朱志媚，譚李梅，徐 靜，符紅艷，胡 哲，龔 蕾，楊貴兵，王 萍，馬先鋒，鄧子牛

（1 湖南農業(yè)大學園藝園林學院，長沙410128）（2 國家柑橘改良中心長沙分中心）（3 郴州市農業(yè)科學研究所）

柑橘潰瘍病是阻礙柑橘產業(yè)發(fā)展的世界性檢疫病害，是由柑橘黃單胞桿菌柑橘亞種（Xanth-omonas citrisubsp.citri，Xcc）引起的[1]。選育抗病品種是防治潰瘍病的有效途徑，科學家在過去幾十年一直在尋找抗?jié)儾〉母涕倨贩N，但發(fā)現(xiàn)幾乎所有柑橘屬的栽培種接種Xcc 后均表現(xiàn)感病癥狀。對不同柑橘品種的抗?jié)儾∧芰Ψ治霭l(fā)現(xiàn)，橙類、柚類、檸檬等商用品種表現(xiàn)為不同程度的感病[2]，只有金柑屬的種質表現(xiàn)為抗?jié)儾3-5]，故此前的抗?jié)儾∮N多用金柑屬品種作抗性材料進行研究[6-7]。但金柑屬和柑橘屬2 個不同屬的遺傳差異較大，用金柑類抗性資源與柑橘屬品種雜交，很難獲得農藝性狀符合柑橘商品化生產需求的抗性品種，因此柑橘屬品種的抗?jié)儾⊙芯窟M展緩慢。

為尋找柑橘屬的抗性資源，豐富的野生柑橘種質提供了可能性。野生柑橘種質具有較強抗性，一般在田間不表現(xiàn)潰瘍病癥狀，接種潰瘍病菌后多會表現(xiàn)癥狀，但因其長期處在野生狀態(tài)，與栽培品種雜交很難獲得品質優(yōu)良的抗病品種。經過10 余年的篩選，Deng 等[8]鑒定出柑橘屬獨特的抗?jié)儾》N質枸櫞C-05（Citrus medicaL.），為防治柑橘潰瘍病研究提供了重要的柑橘屬種質。

枸櫞又名香櫞，與柚（C.grandisOsbeck）和寬皮柑橘（C.reticulataBlanco）被認為是柑橘屬種類品種起源的原始種[9-10]。枸櫞被認為起源于印度東北部及其鄰近地區(qū)[11]，但是，后來陸續(xù)發(fā)現(xiàn)我國也是枸櫞的起源中心之一，先后在我國報道枸櫞種質有11 個類型，包括變種、品種和雜種[12]。枸櫞也是最早傳入歐洲的柑橘資源，引入歐洲后又衍生了不同的枸櫞種質[11]，因此，長期的演化形成了豐富的遺傳多樣性。但是在柑橘物種的形成過程中，枸櫞一直只作父本[10-13]，可能使得枸櫞保存了原初的抗性。Das[14]指出枸櫞可能是一種抗?jié)儾≠Y源；通過田間活體針刺接種法接種潰瘍病菌，胡青波等[15]發(fā)現(xiàn)其對潰瘍病的抗病性表現(xiàn)差異。長期的人工接種和田間自然接種結果顯示枸櫞C-05 是柑橘屬獨特的抗?jié)儾》N質，為了進一步探明枸櫞C-05 的抗病機理，需要對更多的枸櫞類種質進行抗病性評價。本研究收集了14 份枸櫞種質，初步比較了它們的葉片形態(tài)學特征，以顯示枸櫞之間的種質多樣性，進而對其進行離體和活體接種潰瘍病菌，全面評價其抗病性，以期獲得更多的抗病種質資源，為后續(xù)抗病基因的挖掘和枸櫞抗病機理的探究奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以枸櫞C-05 和園香櫞、矮果香櫞、美國枸櫞、丹娜香櫞、普通香櫞、南川香櫞、長果香櫞、木里香櫞、小香櫞、野生香櫞、大香櫞、印度大果、爪哇檸檬14 份枸櫞種質為試材（表1），以極感病種質‘冰糖橙’為對照。所有參試種質均從國家柑橘改良中心長沙分中心、國家柑橘資源圃（重慶）采集接穗，嫁接在枳砧上，在病理溫室培育2 年后用于形態(tài)學觀察和潰瘍病菌接種鑒定。

表1 參與鑒定的14 份枸櫞種質和對照‘冰糖橙’的名稱和來源

1.2 葉片形態(tài)學的觀察

在枸櫞種質的1 年生春梢上采取生長一致、達到最大葉面積時的葉片，每株測定3 片葉，單葉重復。觀測葉片形狀、有無翼葉，用游標卡尺測量葉片最大長度和最大寬度、葉尖長度（葉片靠葉尖部1/3 處長度）和葉尖寬度（葉片靠葉尖部1/3 長度處的寬度），并計算葉形指數(shù)（葉長/葉寬）、葉尖指數(shù)（葉尖長/葉尖寬）[16-17]。

1.3 柑橘潰瘍病菌的制備

將已保存的潰瘍病菌 XccDL509 菌系[18]從-80 ℃超低溫冰箱取出，然后通過劃線接種于LB固體培養(yǎng)基（含10 g/L 蛋白胨、5 g/L 酵母提取物、10 g/L 氯化鈉、15 g/L 瓊脂），在28 ℃的恒溫箱中培養(yǎng)72 h 左右，挑取單菌落至20 mL 的LB 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在28 ℃和200 r/min 搖床中振蕩培養(yǎng)18～24 h，將得到的菌液通過分光光度計調整OD600至1.0[19]。用無菌水重懸菌體，并用平板計數(shù)法計算菌液濃度后[20]，繼續(xù)用無菌水調節(jié)菌液濃度至103、104、105、106cfu/mL，用于接種。

1.4 離體注射接種

每個種質采集3 片生長一致、達到最大葉面積之前的新葉，放入自封袋并做好標記。接種前用酒精棉擦拭葉片正、背面，待酒精揮發(fā)后，將葉片輕輕翻轉呈葉背朝上，用1 mL 注射器將重懸潰瘍病菌液注入葉肉組織。每個點注射的量以兩側脈間的葉肉組織完全浸潤為準（注射量約為10 μL）[19]。每片葉注射5 個點，分別注射103、104、105、106cfu/mL和無菌水，注射后均用吸水紙擦干葉表殘留菌液。葉片注射結束后，將材料統(tǒng)一放置在墊有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，在葉柄處包裹濕潤棉花，將培養(yǎng)皿置于（28±2）℃、光照強度為2 000～3 000 lx、光周期為16 h/d 的植物培養(yǎng)室中，持續(xù)20 d 觀察其發(fā)病情況。離體接種試驗重復2 次。

1.5 活體注射接種

每個種質在嫁接生長良好的活體植株上，選擇3 片達到最大葉面積前的新葉，直接在葉片上接種潰瘍病菌，活體注射接種與離體注射接種方法一致，注射結束后，將材料統(tǒng)一放置在溫度為（28±2）℃、空氣相對濕度為60%～80%的病理溫室中持續(xù)觀察30 d，并統(tǒng)一肥水管理?；铙w接種試驗重復6 次。

1.6 離體與活體接種病情指數(shù)統(tǒng)計及分級

接種后定期觀察病情的發(fā)展進程，離體接種觀察到接種后第20 d，活體接種觀察到接種后第45 d。參考崔華威等[21]的方法，采用Photoshop 和游標卡尺分別統(tǒng)計103、104、105、106cfu/mL 潰瘍病菌接種區(qū)域的典型病斑數(shù)量、病斑大小，并計算病斑面積占接種區(qū)面積的比率，沒有典型病斑的抗性反應區(qū)的壞死斑點數(shù)、壞死斑面積及其與接種區(qū)面積比率也進行統(tǒng)計和計算，但不作為典型病斑計入。分別賦予典型病斑數(shù)量、病斑區(qū)與接種區(qū)比率權重為0.5、0.5，根據病斑數(shù)量、病斑區(qū)與接種區(qū)比率，對潰瘍病的抗性病癥級別均可分為0、1、2、3、4、5 級。參考李建揮[22]的方法，統(tǒng)計每個濃度的病情指數(shù)、綜合病情指數(shù)，計算平均綜合病情指數(shù)。

病情指數(shù)＝［∑（該級病葉數(shù)×該級代表值）/（調查葉片數(shù)×發(fā)病最高級代表值）］×100

綜合病情指數(shù)＝（典型病斑數(shù)量的病情指數(shù)×0.5）+（病斑區(qū)與接種區(qū)比率的病情指數(shù)×0.5）

根據平均綜合病情指數(shù)，將枸櫞種質分為以下5 類：極抗（HR），病情指數(shù)＜10；抗?。≧），10≤病情指數(shù)≤30；感?。⊿），30＜病情指數(shù)≤70；極感（HS），病情指數(shù)＞70。

1.7 數(shù)據分析

試驗數(shù)據運用SPSS 17.0 軟件進行統(tǒng)計和差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 枸櫞種質葉片形態(tài)差異比較

對14 份枸櫞種質生長一致、達到最大葉面積的葉片進行形態(tài)學觀察，供試14 份枸櫞種質新葉顏色均為綠色，多數(shù)枸櫞種質均無明顯翼葉，只有木里香櫞有較大翼葉，印度大果有較小的翼葉。葉片形狀差異較大（圖版2-A、表2），其中園香櫞、矮果香櫞、丹娜香櫞、長果香櫞、小香櫞、大香櫞、印度大果、爪哇檸檬的葉片形狀較相似，呈卵圓形；枸櫞C-05 與美國香櫞、普通香櫞、南川香櫞、野生香櫞的葉片呈長橢圓形；木里香櫞的葉基部寬，呈近梨形。部分枸櫞種質之間的葉形指數(shù)與葉尖指數(shù)存在顯著差異，枸櫞C-05 和大香櫞的葉形指數(shù)與葉尖指數(shù)最大，小香櫞、印度大果和爪哇檸檬的最?。ū?）。供試14 份枸櫞種質葉片形態(tài)存在差異，表明枸櫞種質之間具有多樣性，這種差異也可能決定它們對潰瘍病的抗感性差異。

2.2 枸櫞種質離體接種的觀察與抗性綜合評價

枸櫞種質在離體接種潰瘍病菌后，定期觀察葉片癥狀至第20 d，在接種103cfu/mL 的潰瘍病菌后，丹娜香櫞、長果香櫞和小香櫞的發(fā)病程度最嚴重，接種反應為成片病斑，并在接種柑橘潰瘍病菌區(qū)域出現(xiàn)病斑凸起，病癥級別在4～5 級，病斑區(qū)占接種區(qū)面積的64.80%～84.95%，比感病品種‘冰糖橙’癥狀還嚴重；其次發(fā)病程度較嚴重的是南川香櫞、木里香櫞、野生香櫞、大香櫞、爪哇檸檬，接種區(qū)出現(xiàn)點狀病斑，病斑周圍帶有明顯黃色暈圈，病斑區(qū)占接種區(qū)面積的0.59%～20.75%，病癥級別為1～2 級，與感病品種‘冰糖橙’病癥相似；矮果香櫞接種區(qū)出現(xiàn)葉面內陷，接種反應為大片壞死；園香櫞、美國枸櫞的接種區(qū)出現(xiàn)成片變色，是細胞壞死的表現(xiàn)；枸櫞C-05、普通枸櫞和印度大果的接種區(qū)病斑褐化，接種反應為點狀壞死（圖版2-B，表3）。

表2 14 份枸櫞種質葉片形態(tài)特征

表3 枸櫞種質離體接種潰瘍病平均綜合病情指數(shù)分析

在104cfu/mL 及更高濃度潰瘍病菌接種區(qū)域觀察發(fā)現(xiàn)，丹娜香櫞、長果香櫞和小香櫞的發(fā)病程度更嚴重；其次是南川香櫞、木里香櫞、野生香櫞、大香櫞、爪哇檸檬，與‘冰糖橙’一樣，病癥加重；園香櫞、美國香櫞、普通枸櫞和印度大果與抗病種質枸櫞C-05 相似，表現(xiàn)出組織壞死，壞死部分隨接種濃度增高而加大（圖版2-B，表3）。

綜合比較離體接種各濃度潰瘍病菌的癥狀及其平均綜合病情指數(shù)發(fā)現(xiàn)，枸櫞C-05、園香櫞、矮果香櫞、美國枸櫞和普通枸櫞的綜合病情指數(shù)為0，為極抗病類；印度大果的平均綜合病情指數(shù)在20～30 范圍內，屬于抗病類；木里香櫞和大香櫞的綜合指數(shù)在50～70 范圍內，屬于感病類；丹娜香櫞、南川香櫞、長果香櫞、小香櫞、野生香櫞、爪哇檸檬和‘冰糖橙’的平均綜合病情指數(shù)高于70，表現(xiàn)為極感?。ū?）。

2.3 枸櫞種質活體接種的觀察與抗性綜合評價

枸櫞種質活體接種潰瘍病菌后，每天觀察葉片的癥狀至接種后第45 d。接種后第9 d（圖版3-C），多數(shù)種質在低濃度菌液（103、104cfu/mL）接種區(qū)域開始表現(xiàn)反應，高濃度菌液（105、106cfu/mL）接種區(qū)域有較大面積的反應區(qū)域，但是還不能清晰地辨別抗病反應和感病癥狀；到接種后第15 d（圖版3-D），不同菌液濃度接種后的組織壞死等抗病反應和病斑凸起等感病癥狀已經比較明顯，初步可以辨別抗病和感病種質，但仍然不是很清晰；至接種后第25 d（圖版3-E），抗病反應和感病癥狀已經穩(wěn)定，后續(xù)的觀察沒有抗病或感病程度的變化，因而以接種后第25 d 的觀察結果為最終判定，確定不同枸櫞種質的抗病、感病程度。

接種后第25 d，接種103cfu/mL 潰瘍病菌后，丹娜香櫞和大香櫞的發(fā)病最快，發(fā)病程度最嚴重，接種反應為6 個以上的點狀病斑，并在接種柑橘潰瘍病菌區(qū)域出現(xiàn)火山口狀或點狀病斑凸起，出現(xiàn)病斑破裂，病癥級別在3～4 級，病斑面積占接種區(qū)面積的9.97%～20.70%，比感病品種‘冰糖橙’發(fā)病還嚴重；其次發(fā)病程度較嚴重的是南川香櫞、長果香櫞、木里香櫞、野生香櫞和爪哇檸檬，接種區(qū)出現(xiàn)1～4 個點狀病斑，病斑周圍帶有明顯黃色暈圈，病斑面積占接種區(qū)面積的0.56%～10.70%，病癥級別為2 級，與感病品種‘冰糖橙’的病癥相似；小香櫞出現(xiàn)點狀病斑凸起，病斑面積占接種區(qū)面積的0.96%，病癥級別為1 級；園香櫞、矮果香櫞、美國香櫞和印度大果的接種區(qū)出現(xiàn)病斑褐化，為點狀病斑壞死，與極抗病種質枸櫞C-05 相似；普通枸櫞在接種區(qū)無明顯病斑（圖版3-E，表4）。

表4 枸櫞種質活體接種潰瘍病平均綜合病情指數(shù)分析

在104cfu/mL 潰瘍病菌及更高濃度潰瘍病菌接種區(qū)域觀察發(fā)現(xiàn)，丹娜香櫞、南川香櫞、長果香櫞、木里香櫞、野生香櫞、大香櫞、爪哇檸檬與‘冰糖橙’一樣，發(fā)病程度更嚴重；其次是小香櫞病癥加重；園香櫞、矮果香櫞、美國香櫞、普通枸櫞和印度大果與極抗病種質枸櫞C-05 相似，表現(xiàn)出組織壞死，壞死部分隨接種濃度增高而加大，高濃度接種區(qū)域最終表現(xiàn)褐化失色（圖版3-E，表4）。

綜合比較活體接種各濃度癥狀及其平均綜合病情指數(shù)發(fā)現(xiàn)（表4），園香櫞、矮果香櫞、美國枸櫞、普通枸櫞、印度大果的綜合病情指數(shù)均為0，與枸櫞C-05 抗病性接近，屬于極抗?。黄渌蹤捶N質對潰瘍病皆表現(xiàn)為感病或極感病，其中小香櫞的綜合病情指數(shù)介于50～70 之間，屬于感病，丹娜香櫞、南川香櫞、長果香櫞、木里香櫞、野生香櫞、大香櫞、爪哇檸檬的綜合病情指數(shù)都在70 以上，與‘冰糖橙’相似，屬于極感病。

2.4 枸櫞種質活體接種的葉片病癥分析

在活體接種潰瘍病菌后第25 d，以104cfu/mL潰瘍病菌接種枸櫞種質的癥狀，分析了不同枸櫞表現(xiàn)的癥狀特征，測量了接種區(qū)域的單個獨立病斑的大小（圖1），結果顯示，大香櫞和丹娜香櫞病斑最大，火山口狀凸起的典型癥狀的病斑直徑在4.5 mm 以上，病斑融合，有明顯的黃色暈圈；爪哇檸檬、野生香櫞、長果香櫞、南川香櫞與‘冰糖橙’相似，也形成典型的火山口狀凸起，并帶有黃色暈圈，潰瘍病病斑直徑在3.5 mm 以上，并有病斑融合成大病斑塊的現(xiàn)象；小香櫞出現(xiàn)火山口狀凸起病斑，直徑為2.5～3.0 mm，但未發(fā)現(xiàn)明顯的融合現(xiàn)象；木里香櫞病斑直徑為1.7 mm，病斑突起但沒有黃色暈圈；印度大果、矮果香櫞和園香櫞褐化壞死病斑直徑為1.5～2.5 mm，未形成火山口狀潰瘍病癥狀；美國枸櫞和普通枸櫞的壞死病斑直徑在1.5 mm 以下；而枸櫞C-05 在104cfu/mL 接種區(qū)域只表現(xiàn)出壞死的顆粒狀斑點。

圖1 枸櫞種質活體接種在25 d 時病斑大小

3 討論與結論

本研究對不同枸櫞種質的離體與活體接種潰瘍病菌的鑒定結果基本一致，除3 個種質在感病和抗病程度上有差異外，沒有實質性的差異，說明枸櫞對潰瘍病抗性鑒定結果是比較穩(wěn)定的。離體鑒定的感病種質癥狀比活體鑒定的發(fā)病快，有些感病種質的癥狀表現(xiàn)較嚴重，可能是離體環(huán)境濕度與溫度偏高導致感病種質癥狀嚴重，但是離體葉片能保存的時間有限，不能作為最終鑒定結果?；铙w接種的葉片比離體接種的葉片觀察時間更持久，本研究一直觀察到接種后第45 d，部分感病葉片落葉后才停止觀察，但是在接種第25 d 后癥狀基本穩(wěn)定，沒有出現(xiàn)新的發(fā)病癥狀，在穩(wěn)定的溫濕度條件下，活體接種第25 d 后基本可以判斷種質的抗病或感病程度。因此，本研究結果表明，離體接種結果可以快速篩選，而活體接種結果更為準確。

研究柑橘潰瘍病的抗性對柑橘種質資源的保存、珍稀品種的保護和今后抗病育種工作具有重要意義。枸櫞C-05 是目前已報道的對柑橘潰瘍病具有穩(wěn)定抗性的柑橘屬特異種質資源[8]。前人對枸櫞的研究多用于果皮內含物，作為原始種抗病方面研究較少。王亞飛等利用香櫞研究柑橘衰退病[23]；胡青波等[15]在田間試驗發(fā)現(xiàn)6 個枸櫞類品種與感病品種‘冰糖橙’之間均存在差異，故采用針刺涂菌接種法對其進行抗病性鑒定，小香櫞、爪哇檸檬、大香櫞、連南檸檬、廣東香櫞均表現(xiàn)出感病的癥狀，只是癥狀的嚴重程度都不及感病的‘冰糖橙’，且發(fā)病時間明顯比‘冰糖橙’緩慢，與本研究注射接種鑒定結果一致，小香櫞、大香櫞和爪哇檸檬都表現(xiàn)感病，針刺涂菌接種法比本研究結果感病程度相對較輕，可能由于針刺涂菌接種法進入葉片的菌量少或者接種濃度不一致，所表現(xiàn)的癥狀表現(xiàn)也不太一致，也有可能田間環(huán)境濕度與溫度變化差異大，感病癥狀表現(xiàn)不明顯。本研究采用注射接種4 個潰瘍病菌濃度進行鑒定，低濃度可以比較清晰地區(qū)別感病和抗病種質，但是103cfu/mL 潰瘍病菌引起的病癥反應要比104cfu/mL 潰瘍病菌慢；高濃度（105～106cfu/mL）的潰瘍病菌接種，病癥形成快，但通常形成大塊病斑，或大面積壞死，不易比較不同程度的感病或抗病性，因此，以104cfu/mL 的潰瘍病菌作為接種濃度是比較合適的。

葉尖指數(shù)和葉形指數(shù)為重要的形態(tài)學標記[24]，孫珍珠等[25]發(fā)現(xiàn)不同寬皮柑橘品種的葉片形態(tài)差異顯著。譚李梅等[26]研究發(fā)現(xiàn)，檸檬合子胚與珠心胚葉尖指數(shù)無差異，葉形指數(shù)存在顯著差異，但不能作為區(qū)分合子胚與珠心胚實生苗的葉片形態(tài)學標記。本研究14 份枸櫞種質的葉形指數(shù)和葉尖指數(shù)也存在顯著性差異，小香櫞、印度大果和爪哇檸檬的葉形指數(shù)與葉尖指數(shù)最小，葉片較相似，均呈卵圓形，而小香櫞和爪哇檸檬屬于感病種質，印度大果屬于抗病種質；枸櫞C-05 與美國枸櫞和普通枸櫞葉形較相似，呈長橢圓形，均屬抗病種質；枸櫞C-05 和大香櫞的葉形指數(shù)與葉尖指數(shù)最大，枸櫞C-05 極抗病，而大香櫞感病。因此，枸櫞種質之間葉形態(tài)具有差異，但與抗病性差異無關，推測有些枸櫞種質葉片較相似可能與其親緣性較近相關。

前期的研究表明，不同柑橘種類或品種對潰瘍病抗性變化較大[27-28]，并且同一柑橘種類的不同品種的抗病性表現(xiàn)也不一致，對于潰瘍病的抗病性表現(xiàn)相差數(shù)十倍以上[2]，與本研究結果相似。總之，本研究鑒定出與枸櫞C-05具有類似抗性的園香櫞、矮果香櫞、美國枸櫞、普通枸櫞和印度大果，可為抗病基因的挖掘和抗病育種提供更多的種質資源。枸櫞種質之間對潰瘍病呈現(xiàn)極大的抗性差異，這種差異與其形態(tài)無關，說明枸櫞C-05 的抗病性不是枸櫞的非寄主抗性，抗病的幾個枸櫞是具有內在的獨特抗病性，這對后續(xù)利用枸櫞C-05 及其他抗病枸櫞種質探明抗病機理和抗病育種有重要意義。