.27 (t,1H), 5.30 (s, 1H), 4.36～4.26(m, 1H), 4.00～4.15 (m, 2H), 3.81 (m, 1H), 3.56 (d,1H), 2.27～2.41 (m, 3H), 2.04 (m, 2H), 1.80～1.86(m, 3H), 1.70～1.79 (m, 4H), 1.64 (s, 3H), 1.26～1.42 (m, 6H), 1.18 (s, 1H), 1.13 (s, 1H), 1.01 (d, 1H),0.91 (d, 3H)。

2f: 白色固體，收率50.3%。1H NMR (500 MHz,CDCl3) δ: 7.94 (d, 1H), 7.72 (d, 1H), 7.53 (d, 1H),7.40 (s, 1H), 7.32 (d, 1H), 6.29 (d, 1H), 5.36 (s, 1H),5.30 (s, 1H), 4.35 (t, 1H), 4.06～4.16 (m, 1H), 3.85(d, 1H), 2.51 (d, 1H), 1.97～2.13 (m, 3H), 1.74～1.89(m, 8H), 1.45～1.54 (m, 1H), 1.31～1.45 (m, 3H),1.25 (s, 1H), 1.21 (s, 3H), 0.93 (s, 3H)。

2g: 白色固體，收率42.6%。1H NMR (500 MHz,CDCl3) δ: 10.11 (s, 1H), 8.20 (d, 2H), 7.97 (d, 2H),7.72 (d, 1H), 7.40 (s, 1H), 6.29 (d, 1H), 5.37 (s, 1H),5.30 (s, 1H), 4.36 (m, 1H), 4.12 (t, 1H), 3.81～3.93(m, 1H), 2.55 (d, 1H), 2.08 (t, 2H), 1.84～2.00 (m,4H), 1.76～1.84 (m, 5H), 1.61 (s, 3H), 1.38 (d, 3H),1.25 (s, 3H), 0.93 (s, 3H)。

2h: 白色固體，收率12.5%。1H NMR: (CDCl3,500MHz) δ: 7.73 (m, 1H), 7.40 (s, 1H), 6.27 (d, 1H),5.23 (s, 1H), 4.35(q, 2H), 4.36～4.40 (m, 1H), 4.04～4.14 (m, 1H), 2.46 (d, 1H), 1.69～2.26(m, 10H), 1.57(d, 1H), 1.22～1.50 (m, 8H), 1.20 (s, 3H), 0.91 (s,3H)。

2i: 白色固體，收率52.3%。1H NMR (500 MHz,CDCl3) δ: 7.74 (m, 1H), 7.61 (d, 1H), 7.42 (s, 1H),6.79 (s, 2H), 6.38 (d, 1H), 6.32 (d, 1H), 5.32 (s, 1H),5.23 (s, 1H), 4.37 (m, 1H), 4.08～4.19 (m, 1H), (3.92(d, 9H), δ3.87 (d, 1H), 2.51 (d, 1H), 1.84 (m,, 10H),1.40 (t, 3H), 1.28 (s, 3H), 1.25 (s, 3H), 0.95 (s, 3H)。

2j: 白色固體，收率39.2%。1H NMR (500 MHz,CDCl3) δ: 7.84 (d, 1H), 7.74 (m, 1H), 7.50 (t, 1H),7.42 (s, 1H), 7.02 (t, 2H), 6.32 (d, 1H), 5.35 (s, 1H),4.37 (m, 1H), 4.18～4.09 (m, 1H), 3.92 (d, 3H), 3.87(d, 1H), 2.52 (d,, 1H), 2.09 (d, 1H), 1.78～2.00 (m,7H), 1.59 (s, 3H), 1.28～1.46 (m, 6H), 1.25 (s, 3H),0.96 (s, 3H)。

2.2 體外抗腫瘤活性測試

選用人乳腺癌細(xì)胞MCF-7、人肝癌細(xì)胞Bel7404 和人腸癌細(xì)胞HCT116，均由海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院凍存和傳代。在37 ℃、5 % CO2條件下，用含有10 %的胎牛血清、1 %的青霉素和鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)細(xì)胞。棄去培養(yǎng)皿中的上層培養(yǎng)基，用PBS 洗細(xì)胞2 次，再加入胰酶，放入培養(yǎng)基中消化1～2 min，待細(xì)胞脫壁后，再加入新的培養(yǎng)基，輕輕吹打，使細(xì)胞完全脫落，待細(xì)胞入5 ml 新的培養(yǎng)基，輕輕吹打，用細(xì)胞計數(shù)法計算細(xì)胞濃度，然后接種于96 孔板中。將接種完的96 孔板放置于37 ℃、5 %的CO2培養(yǎng)箱中孵育過夜，次日細(xì)胞即可貼壁。按照不同的實驗設(shè)計加入不同濃度的藥物，每組設(shè)3～4 個復(fù)孔，每孔加入10 μl 相應(yīng)濃度的藥物，再將96 孔板放入培養(yǎng)箱繼續(xù) 培 養(yǎng)?；?性 測 試 采 用10 % CellTiterTMBlue（Promega, Cat.# G8081/2, US）試劑盒，并在37 ℃、5 % CO2環(huán)境下孵育1 h。用酶標(biāo)儀（Bio Tek, US）測量530/40 nm 和590/35 nm 處熒光值，計算公式：

細(xì)胞存活率 (%) = [(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100%。

圖2 3-沙蟾毒精酯類衍生物2a-2j 的合成路線

其中，As: 實驗組（含有細(xì)胞、熒光試劑和化合物的培養(yǎng)基）；Ac: 對照組（含有細(xì)胞和熒光試劑，不含化合物的培養(yǎng)基）；Ab: 空白組（不含細(xì)胞、化合物的培養(yǎng)基）。

3 結(jié)果與討論

3.1 化學(xué)合成

目標(biāo)化合物通過各類酸和沙蟾毒精發(fā)生酯化反應(yīng)得到，收率為12.5%～55.5%，合成路線見圖2。從反應(yīng)收率上看，芳香族酯類衍生物收率高于脂肪族類酯類衍生物。例如，化合物2c 為乙酸酯衍生物，收率僅為15.2%，而化合物2e 為對甲基芐酯衍生物，收率為43.5%。在反應(yīng)中還發(fā)現(xiàn)，水分對反應(yīng)有較大影響。因此，反應(yīng)溶劑需要干燥處理，并且反應(yīng)體系還需保持在無水條件下，才能保證反應(yīng)順利進行。

3.2 體外抗腫瘤活性研究

課題組選擇3 種腫瘤細(xì)胞株(MCF-7、Bel7404和HCT116)，以沙蟾毒精為陽性對照，采用CellTiter法開展了體外抗腫瘤活性研究，結(jié)果見表1?？梢钥闯觯?-沙蟾毒精酯類衍生物均具有優(yōu)異的體外抗腫瘤活性。對MCF-7 細(xì)胞株，化合物2a、2c 和2j 顯示出高于陽性對照藥沙蟾毒精的活性。對Bel7404 細(xì)胞株，所有化合物均顯示出優(yōu)異的活性，其中，化合物2a、2b、2d 和2e 活性最好，其IC50值均在數(shù)個納摩爾，相比沙蟾毒精提高近1000 倍。對HCT116 細(xì)胞株，化合物2e 活性最高，其IC50值為4.5 nmol/L，相比沙蟾毒精提高了3.7 倍，化合物2b 和2c 與陽性藥相當(dāng)。

表1 沙蟾毒精及其酯類衍生物2a-2j 的體外抗增殖活性(μmol/L)

整體而言，脂肪族酯類化合物活性高于芳香族酯類化合物，例如對MCF-7 細(xì)胞株，溴乙酸酯衍生物2a 的IC50值為91.7 nmol/L，而芳香族酯類化合物除2j 外，活性均在100 nmol/L 以上。

4 結(jié)論

基于活性天然產(chǎn)物沙蟾毒精骨架，在其3 位引入酯基基團，設(shè)計合成出10 個3-沙蟾毒精酯類衍生物。體外抗腫瘤活性研究發(fā)現(xiàn)，所有的化合物對3 種腫瘤細(xì)胞株MCF-7、Bel7404 和HCT116 均顯示出優(yōu)異的抗腫瘤活性。其中，化合物2a 活性最好，對3 種腫瘤細(xì)胞株的IC50值均在100 nmol/L以下，可作為抗腫瘤候選化合物進行進一步研究。