趙 楠，顧沛雯，李嘉泓，張 樂

（1 寧夏大學(xué)葡萄酒學(xué)院，銀川750021）（2 寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院）

根結(jié)線蟲（Meloidogynespp.）是一類寄主范圍廣、危害嚴(yán)重的植物病原線蟲，自身可攜帶并傳播真菌、細(xì)菌和病毒等病原物，加重土傳病害的發(fā)生，對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成較大影響[1]。1889 年Neal 首次在美國加州的葡萄上發(fā)現(xiàn)根結(jié)線蟲，隨后葡萄根結(jié)線蟲危害日趨加重，在世界各地的葡萄園中均有發(fā)生，逐漸引起了許多學(xué)者的關(guān)注和重視。在我國，李長存等發(fā)現(xiàn)，根結(jié)線蟲侵害葡萄植株后，會(huì)造成葡萄園減產(chǎn)25%～30%，嚴(yán)重時(shí)在80%以上[2]。研究發(fā)現(xiàn)，根結(jié)線蟲在葡萄根內(nèi)寄生為害，會(huì)刺激根系形成大量根結(jié)，嚴(yán)重干擾根系的正常生理過程，造成根部畸形、植株生長緩慢、枯萎等癥狀[3]。根結(jié)線蟲已成為葡萄苗木生產(chǎn)上的一大障礙，因此準(zhǔn)確鑒定葡萄根結(jié)線蟲的種類至關(guān)重要。

寧夏永寧縣是賀蘭山東麓葡萄酒產(chǎn)區(qū)中最大的釀酒葡萄種植基地。近年來，隨著當(dāng)?shù)仄咸言耘嗝娣e的擴(kuò)大，根結(jié)線蟲病擴(kuò)散蔓延迅速、發(fā)生逐年增加，尤其在育苗圃中最為嚴(yán)重，導(dǎo)致葡萄苗木的質(zhì)量下降，嚴(yán)重制約了寧夏葡萄產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。本研究在調(diào)查寧夏永寧縣葡萄育苗圃根結(jié)線蟲病害的基礎(chǔ)上，通過根結(jié)線蟲雌蟲和2 齡幼蟲的形態(tài)特征及雌蟲會(huì)陰花紋對葡萄根結(jié)線蟲進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定，利用根結(jié)線蟲線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）通用引物（C2F3/1108）及序列特異性擴(kuò)增區(qū)（sequence characterized amplified region,SCAR）特異性引物（MI-F/MI-R 和Far F/Far R）對不同葡萄品種中的根結(jié)線蟲進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，以期為后期篩選和利用抗根結(jié)線蟲的葡萄品種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試葡萄苗木和蟲源

供試葡萄苗木：2019 年5—10 月從寧夏永寧縣農(nóng)墾集團(tuán)葡萄育苗基地生產(chǎn)區(qū)采集15 個(gè)葡萄品種的2 年生苗木，品種分別是‘赤霞珠’‘馬瑟蘭’‘黑比諾’‘西拉’‘陽光玫瑰’‘紅芭拉蒂’‘大青’‘貝達(dá)’‘霞多麗’‘美樂’‘品麗珠’‘無核翠寶’‘夏黑’‘愛神玫瑰’和‘抗砧3 號(hào)’。

供試蟲源：采用直接解剖法從15 個(gè)葡萄品種苗木的根結(jié)組織中獲取雌蟲（‘抗砧3 號(hào)’未檢測出根結(jié)線蟲）。每個(gè)葡萄品種挑取20 頭雌蟲，隨機(jī)選取10 頭雌蟲用于形態(tài)學(xué)鑒定，14 個(gè)葡萄品種共選取140 頭雌蟲；剩余的10 頭雌蟲用于分子生物學(xué)鑒定。取葡萄苗木的根際土壤，用貝爾曼漏斗法從土壤中獲取2 齡幼蟲，用于形態(tài)學(xué)鑒定。

1.1.2 主要試劑和儀器

所用試劑：10×PCR Buffer（Mg2+free）和蛋白酶K，上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司；10×EasyTaq?Buffer、dNTPs、EasyTaq?DNA Polymerase 和DNA Maker，北京全式金生物技術(shù)有限公司；所用引物為生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

所用儀器：DYY-C6 電泳儀，北京市六一儀器廠；SMZ171 體視顯微鏡，麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)中國有限公司；BX53 Olympus 正置熒光顯微鏡，日本奧林巴斯有限公司；Bio-Rad 梯度PCR 儀，Bio-Rad公司；Azure c200 凝膠成像儀，Azure Biosystems 公司。

赫利森之前也沒有尋找這些通道?！白鳛橐幻R床醫(yī)生，我不知道它們的存在，”她說，“我們認(rèn)為骨頭和大腦是兩個(gè)不同的部分，腦膜在它們之間。我不知道它們之間可能存在某種聯(lián)系?！钡J(rèn)為會(huì)存在可能?！帮B骨和骨髓腔緊貼大腦，”她說，“然而，從來沒有人研究過這兩個(gè)部分之間潛在的相互作用?！?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 葡萄根結(jié)線蟲病的調(diào)查

按照隨機(jī)取樣的原則采集15 個(gè)葡萄品種的苗木，每個(gè)品種采集10 株苗木，共采集150 株苗木。采集時(shí)挖取整株苗木，將苗木裝入自封袋內(nèi)，標(biāo)記葡萄品種、采樣時(shí)間等信息，帶回實(shí)驗(yàn)室后用清水沖洗干凈置于4 ℃冰箱中備用。觀察苗木根部癥狀，根據(jù)根結(jié)的有無判斷苗木是否發(fā)病。選擇具有代表性的病害品種，觀察苗木的感病癥狀并拍照。

1.2.2 形態(tài)學(xué)鑒定

雌蟲和2 齡幼蟲的形態(tài)特征觀察：參考劉維志的方法[4]，將獲得的雌蟲和2 齡幼蟲制成臨時(shí)玻片，于BX53 顯微鏡下觀察根結(jié)線蟲的整體蟲態(tài)、口針特征和中食道球特征等形態(tài)特征。

雌蟲會(huì)陰花紋的制作與觀察：參考劉維志的方法[4]制作根結(jié)線蟲會(huì)陰花紋，將分離得到的雌蟲放在干凈的滴有45%乳酸的載玻片上，用解剖刀切下包含完整會(huì)陰花紋的角質(zhì)膜，制成臨時(shí)玻片，于BX53 顯微鏡下觀察。

1.2.3 分子生物學(xué)鑒定

單頭根結(jié)線蟲的DNA 提取：采用蛋白酶K 法[5]分別提取140 頭根結(jié)線蟲的DNA。取單頭雌蟲放入PCR 管中，加入8.0 μL ddH2O 和1.0 μL 10×PCR Buffer（Mg2+free），液氮中放置1 min，85 ℃水浴2 min；加入1 mg/mL 的蛋白酶K 1 μL，55 ℃水浴15 min，95 ℃水浴10 min，得到DNA 模板。DNA模板放在-80 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

根結(jié)線蟲mtDNA-PCR 擴(kuò)增：利用根結(jié)線蟲mtDNA 的COⅡ和LrRNA基因間序列通用引物C2F3/1108 對不同葡萄品種中的根結(jié)線蟲進(jìn)行PCR擴(kuò)增[6]。25 μL PCR 反應(yīng)體系：引物各0.5 μL，10×EasyTaq?Buffer 2.5 μL，EasyTaq?DNA Polymerase 0.5 μL，dNTPs 2.0 μL，DNA 模板2.0 μL，ddH2O 17.0μL。PCR 擴(kuò)增程序是94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性1 min，退火溫度57 ℃ 1 min，72 ℃延伸1.5 min，30 個(gè)循環(huán)，72 ℃再延伸10 min，4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠上檢測，凝膠成像儀上拍照。

表1 引物信息

1.2.4 根結(jié)線蟲種類的統(tǒng)計(jì)方法

根據(jù)根結(jié)線蟲分子生物學(xué)鑒定結(jié)果，統(tǒng)計(jì)15個(gè)葡萄品種中根結(jié)線蟲的種類。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄根結(jié)線蟲病的癥狀

在葡萄育苗圃中，苗木感病嚴(yán)重，除‘抗砧3號(hào)’外，其余14 個(gè)葡萄品種的苗木均受根結(jié)線蟲為害。葡萄苗木感病后，地上部表現(xiàn)出植株矮化、生長發(fā)育不良、葉片黃化且失去光澤的癥狀（圖版4-A-a），地下部根部畸形，形成瘤狀根結(jié)。

不同葡萄品種苗木感病癥狀表現(xiàn)不同，如代表性葡萄品種‘美樂’，感病后地上部表現(xiàn)出枝梢短弱、葉片卷曲的癥狀，地下部根稍膨大，根系形成大小不等的根結(jié)，外表光滑（圖版4-A-b）；代表性葡萄品種‘霞多麗’，感病后地上部表現(xiàn)出生長勢弱，未有其他明顯癥狀，地下部形成畸形的瘤狀根結(jié)，相互連接成串珠狀，外表粗糙（圖版4-A-c）。

2.2 根結(jié)線蟲形態(tài)學(xué)鑒定

（1）南方根結(jié)線蟲的鑒定。2 齡幼蟲：蠕蟲形，頭冠明顯、較窄、前端凸平，頭部與蟲體分界不明顯，口針纖細(xì)，中食道球橢圓形，尾尖鈍圓，尾端透明區(qū)末端界限明顯（圖版4-B-a～c）。雌蟲：乳白色，蟲體呈梨形，唇區(qū)凸起，口針錐體尖端鈍圓，口針錐部向背面彎曲明顯，口針基球扁圓形，中食道球近似為圓形（圖版4-B-d）。雌蟲會(huì)陰花紋：卵圓形，背弓高，近似梯形，頂部平，背紋緊密，背面和側(cè)面的線紋呈平滑的波浪形，陰門與肛門之間無線紋（圖版4-B-e）。鑒定為南方根結(jié)線蟲（M.incognita）。

（2）花生根結(jié)線蟲的鑒定。2 齡幼蟲：蠕蟲形，頭冠明顯、前端平，口針纖細(xì)，中食道球近似圓形，尾尖尖圓，尾部透明區(qū)末端無明顯界限（圖版4-B-f～h）。雌蟲：乳白色，蟲體呈梨形。唇區(qū)略有突起，口針錐部稍向背面彎曲，口針基球近似球形，中食道球橢圓形（圖版4-B-i）。雌蟲會(huì)陰花紋：卵圓形，背弓較低，扁平至圓形，線紋粗、平滑且連續(xù)，背面和側(cè)面的線紋稍呈鋸齒狀，側(cè)面的線紋有時(shí)分叉，部分線紋從兩側(cè)彎向陰門（圖版4-B-j）。鑒定為花生根結(jié)線蟲（M.arenaria）。

2.3 根結(jié)線蟲分子生物學(xué)鑒定

2.3.1 根結(jié)線蟲mtDNA-PCR 擴(kuò)增

選用通用引物C2F3/1108 對140 頭根結(jié)線蟲的DNA 進(jìn)行mtDNA-PCR 擴(kuò)增。結(jié)果表明，14 個(gè)葡萄品種中的根結(jié)線蟲，能擴(kuò)增出2 種目標(biāo)條帶，條帶的位置分別在1 100 bp 和1 700 bp。在葡萄品種‘赤霞珠’‘馬瑟蘭’‘黑比諾’‘西拉’‘陽光玫瑰’‘紅芭拉蒂’‘大青’‘貝達(dá)’‘霞多麗’中，均擴(kuò)增出2種目標(biāo)條帶（圖1-a～i）；在葡萄品種‘美樂’‘品麗珠’‘無核翠寶’‘夏黑’‘愛神玫瑰’中，均只擴(kuò)增出1 種目標(biāo)條帶（圖1-j～n）。

2.3.2 根結(jié)線蟲SCAR 特異性檢測

根據(jù)mtDNA-PCR 擴(kuò)增的結(jié)果，分別用特異性引物MI-F/MI-R和Far F/Far R對根結(jié)線蟲的種類進(jìn)行SCAR 特異性檢測。結(jié)果表明，目標(biāo)條帶位置在1 700 bp 的DNA，經(jīng)引物MI-F/MI-R 可以擴(kuò)增出955 bp 的目標(biāo)條帶，與南方根結(jié)線蟲（M.incognita）一致（圖2）。目標(biāo)條帶位置在1 100 bp 的DNA，經(jīng)引物Far F/Far R 可以擴(kuò)增出420 bp 的目標(biāo)條帶，與花生根結(jié)線蟲（M.arenaria）一致（圖3）。由此得出為害葡萄育苗圃中苗木的根結(jié)線蟲是南方根結(jié)線蟲（M.incognita）和花生根結(jié)線蟲（M.arenaria），其中南方根結(jié)線蟲（M.incognita）為優(yōu)勢種群，占根結(jié)線蟲群體的88.57%。

圖1 不同葡萄品種中根結(jié)線蟲的mtDNA-PCR 擴(kuò)增結(jié)果

圖2 南方根結(jié)線蟲特異性引物MI-F/MI-R PCR 擴(kuò)增結(jié)果

2.3.3 不同葡萄品種中根結(jié)線蟲的鑒定結(jié)果

圖3 花生根結(jié)線蟲特異性引物Far F/Far R PCR 擴(kuò)增結(jié)果

由表2 可知，不同葡萄品種感染根結(jié)線蟲的種類與數(shù)量不同，其中南方根結(jié)線蟲（M.incognita）可以侵染所有的感病葡萄品種，在‘美樂’‘品麗珠’‘無核翠寶’‘夏黑’‘愛神玫瑰’中所占數(shù)量比率為100%；在‘赤霞珠’‘馬瑟蘭’‘黑比諾’‘西拉’‘陽光玫瑰’‘紅芭拉蒂’‘大青’‘貝達(dá)’中所占數(shù)量比率均大于70%；僅在‘霞多麗’中所占數(shù)量比率較低，為40%。結(jié)果表明，在葡萄育苗圃中，南方根結(jié)線蟲（M.incognita）對葡萄苗木的侵染能力要明顯強(qiáng)于花生根結(jié)線蟲（M.arenaria）。

表2 15 個(gè)葡萄品種中根結(jié)線蟲的分子鑒定結(jié)果

3 討論與結(jié)論

形態(tài)學(xué)鑒定是根結(jié)線蟲種類鑒定的傳統(tǒng)方法，通常以雌蟲會(huì)陰花紋形態(tài)特征，口針特征，食道球特征，2 齡幼蟲和雄蟲的頭部、尾部特征，整體形態(tài)等形態(tài)特征為依據(jù)進(jìn)行鑒定。趙洪海等[9]通過根結(jié)線蟲的形態(tài)特征和雌蟲會(huì)陰花紋，鑒定出山東省葡萄上的病原線蟲是南方根結(jié)線蟲（M.incognita）。然而，根結(jié)線蟲的形態(tài)特征受寄主與環(huán)境等多種因素的影響，僅依靠形態(tài)學(xué)鑒定會(huì)導(dǎo)致鑒定結(jié)果有誤。近年來，分子生物學(xué)鑒定技術(shù)發(fā)展迅速，因其具有高效性、精確性的特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于根結(jié)線蟲的鑒定工作。如龍海波等[10]通過mtDNA 的序列分析以及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹的方法鑒定出海南省蔬菜作物上的根結(jié)線蟲是象爾豆根結(jié)線蟲（M.enterolobii）。但由于分子生物學(xué)鑒定技術(shù)起步較晚，致使已獲得序列的根結(jié)線蟲種類較少，且部分序列在根結(jié)線蟲種內(nèi)及種間存在一定范圍的變異[11]。因此，將形態(tài)學(xué)鑒定與分子生物學(xué)鑒定相結(jié)合，可有效避免因鑒定方法單一而產(chǎn)生的誤差，使鑒定結(jié)果更加準(zhǔn)確、可靠。如Aydinli 等[12]通過雌蟲會(huì)陰花紋和SCAR 特異性鑒定技術(shù)鑒定出土耳其中部地區(qū)危害茄子的病原線蟲是埃塞俄比亞根結(jié)線蟲（M.ethiopica）。本研究采用形態(tài)學(xué)鑒定（雌蟲、2 齡幼蟲的形態(tài)特征和雌蟲會(huì)陰花紋）和分子生物學(xué)鑒定（mtDNA-PCR 和SCAR 特異性檢測）相結(jié)合的方法，鑒定出葡萄育苗圃中根結(jié)線蟲的種類是南方根結(jié)線蟲（M.incognita）和花生根結(jié)線蟲（M.arenaria）。

馬艷粉等[13]研究發(fā)現(xiàn)，根結(jié)線蟲對不同寄主植物的侵染能力存在顯著差異。本研究發(fā)現(xiàn)，在葡萄育苗圃所有的感病品種中，僅在少數(shù)幾個(gè)葡萄品種上發(fā)現(xiàn)花生根結(jié)線蟲（M.arenaria），所占的數(shù)量比率普遍較低，均小于60%。反之，南方根結(jié)線蟲（M.incognita）可侵染所有的感病葡萄品種，所占比率較高，除‘霞多麗’外均大于50%。表明該地區(qū)兩種根結(jié)線蟲對葡萄的侵染能力差異明顯，其中南方根結(jié)線蟲的侵染能力最強(qiáng)。胡先奇等[14]研究發(fā)現(xiàn)，根結(jié)線蟲對寄主植物的侵染能力與根結(jié)線蟲種間的致病性差異有關(guān)。由此可知，南方根結(jié)線蟲（M.incognita）對葡萄具有較強(qiáng)的致病性。此外，影響根結(jié)線蟲侵染能力的原因還與寄主植物品種間的抗性有關(guān)。如張懷軍等[15]研究發(fā)現(xiàn)，根結(jié)線蟲對不同番茄品種侵染能力的差異與番茄品種間的抗性密切相關(guān)。然而目前關(guān)于根結(jié)線蟲對葡萄致病性機(jī)理及抗性機(jī)制的研究較少，需進(jìn)一步探究。

本研究還發(fā)現(xiàn)，‘抗砧3 號(hào)’免疫根結(jié)線蟲病，這與劉三軍等[16]發(fā)現(xiàn)的‘3309P’‘5BB’‘抗砧3 號(hào)’等砧木品種抗根結(jié)線蟲病的結(jié)果一致，為選育抗根結(jié)線蟲病的葡萄苗木提供了基礎(chǔ)。但由于時(shí)間的局限性，本研究僅以永寧縣葡萄根結(jié)線蟲病害調(diào)查為基礎(chǔ)，鑒定了該地區(qū)育苗圃中根結(jié)線蟲的種類，而對整個(gè)賀蘭山東麓葡萄酒產(chǎn)區(qū)中根結(jié)線蟲的種類分布與所占的數(shù)量比率還無法判定。今后，對產(chǎn)區(qū)內(nèi)其他葡萄種植地是否存在根結(jié)線蟲為害的問題，需進(jìn)一步調(diào)查研究。