李四維 林丹櫻 鄒小慧 張煒陳丹妮 于斌? 屈軍樂(lè)?

1) (深圳大學(xué)物理與光電工程學(xué)院,光電子器件與系統(tǒng)教育部/廣東省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,深圳 518060)

2) (廣東省科學(xué)院航空裝備研究所,珠海 519000)

在傳統(tǒng)共聚焦顯微技術(shù)的基礎(chǔ)上,圖像掃描顯微技術(shù)使用面陣探測(cè)器來(lái)代替單點(diǎn)探測(cè)器,結(jié)合虛擬數(shù)字針孔并利用像素重定位和解卷積圖像重構(gòu)算法將傳統(tǒng)寬場(chǎng)顯微鏡的分辨率提高一倍,實(shí)現(xiàn)了高信噪比的超分辨共焦成像.但是,由于采用逐點(diǎn)掃描的方式,三維成像速度相對(duì)較慢,限制了其在活體樣品成像中的應(yīng)用.為了進(jìn)一步提高圖像掃描顯微術(shù)的成像速度,本文提出了一種基于雙螺旋點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)工程的多焦點(diǎn)圖像掃描顯微成像方法和系統(tǒng).在照明光路中,利用高速數(shù)字微鏡器件產(chǎn)生周期分布的聚焦點(diǎn)陣對(duì)樣品進(jìn)行并行激發(fā)和快速二維掃描; 在探測(cè)光路中,利用雙螺旋相位片將激發(fā)點(diǎn)熒光信號(hào)的強(qiáng)度分布轉(zhuǎn)換為雙螺旋的形式;最終,利用后期數(shù)字重聚焦處理,從單次樣品掃描數(shù)據(jù)中重構(gòu)出多個(gè)樣品層的超分辨寬場(chǎng)圖像.在此基礎(chǔ)上,利用搭建的系統(tǒng)分別對(duì)纖維狀肌動(dòng)蛋白和海拉細(xì)胞線粒體進(jìn)行成像實(shí)驗(yàn),證明了該方法的超分辨能力和快速三維成像能力.

1 引 言

激光掃描共聚焦顯微 (confocal laser scanning microscopy,CLSM)技術(shù)[1?3]具有良好的成像分辨率和層析能力,被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)研究.在傳統(tǒng)的CLSM 系統(tǒng)中,利用單個(gè)衍射受限的聚焦點(diǎn)對(duì)樣品進(jìn)行二維掃描,并在探測(cè)光路中放置針孔來(lái)阻擋來(lái)自樣品離焦位置的熒光信號(hào).雖然選用尺寸極小的針孔可以有效地提高CLSM 的成像分辨率,但同時(shí)也會(huì)阻擋大部分熒光信號(hào),造成圖像信噪比(signal-to-noise ratio,SNR)大幅下降.因此,在實(shí)際應(yīng)用中,針孔尺寸通常選擇為一個(gè)艾里斑的大小,通過(guò)犧牲分辨率來(lái)確保系統(tǒng)的最佳SNR.為了解決這一問(wèn)題,Sheppard[4]于1988 年提出了像素重定位理論,利用面陣探測(cè)器代替CLSM 中的單像素探測(cè)器,通過(guò)后期像素重定位的數(shù)據(jù)處理來(lái)獲得高SNR 的超分辨圖像.但受限于當(dāng)時(shí)的硬件技術(shù),直到20 多年后該理論才被Müller 和Enderlein[5]實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,并將該技術(shù)命名為圖像掃描顯微(image scanning microscopy,ISM)技術(shù)[6?8],其在保持高SNR 的同時(shí)將成像分辨率提升至寬場(chǎng)照明成像的2 倍.Jesacher 等[9]和Roider 等[10]將雙螺旋點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)(double-helix point spread function,DH-PSF)工程技術(shù)與ISM 結(jié)合,提出了一種基于螺旋相位工程的數(shù)字重聚焦掃描顯微(refocusing after scanning using helical phase engineering,RESCH)技術(shù),其在探測(cè)光路中引入DH-PSF 相位片,將樣品發(fā)射的高斯熒光點(diǎn)轉(zhuǎn)換成雙螺旋的形式; 在此基礎(chǔ)上,利用DH-PSF 的軸向定位特性和后期數(shù)字重聚焦處理方法,RESCH 能夠從單次二維掃描的數(shù)據(jù)中獲得軸向400 nm 范圍內(nèi)樣品不同層的結(jié)構(gòu)信息,大幅提升了ISM 的三維成像速度.隨后,該研究組對(duì)RESCH 進(jìn)行了改進(jìn),將PSF工程同時(shí)應(yīng)用于照明和探測(cè)光路,提出了一種工程化的ISM (engineered ISM)[11],該方法將RESCH的軸向探測(cè)范圍擴(kuò)展到2 μm,進(jìn)一步減少了ISM的三維成像所需要的時(shí)間.雖然這些方法能夠有效提高ISM 的三維掃描成像速度,但受到電荷耦合器件(CCD)像素信號(hào)讀取時(shí)間和單聚焦點(diǎn)激發(fā)模式的限制,其對(duì)尺寸為8 μm×8 μm 樣品區(qū)域的成像時(shí)間約為1 min,遠(yuǎn)不能滿(mǎn)足活體細(xì)胞的動(dòng)態(tài)觀測(cè).2017 年,Wang 等[12]將螺旋相位工程應(yīng)用于傳統(tǒng)的寬場(chǎng)照明顯微系統(tǒng)中,提出了一種三維寬場(chǎng)熒光成像顯微技術(shù),該技術(shù)僅需要單次相機(jī)曝光即可獲得一定軸向范圍內(nèi)的樣品結(jié)構(gòu)信息,雖然具有較高的時(shí)間分辨率,但是由于成像分辨率和層析能力較差,僅適用于稀疏結(jié)構(gòu)的薄生物樣品成像.2018 年,本課題組[13]將螺旋相位工程與多焦點(diǎn)結(jié)構(gòu)光顯微(multifocal structured illumination microscopy,MSIM)技術(shù)[14]相結(jié)合,提出了一種快速三維超分辨顯微方法,命名為MSIMH (MSIM with helical phase engineering),該技術(shù)利用DH-PSF的軸向深度編碼特性、反卷積和像素重定位算法,實(shí)現(xiàn)了無(wú)需軸向掃描即可快速獲取焦深范圍內(nèi)樣品結(jié)構(gòu)的超分辨三維圖像,但是由于軸向重疊部分的樣品信息會(huì)在重構(gòu)中丟失,因此,該重構(gòu)方法無(wú)法適用于結(jié)構(gòu)較為密集的生物樣品成像,需要進(jìn)一步發(fā)展新的超分辨重構(gòu)算法來(lái)擴(kuò)展MSIMH 的應(yīng)用場(chǎng)景.

為了解決上述問(wèn)題,在RESCH 和MSIMH 的基礎(chǔ)上,本文提出一種基于多焦點(diǎn)結(jié)構(gòu)光照明的RESCH,命名為MRESCH,該技術(shù)在RESCH的照明光路中引入了數(shù)字微鏡器件(digital micromirror device,DMD),能夠?qū)悠访嫔系墓鈴?qiáng)進(jìn)行調(diào)制,產(chǎn)生周期分布的聚焦點(diǎn)陣,實(shí)現(xiàn)樣品不同位置的同時(shí)激發(fā),大幅提高了系統(tǒng)的成像速度.在探測(cè)光路中,雙螺旋相位工程的引入將標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)轉(zhuǎn)換為雙螺旋的形式,并且結(jié)合后期的數(shù)字重聚焦處理,從單次二維掃描圖像堆棧中重構(gòu)出樣品在不同軸向位置的結(jié)構(gòu)信息,大幅減少三維測(cè)量的時(shí)間.最終,使用搭建的MRESCH 系統(tǒng)對(duì)纖維狀肌動(dòng)蛋白和海拉細(xì)胞的線粒體進(jìn)行成像實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證了方法的可行性和成像效果.

2 MRESCH 的基本原理

2.1 MRESCH 的光路設(shè)計(jì)

MRESCH 的光路示意圖如圖1(a)所示,在照明光路中,波長(zhǎng)為488 nm 的激光經(jīng)4f 系統(tǒng)準(zhǔn)直擴(kuò)束后直接照射到DMD 面板上,其入射角與DMD 面板呈24°; 接著,激光經(jīng)DMD 調(diào)制后進(jìn)入后續(xù)的4f 系統(tǒng),其傅里葉面位置上的光闌可以有效阻止多余衍射級(jí)的光進(jìn)入顯微系統(tǒng).最后,4f 后焦面位置形成的聚焦點(diǎn)陣經(jīng)過(guò)管鏡和物鏡縮小后重新聚焦到樣品面上,尺寸為原來(lái)的1/90.本文實(shí)驗(yàn)中所使用的DMD 面板的像素個(gè)數(shù)為1024 ×768,像素尺寸為10.8 μm×10.8 μm,對(duì)應(yīng)到樣品面上的尺寸為120 nm×120 nm.在探測(cè)光路中,樣品發(fā)出的熒光經(jīng)物鏡(尼康,60×,NA = 1.27水鏡)和管鏡收集后,然后通過(guò)具有雙螺旋相位片的4f 系統(tǒng),最后成像在科學(xué)級(jí)互補(bǔ)金屬氧化物半導(dǎo)體探測(cè)器(sCMOS,濱松,ORCA Flash 4.0 V2)上.其中,雙螺旋相位片放置在4f 系統(tǒng)的傅里葉面位置,與物鏡的后焦面呈共軛關(guān)系,雙螺旋相位片能夠?qū)μ綔y(cè)系統(tǒng)的傳遞函數(shù)進(jìn)行調(diào)制,將標(biāo)準(zhǔn)PSF 轉(zhuǎn)換為DH-PSF 的形式.DH-PSF 是一種特殊的三維點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù),常用于細(xì)胞內(nèi)分子的三維定位和成像[15?18],當(dāng)分子的軸向位置發(fā)生改變時(shí),DH-PSF 的兩個(gè)旁瓣會(huì)圍繞著光軸進(jìn)行旋轉(zhuǎn),如圖1(b)所示,因此,可以通過(guò)兩個(gè)旁瓣之間的相對(duì)旋轉(zhuǎn)角度來(lái)精確確定分子的軸向位置.目前,DHPSF 相位片的設(shè)計(jì)有多種方法[19?22],本文根據(jù)文獻(xiàn)[19]中的方法進(jìn)行設(shè)計(jì),并利用熒光珠樣品來(lái)標(biāo)定DH-PSF 旋轉(zhuǎn)角度θ與樣品激發(fā)位置z的線性關(guān)系k,如圖1(c)所示,經(jīng)計(jì)算DH-PSF 旋轉(zhuǎn)180°對(duì)應(yīng)樣品的軸向位移Δz約為5.5 μm.

2.2 MRESCH 的成像原理

在MRESCH 系統(tǒng)中,將特定的投影模式(見(jiàn)圖2(a))載入DMD 來(lái)產(chǎn)生周期分布的聚焦點(diǎn)陣對(duì)樣品進(jìn)行照明激發(fā),在樣品面的強(qiáng)度分布如圖2(b)所示.當(dāng)投影模式切換時(shí),“on”像素的位置將沿紅色軌跡進(jìn)行移動(dòng)(1 pixel/step),實(shí)現(xiàn)樣品的快速掃描.其中單個(gè)激發(fā)熒光點(diǎn)在探測(cè)面上的強(qiáng)度分布可以表示為

其中ρ表示樣品的熒光密度; *表示卷積運(yùn)算;h1,h2分別為激發(fā)與探測(cè)點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù).在MRESCH 系統(tǒng)中,由于雙螺旋相位片的存在,h2由標(biāo)準(zhǔn)PSF變?yōu)镈H-PSF,如圖2(c)所示,其三維強(qiáng)度分布表示為

式中,rot(h,θ)表示將h逆時(shí)針旋轉(zhuǎn)θ角; Δx表示雙螺旋兩個(gè)旁瓣之間的距離;k表示DH-PSF 的旋轉(zhuǎn)角度與樣品離焦距離之間的線性關(guān)系;g表示單個(gè)旁瓣的強(qiáng)度分布,可近似用高斯函數(shù)進(jìn)行表示:

圖1 (a) MRESCH 的光路; (b) DH-PSF 在不同軸向位置的強(qiáng)度分布; (c) DH-PSF 旋轉(zhuǎn)角度與對(duì)應(yīng)軸向位置的關(guān)系曲線Fig.1.(a) Optical configuration of MRESCH; (b) intensity distribution of the DH-PSF at different positions along z-axis; (c) relationship between the two lobe rotation angles of the DH-PSF and position of z-axis.

圖2 (a) DMD 上載入的投影模式; (b) 激發(fā)羅丹明染料樣品探測(cè)到的熒光點(diǎn)陣分布; (c) 存在相位片的條件下,激發(fā)羅丹明染料樣品探測(cè)到的雙螺旋熒光點(diǎn)陣分布Fig.2.(a) Project pattern of DMD; (b) the fluorescence image of the excitation foci in a uniform solution of Rhodamine 6G at the sample plane; (c) the fluorescence image of the excitation foci in a uniform solution of Rhodamine 6G at the sample plane with DH phase mask.

其中,σx,σy分別為高斯函數(shù)在x和y方向的標(biāo)準(zhǔn)差,為了方便計(jì)算可將σx,σy看作近似相等.

當(dāng)MRESCH 進(jìn)行三維成像時(shí),樣品不同深度發(fā)射的熒光信號(hào)會(huì)在成像面的不同軸向位置形成多個(gè)聚焦點(diǎn),如圖3 所示.其中,物鏡焦平面上的熒光信號(hào)經(jīng)相位片調(diào)制后在相機(jī)的探測(cè)面上形成一個(gè)水平的雙螺旋點(diǎn),而樣品離焦位置的信號(hào)則在探測(cè)面的對(duì)應(yīng)位置形成具有一定旋轉(zhuǎn)角度的雙螺旋點(diǎn).最終,通過(guò)計(jì)算每個(gè)雙螺旋點(diǎn)的旋轉(zhuǎn)角度來(lái)獲得樣品的三維信息.

圖3 MRESCH 的成像原理(FT,傅里葉變換)Fig.3.Imaging principle of MRESCH (FT,Fourier transform).

2.3 MRESCH 的圖像重構(gòu)過(guò)程

在多數(shù)圖像掃描顯微技術(shù)中,如ISM,MSIM,MSIMH 等,寬場(chǎng)圖像的重構(gòu)是將所有掃描位置的熒光點(diǎn)信號(hào)進(jìn)行數(shù)字處理后線性疊加而成.而MRESCH 的圖像重構(gòu)更加類(lèi)似于傳統(tǒng)的共聚焦顯微成像,即將每個(gè)掃描位置(i,j)的熒光點(diǎn)信號(hào)強(qiáng)度作為重構(gòu)圖像中對(duì)應(yīng)像素位置(i,j)的像素值V(i,j) .由于MRESCH 使用的是面陣探測(cè)器sCMOS,需要通過(guò)后期數(shù)字處理來(lái)實(shí)現(xiàn)上述過(guò)程.另外,由于雙螺旋相位片的引入將原本高斯分布的激發(fā)熒光點(diǎn)轉(zhuǎn)換成雙螺旋的形式,其會(huì)根據(jù)樣品激發(fā)位置的深度z不同而產(chǎn)生相應(yīng)的旋轉(zhuǎn),如圖4(a)所示.基于上述特性,MRESCH 可以利用數(shù)字針孔(digtal pinhole,DP)將不同深度的樣品熒光信息分別篩選出來(lái)進(jìn)行重構(gòu),實(shí)現(xiàn)不同樣品層的超分辨二維成像.具體過(guò)程見(jiàn)圖4(b),首先,需要將圖像數(shù)據(jù)中所有雙螺旋點(diǎn)附近的灰度值按照掃描的順序依次截取出來(lái)構(gòu)成一個(gè)亞圖像堆棧Ri,j(x,y) ;接著,根據(jù)需要重構(gòu)的樣品層深度z生成一個(gè)二值的數(shù)字針孔DP(x,y) ,由兩個(gè)圓形二值矩陣構(gòu)成,兩個(gè)圓心的連線與水平方向的夾角為kz.然后,將DP(x,y)依次附在每個(gè)雙螺旋點(diǎn)上并對(duì)灰度值進(jìn)行求和,獲得像素值V(i,j) ,用公式表示為

圖4 (a) MRESCH 的原始圖像數(shù)據(jù); (b) 附上數(shù)字針孔后的雙螺旋點(diǎn); (c) MRESCH 的圖像重構(gòu)過(guò)程Fig.4.(a) Raw images of MRESCH; (b) the pinholed DH-PSF; (c) principle of MRESCH wide-field image reconstruction.

最后,將每個(gè)像素值V(i,j) 按照掃描順序進(jìn)行排列來(lái)重構(gòu)出樣品結(jié)構(gòu)的寬場(chǎng)圖像,如圖4(c)所示.可以看出,當(dāng)兩個(gè)不同角度的DP1和DP2分別應(yīng)用到同一組MRESCH 數(shù)據(jù)時(shí),同一個(gè)掃描位置的像素值V(i,j) 會(huì)因?yàn)镈P的不同而產(chǎn)生明顯的數(shù)值差異,最終重構(gòu)出兩個(gè)完全不同的寬場(chǎng)圖像,它們分別對(duì)應(yīng)不同深度的樣品結(jié)構(gòu)信息.

3 MRESCH 的生物學(xué)實(shí)驗(yàn)

為了確定MRESCH 的成像分辨率,使用牛肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)樣片(F36924,Thermo Fisher Scientific Inc.,USA)作為測(cè)試樣品.在實(shí)驗(yàn)中,首先對(duì)細(xì)胞中的纖維狀肌動(dòng)蛋白進(jìn)行寬場(chǎng)照明成像,其結(jié)構(gòu)分布如圖5(a)所示,受到背景熒光的影響,蛋白微絲束的周?chē)涑庵罅康脑肼?將一些原本微弱的樣品結(jié)構(gòu)信號(hào)淹沒(méi),造成部分細(xì)節(jié)的丟失和橫向分辨率的下降.接著,利用MRESCH 對(duì)同一區(qū)域進(jìn)行掃描并重構(gòu),結(jié)果如圖5(b)所示.可以看出,數(shù)字針孔的使用有效地將微絲束周?chē)谋尘盁晒鉃V除,大幅提高了圖像的對(duì)比度.為了更好地比較兩種方法,對(duì)圖5(a)和圖5(b)中矩形虛線區(qū)域進(jìn)行放大,如圖5(c)所示,通過(guò)比較發(fā)現(xiàn),MRESCH 能夠?qū)⒃驹趫D5(c)-1 中難以分辨的相鄰微絲束結(jié)構(gòu)區(qū)分開(kāi)來(lái).最后,通過(guò)對(duì)圖5(a)和圖5(b)中劃線位置橫切面強(qiáng)度的半高寬進(jìn)行計(jì)算來(lái)確定MRESCH 的橫向分辨率,其數(shù)值曲線如圖5(d)所示,其中寬場(chǎng)照明成像的橫向分辨率約為374 nm,MRESCH 約為277 nm,結(jié)果表明MRESCH 的橫向分辨率約為寬場(chǎng)照明的1.34 倍,與傳統(tǒng)的共聚焦顯微鏡相近.

接著利用MRESCH 對(duì)海拉細(xì)胞中的線粒體進(jìn)行三維成像,該樣品經(jīng)染料標(biāo)記后,能夠在488 nm的激光照射下發(fā)射高效率的530 nm 綠色熒光信號(hào).在實(shí)驗(yàn)中,首先將樣品固定在三維位移臺(tái)上,并對(duì)線粒體在不同軸向位置(z= 0,± 1000 nm)的結(jié)構(gòu)分布進(jìn)行寬場(chǎng)照明成像,結(jié)果如圖6(a)—(c)所示,可以看出線粒體在整個(gè)細(xì)胞中呈三維的結(jié)構(gòu)分布,其在不同的軸向位置具有不同的結(jié)構(gòu)形態(tài).接著將樣品移回至z= 0 nm 的位置并利用MRESCH 對(duì)樣品進(jìn)行二維掃描,掃描點(diǎn)的橫縱間距分別為30 pixels 和26 pixels,掃描步數(shù)為780 步,每步對(duì)應(yīng)的相機(jī)曝光時(shí)間為8 ms,成像總時(shí)間約6 s.最后根據(jù)2.3 節(jié)所述的數(shù)據(jù)處理方法,利用不同角度的數(shù)字針孔對(duì)不同深度的樣品信息進(jìn)行重構(gòu),結(jié)果如圖6(d)—(f),可以看出重構(gòu)的線粒體結(jié)構(gòu)相比于寬場(chǎng)照明更加銳利.另外,傳統(tǒng)的寬場(chǎng)照明成像只能夠獲得位于物鏡焦面附近的樣品結(jié)構(gòu)信息,其他軸向位置的線粒體結(jié)構(gòu)在探測(cè)面上會(huì)變得模糊而無(wú)法分辨,如果想要獲得離焦區(qū)域的結(jié)構(gòu)信息,需要將物鏡重新對(duì)焦到離焦面或者利用位移臺(tái)把樣品沿軸向位置移動(dòng)一定距離,這些過(guò)程都會(huì)花費(fèi)大量的成像時(shí)間.對(duì)于MRESCH 而言,基于雙螺旋點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的特點(diǎn),可以通過(guò)單次掃描和后期數(shù)據(jù)處理來(lái)獲得樣品在一定軸向范圍內(nèi)的三維空間結(jié)構(gòu),大幅提高數(shù)據(jù)采集效率.

圖5 寬場(chǎng)照明和MRESCH 對(duì)纖維狀肌動(dòng)蛋白的成像結(jié)果比較 (a) 纖維狀肌動(dòng)蛋白的寬場(chǎng)照明成像結(jié)果; (b) MRESCH 的成像結(jié)果; (c) 圖(a)和圖(b)中白色方塊區(qū)域的放大; (d)圖(a)和圖(b)中劃線位置的橫切面強(qiáng)度圖(半高寬分別為: 寬場(chǎng)(WF)照明圖像374 nm、MRESCH 圖像 277 nm)Fig.5.Comparison of F-actin imaging results with wide-field illumination and MRESCH: (a) Wide-field image of F-actin;(b) MRESCH image of F-actin; (c) magnification of white box region in panels (a) and (b); (d) plots of intensity along the colored lines in panels (a) and (b); the FWHM values are 374 nm and 277 nm for wide-field (WF) and MRESCH,respectively.

圖6 寬場(chǎng)照明和MRESCH 對(duì)海拉細(xì)胞線粒體成像結(jié)果比較 (a) 線粒體在z = –1000 nm 位置的寬場(chǎng)成像結(jié)果; (b) 線粒體在z = 0 nm 位置的寬場(chǎng)成像結(jié)果; (c) 線粒體在z = 1000 nm 位置的寬場(chǎng)成像結(jié)果; (d) 線粒體在z = –1000 nm 位 置 的MRESCH 成像結(jié)果; (e) 線粒體在z = 0 nm 位置的MRESCH 成像結(jié)果; (f) 線粒體在z = 1000 nm 位置的MRESCH 成像結(jié)果Fig.6.Comparison of mitochondrial imaging results of HeLa cells with wide-field illumination and MRESCH: (a) Wide-field image of mitochondria at z = –1000 nm; (b) wide-field image of mitochondrion at z = 0 nm; (c) wide-field image of mitochondria at z =1000 nm; (d) image obtained via MRESCH at z = –1000 nm; (e) image obtained via MRESCH at z = 0 nm; (f) image obtained via MRESCH at z = 1000 nm.

4 總 結(jié)

本文基于雙螺旋點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)工程,提出了一種多焦點(diǎn)圖像掃描顯微技術(shù).該方法將傳統(tǒng)的多焦點(diǎn)結(jié)構(gòu)光照明顯微技術(shù)與雙螺旋點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)工程相結(jié)合,通過(guò)后期的數(shù)據(jù)處理,能夠從單次二維掃描的信息中重構(gòu)出不同深度的樣品信息,大幅減少了三維成像所需要的二維掃描次數(shù),提高樣品采集的速度并減少了光毒性,對(duì)于生命科學(xué)的研究具有重要的意義.