張磊,劉杰,張英,王芳,李長(zhǎng)雷,劉驥才,劉小亞,付艾妮,游俊,朱書秀

(1.江漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院,武漢 430056;2.湖北省婦幼保健院,武漢 430070)

正常子宮內(nèi)膜僅在一個(gè)極短的時(shí)期內(nèi)允許胚胎著床,即“種植窗期”,一般在排卵后6～9 d開(kāi)放,持續(xù)1～2 d[1]。在體外受精-胚胎移植(in vitro fertilization and embryo transfer, IVF-ET)治療不孕癥時(shí),控制性超排卵(controlled ovarian hyperstimulation, COH)可獲取多個(gè)卵泡,同時(shí)也出現(xiàn)了高雌激素和高孕激素現(xiàn)象[2],導(dǎo)致子宮內(nèi)膜提早發(fā)育成熟,卵子與子宮內(nèi)膜發(fā)育不同步,出現(xiàn)妊娠率低下。子宮內(nèi)膜同源盒基因 A10(HOXA10)對(duì)子宮內(nèi)膜的發(fā)育進(jìn)行著精密的時(shí)空調(diào)節(jié)[3],在細(xì)胞增殖和胚胎著床方面起著重要作用。針灸治療不孕癥歷史悠久,大量臨床報(bào)道也證實(shí)了針灸治療對(duì)不孕癥有理想療效[4-5]。近年來(lái),國(guó)內(nèi)外開(kāi)展了大量研究,綜合其作用機(jī)制為調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-卵巢軸的功能[6],改善卵巢血供及促進(jìn)卵子的成熟、排出[7-8],改善子宮內(nèi)膜容受性[9-10],調(diào)節(jié)血清雌孕激素水平[11]。本研究通過(guò)觀察不同妊娠天數(shù)小鼠子宮內(nèi)膜的HOXA10、整合素avβ3及白血病抑制因子(LIF)蛋白及 mRNA的表達(dá)變化,來(lái)探討電針提高IVF-ET臨床妊娠率的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

昆明純種性成熟小鼠,SPF級(jí),8周齡,體質(zhì)量30～35 g,其中雌鼠150只,雄鼠80只(用于交配),由武漢春玉紅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼料有限公司提供(動(dòng)物合格證號(hào)42000600023408)。將小鼠置于室溫18℃～22℃、相對(duì)濕度60%～80%的環(huán)境中,自由攝食、飲水。取50只雌鼠為自然周期組,剩余100只雌鼠制備COH模型并隨機(jī)分為COH組(50只)和電針組(50只)。各組內(nèi)再根據(jù)妊娠天數(shù)分為 D2、D3、D4、D5和 D6小組,每小組10只。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)動(dòng)物的處置符合2006年科技部發(fā)布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》的規(guī)定[12]。

1.2 主要試劑與儀器

曲普瑞林(法國(guó)益普生生物制藥有限公司);孕馬血清促性腺激素(寧波三生藥業(yè)有限公司);絨促性素(HCG,麗珠集團(tuán)麗珠制藥廠);Trizol(美國(guó) Ambion公司);cDNA第一鏈合成試劑盒(立陶宛 Fermentas公司);HOXA10抗體(美國(guó)GeneTex公司);整合素αvβ3抗體(美國(guó) Abcam公司);LIF抗體(中國(guó)臺(tái)灣 Origo公司);Western-blot主要試劑購(gòu)自碧云天公司。PCR儀(東勝創(chuàng)新生物科技有限公司,EDC-810);熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI公司,QuantStudio 6);酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo公司,mμlISKANMK3);水平電泳儀(北京君意東方電泳設(shè)備有限公司,JY300);韓氏電針儀(HANS-100A,南京濟(jì)生醫(yī)療科技有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 模型制備方法

采用控制性超促排長(zhǎng)方案制備COH小鼠模型[13]。每天上午腹腔內(nèi)注射曲普瑞林(每 100 g體質(zhì)量注射0.4 μg),連續(xù)9 d;第9天同時(shí)注射孕馬血清促性腺激素(每100 g體質(zhì)量注射40 U)1次,進(jìn)行Gn啟動(dòng);48 h后注射人絨毛膜促性腺激素(HCG,每100 g體質(zhì)量注射100 U),與雄鼠合籠。

1.3.2 電針干預(yù)

取關(guān)元、中極和三陰交(雙),采用0.16 mm×7 mm美容針灸針,進(jìn)針深度2 mm,關(guān)元和中極分別接韓氏電針儀兩極。連續(xù)波,頻率2 Hz,強(qiáng)度1 mA,留針15 min。于HCG注射日開(kāi)始治療,至取材日停止。僅電針組行電針干預(yù),自然周期組和COH組小鼠不行電針治療。

1.3.3 胚胎著床的觀察與計(jì)數(shù)

取各組 D6小組,尾靜脈注射 0.3 mL 0.5%臺(tái)盼藍(lán),5 min后頸椎脫臼處死。用75%乙醇消毒腹部皮膚,打開(kāi)腹腔,暴露雙側(cè)子宮,被臺(tái)盼藍(lán)染為藍(lán)色即為小鼠胚胎的著床位點(diǎn)。計(jì)算小鼠妊娠率和平均著床位點(diǎn)數(shù)。妊娠率=(孕鼠數(shù)/總動(dòng)物數(shù))×100%。平均著床位點(diǎn)數(shù)=(總著床位點(diǎn)數(shù)/妊娠鼠數(shù))×100%。

1.3.4 子宮內(nèi)膜HOXA10、整合素αvβ3和LIF蛋白表達(dá)

取各組D2、D3、D4、D5小組小鼠子宮內(nèi)膜組織,用Western blot技術(shù)檢測(cè)子宮內(nèi)膜HOXA10、整合素αvβ3和LIF的蛋白表達(dá)。電動(dòng)勻漿器勻漿,采用細(xì)胞裂解液提取總蛋白,經(jīng) SDS-PAGE電泳分離蛋白,濕轉(zhuǎn)法將目的蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜上,一抗、二抗依次孵育。通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)觀察拍照。運(yùn)用Image-J圖像分析軟件分析,采用目的蛋白與內(nèi)參的比值比較各組蛋白表達(dá)水平。

1.3.5 子宮內(nèi)膜 HOXA10、整合素αvβ3和 LIF mRNA的表達(dá)

取各組D2、D3、D4、D5小組的小鼠子宮,縱行剖開(kāi)子宮,剝離子宮內(nèi)膜,剔除囊胚,用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)子宮內(nèi)膜HOXA10、整合素αvβ3和LIF mRNA的表達(dá)。采用Trizol提取組織內(nèi)的RNA,并根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,反應(yīng)條件為25℃下5 min、50℃下15 min、85℃下5 min和4℃下10 min。獲得第一鏈cDNA后,以GAPDH為內(nèi)參,實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)檢測(cè)HOXA10、整合素αvβ3、LIF的mRNA表達(dá)量變化,引物序列見(jiàn)表1。反應(yīng)條件為50℃下2 min、95℃下10 min、95℃下30 s和60℃下30 s,40個(gè)循環(huán)。熒光定量分析軟件自動(dòng)繪制擴(kuò)增動(dòng)力曲線和溶解曲線。基因相對(duì)表達(dá)量采用2﹣△△CT的方法進(jìn)行分析。

表1 引物序列

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料比較采用卡方檢驗(yàn)。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組內(nèi)各小組之間比較采用單因素方差分析,進(jìn)一步通過(guò)Tukey和SNK檢測(cè)的方法分析兩組之間的差異。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠妊娠率及著床位點(diǎn)數(shù)

經(jīng)控制性超排卵后,COH組妊娠率低于自然周期組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),且平均著床位點(diǎn)數(shù)顯著高于自然周期組(P＜0.01)。電針治療后,電針組妊娠率與COH組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),但呈現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì);平均著床位點(diǎn)數(shù)比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。詳見(jiàn)表2。

表2 各組小鼠妊娠率及著床位點(diǎn)數(shù)

2.2 子宮內(nèi)膜HOXA10、整合素αvβ3和LIF蛋白表達(dá)

自然周期組中,D4小組 HOXA10、整合素αvβ3和LIF蛋白表達(dá)最高,與D2、D3、D5小組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01),結(jié)果見(jiàn)圖1。COH組中,D3小組表達(dá)最強(qiáng),與D2、D4、D5小組比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05,P＜0.01),結(jié)果見(jiàn)圖2。電針組中,D4小組達(dá)到峰值,與D2、D3、D5小組比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05,P＜0.01),結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖1 自然周期組小鼠子宮內(nèi)膜HOXA10、整合素αvβ3和LIF蛋白表達(dá)

圖2 COH組小鼠子宮內(nèi)膜HOXA10、整合素αvβ3和LIF蛋白表達(dá)

圖3 電針組小鼠子宮內(nèi)膜HOXA10、整合素αvβ3和LIF蛋白表達(dá)

2.3 子宮內(nèi)膜HOXA10、整合素αvβ3和LIF mRNA表達(dá)

2.3.1 各組不同妊娠天數(shù)小鼠子宮內(nèi)膜HOXA10 mRNA表達(dá)情況

自然周期組中D4小組HOXA10 mRNA表達(dá)最高,與D2、D3、D5小組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);COH組中D3小組HOXA10 mRNA表達(dá)最強(qiáng),與D2、D5小組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);電針組中 D4小組HOXA10 mRNA表達(dá)最高,與D2、D5小組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05,P＜0.01),與 D3小組比較表達(dá)增加,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。詳見(jiàn)表3。

表3 各組不同妊娠天數(shù)小鼠子宮內(nèi)膜HOXA10 mRNA表達(dá)情況 (±s)

表3 各組不同妊娠天數(shù)小鼠子宮內(nèi)膜HOXA10 mRNA表達(dá)情況 (±s)

注:與同組D4小組比較1)P＜0.01,2)P＜0.05;與同組D3小組比較3)P＜0.01

組別 D2 D3自然周期組 1.000±0.0001) 1.741±0.2231)COH 組 0.974±0.4543) 2.275±0.256電針組 0.995±0.2171) 1.734±0.066 D4 D5 2.248±0.265 1.722±0.1771)1.693±0.222 1.212±0.2523)1.902±0.234 1.457±0.1092)

2.3.2 各組不同妊娠天數(shù)小鼠子宮內(nèi)膜整合素αvβ3 mRNA表達(dá)情況

自然周期組中D4小組整合素αvβ3 mRNA表達(dá)最高,分別與D2、D3和D5小組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05,P＜0.01);COH組中D3小組整合素αvβ3 mRNA表達(dá)最強(qiáng),分別與D2和D5小組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);電針組中整合素αvβ3 mRNA表達(dá)最高為D4小組,分別與D2和D5小組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),與D3小組比較表達(dá)增加,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。詳見(jiàn)表4。

表4 各組不同天數(shù)孕鼠子宮內(nèi)膜整合素αvβ3 mRNA表達(dá) (±s)

表4 各組不同天數(shù)孕鼠子宮內(nèi)膜整合素αvβ3 mRNA表達(dá) (±s)

注:與同組D4小組比較1)P＜0.01,2)P＜0.05;與同組D3小組比較3)P＜0.01

組別 D2 D3自然周期組 1.000±0.0001) 1.396±0.4251)COH 組 0.965±0.6013) 2.140±0.658電針組 0.957±0.2642) 1.621±0.347 D4 D5 2.154±0.242 1.475±0.2562)1.608±0.381 1.133±0.3553)1.937±0.356 1.306±0.3072)

2.3.3 各組不同妊娠天數(shù)小鼠子宮內(nèi)膜LIF mRNA表達(dá)情況

自然周期組中,D4小組LIF mRNA表達(dá)最高,分別與 D2、D3和 D5小組比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);COH組中,D3小組LIF mRNA表達(dá)最強(qiáng),分別與D2、D4和 D5小組比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05,P＜0.01);電針組中,D4小組LIF mRNA表達(dá)最高,分別與 D2和 D5小組比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05,P＜0.01),與 D3小組比較,表達(dá)增加,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。詳見(jiàn)表5。

表5 各組不同天數(shù)孕鼠子宮內(nèi)膜LIF mRNA表達(dá) (±s)

表5 各組不同天數(shù)孕鼠子宮內(nèi)膜LIF mRNA表達(dá) (±s)

注:與同組D4小組比較1)P＜0.01,2)P＜0.05;與同組D3小組比較3)P＜0.01,4)P＜0.05

組別 D2 D3自然周期組 1.000±0.0001) 1.590±0.2441)COH 組 0.810±0.4873) 2.357±0.175電針組 0.896±0.2481) 1.839±0.236 D4 D5 2.470±0.401 1.608±0.151)1.649±0.2384) 1.068±0.1563)2.066±0.361 1.412±0.0412)

3 討論

LIF是白細(xì)胞介素-6家族中的細(xì)胞因子之一,在胚胎著床中發(fā)揮重要作用。種植窗期,子宮內(nèi)膜分泌LIF,與囊胚表達(dá)的 LIF受體結(jié)合,促進(jìn)囊胚植入子宮內(nèi)膜[14]。整合素αvβ3可參與滋養(yǎng)細(xì)胞的黏附,在子宮內(nèi)膜細(xì)胞和滋養(yǎng)層細(xì)胞上呈現(xiàn)周期特異性表達(dá),其表達(dá)高峰與“種植窗期”吻合[15]。因此,與LIF、胞飲突等均為評(píng)估種植窗期的重要指標(biāo)[16]。

本研究發(fā)現(xiàn),自然周期組子宮內(nèi)膜整合素αvβ3和LIF在見(jiàn)陰栓后第4天達(dá)到峰值,說(shuō)明受孕后第4天為小鼠種植窗期,COH組中,作為評(píng)估種植窗期的重要指標(biāo)的整合素αvβ3和LIF在受孕后第3天表達(dá)最高,表明子宮內(nèi)膜發(fā)育提前,同時(shí)觀察到臨床妊娠率下降,說(shuō)明超排卵藥物改變子宮內(nèi)膜的發(fā)育進(jìn)程,種植窗期提前開(kāi)放,受精卵與子宮內(nèi)膜發(fā)育不同步,是 IVF-ET臨床妊娠率低的原因。

中醫(yī)學(xué)雖無(wú)“種植窗”的概念,但古代文獻(xiàn)對(duì)其相關(guān)內(nèi)容進(jìn)行了一定描述。如張景岳曾提出:“此言婦人經(jīng)期方止。其時(shí)子宮正開(kāi),便是布種之時(shí),過(guò)此佳期,則子宮閉而不受胎矣?！敝嗅t(yī)學(xué)認(rèn)為“腎藏精,主生殖”,《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》中“男女生殖,皆賴腎臟作強(qiáng)”。在 IVF-ET中,超排卵耗傷大量腎陰腎精,導(dǎo)致精血不足,沖任虛衰,胞脈失養(yǎng),而難以攝精成孕。關(guān)元、中極和三陰交為臨床治療不孕癥的常用穴位[17]。三陰交為足三陰經(jīng)交會(huì)穴,可滋補(bǔ)肝腎、調(diào)理沖任;關(guān)元、中極為任脈要穴?！端貑?wèn)》王冰注“沖為血海,任主胞胎,兩者相資,故能有子”。三穴相配,共補(bǔ)腎精、調(diào)沖任。

同源盒基因(HOX)屬于多基因家族的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)基因,從3’到5’端分別有HOXA1～13,與生殖密切相關(guān)的有HOXA9、10、11和13。HOXA10是一種多效的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子,在胚胎著床及發(fā)育、細(xì)胞分化與增殖方面具有重要意義[18]。子宮內(nèi)膜HOXA10表達(dá)減少可出現(xiàn)著床失敗和蛻膜化障礙[19]。臨床研究[20]發(fā)現(xiàn),輸卵管性不育和反復(fù)植入失敗的婦女,子宮內(nèi)膜 HOXA10和 HOXA11啟動(dòng)子的甲基化水平表達(dá)異常。動(dòng)物研究[21]顯示,HOXA10突變小鼠子宮內(nèi)膜不能正常植入胚胎,而將HOXA10突變小鼠的胚胎移植到野生型小鼠子宮內(nèi),著床成功,說(shuō)明母體HOXA10的良好表達(dá)是胚胎著床所必須的條件之一。HOXA10的表達(dá)貫穿整個(gè)月經(jīng)周期,并隨月經(jīng)周期呈現(xiàn)周期性改變,在種植窗期,高水平雌激素和孕激素作用下,子宮內(nèi)膜HOXA10表達(dá)呈現(xiàn)高峰狀態(tài)[22-23]。在研究中發(fā)現(xiàn),經(jīng)過(guò)電針治療后,子宮內(nèi)膜整合素αvβ3和LIF在受孕第4天表達(dá)最高,種植窗期恢復(fù)正常。HOXA10的表達(dá)在受孕第4天達(dá)到峰值,較COH組推遲1天,臨床妊娠率呈現(xiàn)上升趨勢(shì),表明電針可能通過(guò)調(diào)控HOXA10的表達(dá)時(shí)相,來(lái)調(diào)節(jié)種植窗期的開(kāi)放與關(guān)閉。

綜上所述,針刺調(diào)控COH小鼠子宮內(nèi)膜HOXA10的表達(dá)時(shí)相,恢復(fù)正常種植窗期,使受精卵與子宮內(nèi)膜發(fā)育同步,是電針提高IVF-ET臨床妊娠率的作用機(jī)制之一,但電針通過(guò)何種途徑來(lái)調(diào)控 HOXA10的表達(dá)時(shí)相,尚需進(jìn)一步研究。