劉麗莉，孟圓圓，楊曉盼，代曉凝，郝威銘1

(1.河南科技大學食品與生物工程學院，河南 洛陽 471023；2.食品加工與安全國家級教學示范中心，河南 洛陽471023)

石墨烯是由單層碳原子以 sp2方式雜化并有序排列堆積而成的新型二維蜂窩狀原子晶體[1]，因其結構獨特，使石墨烯具有優(yōu)良的熱導性、吸附性、化學穩(wěn)定性等物理化學特性，但石墨烯在溶劑中分散性較差且易團聚[2-3]。氧化石墨烯(GO)是石墨烯的衍生物，其表面含有豐富的羥基、環(huán)氧基和羧基等親水基團，在一定程度上改善了石墨烯的分散性、水溶性及生物相容性[4-5]。為進一步擴大GO 的應用范圍，將GO 與Fe3O4等磁性納米顆粒相結合，制備的磁性氧化石墨烯復合材料因更具有優(yōu)良特性而成為當前研究的熱點。

Fe3O4/GO集磁性納米材料和GO的優(yōu)良特性于一體[6]，不僅具有較強的超順磁性，還擁有對熒光的猝滅作用及對DNA 單鏈強烈的吸附能力[7-8]。已報道的Fe3O4/GO 的制備方法有水熱法、微乳液法、溶膠-凝膠法、水解法、化學共沉淀法等。利用Fe3O4/GO 所建立的檢測方法操作簡便、成本較低、特異性好、靈敏度高。楊宇等[9]將Fe3O4/GO 作為熒光猝滅劑，利用磁性富集熒光法分離大腸埃希菌O157∶H7，從而實現(xiàn)對其高靈敏檢測。LI 等[10]以萘酰亞胺衍生物標記富含胸腺嘧啶(T)的 ssDNA，以 Fe3O4/GO 為猝滅劑和預濃縮劑，建立了一種檢測汞(II)的熒光法。但以上Fe3O4/GO 的制備方法仍存在對設備要求高、粒子結晶性能差、產(chǎn)量低、影響因素多等缺點。目前，關于 Fe3O4/GO 制備表征后在沙門氏菌熒光猝滅方面的應用尚少見報道。本研究中，采用改進后的化學共沉淀法制備Fe3O4/GO，并對其結構進行表征，以達到降低成本、操作簡單、提高熒光猝滅率的效果；利用Fe3O4/GO 的順磁性、熒光猝滅效應及對 DNA 單鏈強烈的吸附能力等優(yōu)良特性，及熒光探針具有選擇性好、靈敏度高和成本低等優(yōu)點，探究 Fe3O4/GO 對沙門氏菌熒光探針的猝滅作用，得出 Fe3O4/GO 猝滅沙門氏菌熒光探針的速率常數(shù)(kq)、結合常數(shù)(K)，以進一步探討其熒光猝滅機理，并對 Fe3O4/GO 熒光探針復合物的選擇性進行研究，以期建立一種基于熒光標記DNA結合 Fe3O4/GO 熒光猝滅效應快速檢測沙門氏菌的新方法，減少由沙門氏菌所引起的食品中毒事件的發(fā)生及對人和動物生命健康造成的危害。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氧化石墨烯，由南京先豐納米材料科技有限公司生產(chǎn)；溴化鉀，分析純，由上海一研生物有限公司生產(chǎn)。

FeCl3、FeCl2，由天津市福晨化學試劑廠生產(chǎn)；氨水，分析純，由上海強順化學試劑有限公司生產(chǎn)；無水乙醇，分析純，由天津市德恩化學試劑有限公司生產(chǎn)。所有沙門氏菌 DNA 堿基序列由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 沙門氏菌DNA 序列的設計

根據(jù)文獻[11-12]，采用Primer Premier 5.0 設計沙門氏菌DNA 堿基序列，并用Ribosomal Database Project II和NCBI Blast 2數(shù)據(jù)庫提供的Probe Match檢測序列的特異性。設計的沙門氏菌DNA 序列如表1 所示。

1.2.2 Fe3O4/GO 的制備

在劉闖[13]的方法上作適當改進。采用化學共沉淀法制備Fe3O4/GO，分別取2 g FeCl3和1 g FeCl2加入到100 mL 滅菌超純水中，超聲處理2 h，得溶液A；取0.3 g GO 加入到100 mL 滅菌超純水中，超聲處理4 h，得溶液B；將以上2 種溶液進行混合，加入30%氨水，將溶液pH 調整為9～10 左右，置于水浴鍋中加熱到 90 ℃，同時攪拌至混合物顏色完全變黑，將其從水浴鍋中取出，自然冷卻到室溫，置于離心機中離心5 min(10 000 r/min)，得到黑色固體，用滅菌超純水和無水乙醇洗滌數(shù)次至混合物上清液的pH 為7 左右，再將黑色固體置于70 ℃的干燥箱中烘干，即可制得Fe3O4/GO。

1.2.3 Fe3O4/GO 溶液的配置

取一定質量的Fe3O4/GO 加入到滅菌超純水中，放入超聲波清洗儀中進行超聲，直到 Fe3O4/GO 完全分散到水中為止；再將超聲后的 Fe3O4/GO 分別稀釋成 4×10?5、8×10?5、1.2×10?4、1.6×10?4、2.0×10?4、2.4×10?4、2.8×10?4、3.2×10?4、3.6×10?4g/mL 不同質量濃度的溶液。

1.2.4 GO 和Fe3O4/GO 的結構表征

1) 掃描電鏡(SEM)和透射電鏡(TEM)分析。分別取微量的GO 和Fe3O4/GO 待測樣品，用導電銀膠將待測樣品粘到樣品臺上，并將其置于掃描電子顯微鏡下對其形貌進行表征；分別將 GO 和Fe3O4/GO 粉末通過超聲制成分散液，取1～2 滴分散液于碳支持膜的銅網(wǎng)格上，再放在干燥的濾紙上自然干燥后將其置于JEM 2100 型透射電鏡上，觀察其形貌并攝像。

2) X 射線衍射(XRD)分析。在黨志敏[14]的方法上作適當改進。采用粉末衍射法，分別取適量的GO 和Fe3O4/GO 待測樣品于研缽中研細，置于樣品臺上，放入X 射線衍射儀中，對待測樣品進行表征。采用 Cukα輻照(λ=0.154 nm)，管壓 40 kV，管流 30 mA，2θ 值為 5°～80°。

3) 傅里葉變換中遠紅外(FT-IR)分析。采用KBr 壓片法制樣，將待測樣品與干燥后的 KBr 按1∶100 進行混合，并置于瑪瑙研缽中，研磨均勻后進行壓片，在壓強約為15 MPa 的條件下保持1 min，即可得到樣品薄片。對KBr 薄片作背景掃描，再對樣品薄片進行掃描，設置掃描范圍為400～4000 cm?1[14]。

1.2.5 熒光猝滅機理分析

1) 熒光光譜分析。分別取上述不同質量濃度的Fe3O4/GO 與合成的50 nmol/L 沙門氏菌熒光探針進行混合，在四維旋轉混勻器上37 ℃條件下孵育1 h，利用磁場磁力收集 Fe3O4/GO 熒光探針復合物，取上清液于熒光石英比色皿中，在激發(fā)波長495 nm、發(fā)射波長517 nm 條件下，采用熒光分光光度計進行熒光測定。為消除 Fe3O4/GO 納米材料對熒光強度的遮蔽效應，以超純水代替沙門氏菌熒光探針，在相同條件下，對不同質量濃度的 Fe3O4/GO 進行熒光測定。扣除自身熒光背景吸收，所測熒光強度△F=F－Ft(F 為加入沙門氏菌熒光探針時的熒光強度，F(xiàn)t為未加入沙門氏菌熒光探針時的熒光強度)。

2) 紫外(UV)光譜分析。分別取 3.2×10?4g/mL質量濃度的GO 溶液、Fe3O4/GO 及Fe3O4/GO 熒光探針溶液置于紫外石英比色皿中，在 185～400 nm掃描范圍內用紫外分光光度計進行測定，并扣除其背景吸收。

1.2.6 Fe3O4/GO 熒光探針復合物的選擇性分析

分別吸取濃度為 1 pmoL/L 的沙門氏菌目標DNA 溶液和單堿基配錯序列(MT1)、雙堿基配錯序列(MT2)、三堿基配錯序列(MT3)，加入到質量濃度為 3.2×10?4g/mL 的 Fe3O4/GO 熒光探針復合物溶液中，在 42 ℃條件下反應一定時間，以完成部分雜交，隨后置于磁場中磁分離10 min，收集磁性顆粒，移除原溶液，取PBS 緩沖液清洗磁性顆粒，除去未反應的DNA。再吸取用PBS 緩沖液稀釋的釋放探針溶液加入到磁性顆粒中，富集5 倍，在42 ℃條件下反應 2 h，根據(jù)堿基互補配對原則完成雜交試驗。完成雜交之后的DNA 雙鏈將脫離Fe3O4/GO 表面，熒光恢復，再利用磁場磁性分離Fe3O4/GO，通過檢測上清液的熒光強度變化，即對建立的納米復合材料 Fe3O4/GO 熒光探針復合物采用檢測沙門氏菌DNA 的方法進行選擇性分析。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析

每組試驗重復3 次，取平均值。所有光譜圖均扣除其背景吸收，采用Origin 8.5 對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析并繪圖。

2 結果與分析

2.1 氧化石墨烯和磁性氧化石墨烯的結構表征

2.1.1 掃描電鏡(SEM)和透射電鏡(TEM)分析

由圖1-a 掃描電鏡圖可知，GO 的形貌為層狀結構，但也存在層面團聚現(xiàn)象，且有許多褶皺，可增大其比表面積，有利于負載磁性納米粒子，這種特性可使GO 作為載體材料[15]。從圖1-b 可以看出，與GO 相比，F(xiàn)e3O4/GO 的結構發(fā)生了明顯的變化，其表面形貌不規(guī)則且有很多粒徑較小的白色粒子聚合[16]。從圖1-c 可以看出，GO 為不規(guī)則片狀結構，表面光滑，上面有部分褶皺，具備作為載體的優(yōu)勢。由圖1-d 可知，F(xiàn)e3O4的粒徑為10～20 nm，且均勻地附著在GO 表面，表明化學共沉淀法制備的Fe3O4/GO 具有良好的結構。

2.1.2 X 射線衍射(XRD)分析

圖 2 為 GO 和 Fe3O4/GO 的 XRD 圖。兩者都出現(xiàn)了特征衍射峰，但其位置明顯不同。由a 曲線可知，在2θ 為11.54°處出現(xiàn)的強峰對應著GO 特征衍射峰；由 b 曲線可知，在 2θ 為 30.44°、35.53°、43.21°、53.55°、57.14°、63.09°處的特征衍射峰，分別與Fe3O4純立方尖晶石晶體結構中(220)、(331)、(400)、(422)、(511)和(440)的位置相對應[7,16]。其中，2θ為 30.44°、35.53°、43.21°、57.14°處的衍射峰屬于具有磁性的磁赤鐵礦(maghemite)或磁鐵礦(magnetite)，在 2θ 為 53.55°和 63.09°處的衍射峰屬于赤鐵礦(hematite)，這與前面的表征相一致，說明所制備的Fe3O4/GO 中含有Fe3O4晶體[7,17]。

圖2 GO 和Fe3O4/GO 的X 射線衍射結果Fig.2 X-ray diffraction results of GO and Fe3O4/GO

2.1.3 傅里葉變換中遠紅外(FT-IR)分析

圖3 GO 和Fe3O4/GO 不同波數(shù)的紅外光透過率Fig.3 Infrared t ransmittance of G O and F e3O4/GO w ith different wave numbers

由圖3 可知，GO 和Fe3O4/GO 的紅外光圖譜存在差異，說明兩者結構之間存在一定的差異。由 a曲線可知，GO 在3414.10 cm?1處出現(xiàn)一個強吸收峰，可能是由于—OH 的伸縮振動引起的[16]；在1730.01 cm?1和1623.44 cm?1處出現(xiàn)了芳香基C==O和C==C 的特征吸收峰，在1403.42 cm?1、1230.54 cm?1和 1055.96 cm?1處出現(xiàn)的吸收峰可能是由C—OH、O—C—O 和烷氧基C—O 的伸縮振動引起的，說明 GO 結構中含有 C==O、—OH、C==C、O—C—O 等官能團。由 b 曲線可知，F(xiàn)e3O4/GO在 3424.58 cm?1和 1190.76 cm?1處出現(xiàn)了—OH 和O—C—O 的伸縮振動峰，在1574.75 cm?1處C==C的特征吸收峰明顯減弱，1042.81 cm?1處的烷氧基C—O 的吸收峰幾乎消失，在589.31 cm?1指紋區(qū)出現(xiàn)了Fe-O 的伸縮振動峰，說明含氧官能團與Fe3O4磁性納米粒子發(fā)生了化學鍵合作用[18]，證明 Fe3O4磁性納米粒子已附著在GO 表面，F(xiàn)e3O4/GO 已成功合成。

2.2 熒光猝滅機理初探分析

2.2.1 熒光光譜分析

由圖4-A 可知，在未加入Fe3O4/GO 時，沙門氏菌熒光探針在495 nm 激發(fā)波長下，其熒光發(fā)射峰在517 nm 處；當沙門氏菌熒光探針濃度為50 nmol/L時，扣除 Fe3O4/GO 的背景吸收后，其熒光強度F=944.92；由圖4-B 可知，固定沙門氏菌熒光探針濃度(50 nmol/L)不變，當向其溶液中加入不同質量濃度的 Fe3O4/GO 后，沙門氏菌熒光探針的熒光被猝滅，且隨著 Fe3O4/GO 質量濃度的增加，其熒光強度逐漸減小，熒光猝滅率逐漸增大；當Fe3O4/GO質量濃度為 3.2×10?4g/mL 時，其熒光猝滅率可達96.86%，表明 Fe3O4/GO 對沙門氏菌熒光探針有強烈的熒光猝滅作用。由圖 4-C、圖 4-D 可知，在3.2×10?4g/mL 質量濃度下，F(xiàn)e3O4/GO 對沙門氏菌熒光探針的熒光猝滅率高于GO，表明Fe3O4/GO 具有較好的生物相容性，對沙門氏菌熒光探針的熒光猝滅率較高。

2.2.2 紫外(UV)光譜分析

熒光猝滅通常可分為動態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅 2 種類型：動態(tài)猝滅是猝滅劑與熒光團分子之間發(fā)生碰撞致使熒光強度降低的過程；靜態(tài)猝滅是猝滅劑與熒光團形成不發(fā)光靜態(tài)配合物，使得熒光強度降低的過程。熒光猝滅的類型與紫外吸收光譜密切相關，若為動態(tài)猝滅，其紫外吸收光譜不發(fā)生變化；若為靜態(tài)猝滅，其紫外吸收光譜則發(fā)生相應的變化[19-20]。由圖5 可知，沙門氏菌熒光探針的紫外吸收最強，F(xiàn)e3O4/GO 的紫外吸收次之，F(xiàn)e3O4/GO 沙門氏菌熒光探針的紫外吸收最弱，吸收峰紅移且峰形變寬，可能是因為 Fe3O4/GO 與沙門氏菌熒光探針相互作用后，沙門氏菌熒光探針單鏈DNA 堿基上的C-N雜環(huán)與 Fe3O4/GO 碳六環(huán)結構之間存在π-π 堆積作用和靜電引力作用而吸附在Fe3O4/GO 表面[21]，產(chǎn)生了屏蔽效應，使其紫外吸收峰值減弱，吸收峰紅移2 nm，說明形成了基態(tài)的Fe3O4/GO 沙門氏菌熒光探針復合物。而峰形變寬則是因為沙門氏菌熒光探針與Fe3O4/GO 之間存在著強烈的離子和π-π 堆積效應[22]。根據(jù)猝滅后發(fā)生變化的紫外吸收光譜，可初步判斷 Fe3O4/GO 對沙門氏菌熒光探針的熒光猝滅屬于靜態(tài)猝滅。

2.2.3 Fe3O4/GO 對沙門氏菌熒光探針的猝滅機理

為了進一步判斷熒光猝滅的類型，則需計算出熒光猝滅劑與熒光物質之間的動態(tài)熒光猝滅速率常數(shù)(kq)、結合常數(shù)(K)等[20]。若為動態(tài)猝滅，應符合 Stern-Volmer 方程[22-23]。

式(1)中：F0為未加入熒光猝滅劑時的熒光強度；F 為加入熒光猝滅劑后的熒光強度；[Q]為熒光猝滅劑濃度(g/mL)；τ0為無熒光猝滅劑時的生物大分子平均熒光壽命，取τ0=10?8s[20]；kq為動態(tài)熒光猝滅速率常數(shù)；Ksv為Stern-Volmer 動態(tài)猝滅常數(shù)。

根據(jù)不同溫度下Fe3O4/GO 的熒光猝滅光譜圖，可得 F0/F－[Q]的 Stern-Volmer 關系圖，如圖 6 所示。

圖 6 Fe3O4/GO 對沙門氏菌熒光探針的熒光猝滅Stern-Volmer 結果Fig.6 Fluorescence que nching S tern-Volmer r esults o f Fe3O4/GO against salmonella fluorescent probe

若猝滅類型為靜態(tài)猝滅，應符合 Lineweaver-Burk方程[24]。

式(3)中，K 為靜態(tài)熒光猝滅結合常數(shù)，單位為mL/g。根據(jù)不同溫度下Fe3O4/GO 的熒光猝滅光譜圖，可得(F0-F)?1-[Q]?1的 Lineweaver-Burk 關系圖，如圖7 所示。

圖 7 Fe3O4/GO 對沙門氏菌熒光探針的熒光猝滅Lineweaver-Burk 結果Fig.7 Fluorescence quenching of the salmonella fluorescent results by Fe3O4/GO Lineweaver-Burk plot

由圖6、圖7 及式(1)、(2)、(3)可分別求得不同溫度下 Fe3O4/GO 與沙門氏菌熒光探針的 Ksv、Kq和K 值，如表2 所示。

若熒光猝滅過程為動態(tài)猝滅，在一定溫度范圍內，其分子活化能隨溫度的升高而不斷增大，增加了熒光猝滅劑與熒光分子團之間的有效碰撞，從而加快熒光猝滅速率，使得Stern-Volmer 直線斜率、Ksv及Kq值均增大。由圖6、表2 可知，F(xiàn)0/F 與[Q]呈良好的線性關系，隨著溫度的升高，Stern-Volmer直線斜率、Ksv及 Kq值均減小。在 37、40、43 ℃時，F(xiàn)e3O4/GO 與沙門氏菌熒光探針的 Kq分別為1.58×1012、9.00×1011、7.25×1011mL/(g·s)，故其 Kq值大于動態(tài)猝滅中的最大擴散碰撞猝滅常數(shù)[20]，初步證明了 Fe3O4/GO 對沙門氏菌熒光探針的猝滅過程不是動態(tài)猝滅。

表2 不同溫度下Fe3O4/GO 與沙門氏菌熒光探針相互作用常數(shù)Table 2 Interaction constants of Fe3O4/GO and salmonella fluorescent probes at different

由圖 7、表 2 可知，(F0-F)?1與[Q]?1呈良好的線性關系，隨著溫度的升高，Lineweaver-Burk 直線斜率增大，結合常數(shù) K 減小，這與 Lineweaver-Burk方程相符合。說明Fe3O4/GO 對沙門氏菌熒光探針的熒光猝滅不是由熒光猝滅劑與熒光分子之間的碰撞所引起的動態(tài)猝滅，而是由于兩者之間發(fā)生非輻射能量轉移生成復合物所引起的靜態(tài)猝滅[20]。由表 2可知，其結合常數(shù)K 較大，說明Fe3O4/GO 與沙門氏菌熒光探針之間所形成的復合物較穩(wěn)定，這是由于沙門氏菌熒光探針單鏈DNA 堿基上的C-N 雜環(huán)能與Fe3O4/GO 碳六環(huán)結構之間存在π-π 堆積作用而吸附在 Fe3O4/GO 表面[21]。

2.3 Fe3O4/GO 沙門氏菌熒光探針復合物的選擇性分析

為了驗證 Fe3O4/GO 沙門氏菌熒光探針復合物的選擇性，分別對相同濃度的沙門氏菌 DNA 序列和單堿基配錯序列(MT1)、雙堿基配錯序列(MT2)和三堿基配錯序列(MT3)進行熒光強度測定，結果如圖8 所示，MT1、MT2 和MT3 的熒光強度遠低于沙門氏菌 DNA 序列所對應的熒光強度，說明所建立的 Fe3O4/GO 熒光探針復合物檢測沙門氏菌DNA 具有良好的選擇性。

圖8 Fe3O4/GO 沙門氏菌熒光探針復合物的熒光強度Fig.8 Fluorescence i ntensity of Fe 3O4/GO salm onella flu orescent probe complex

3 結論

本研究中，以 GO 為載體，采用化學共沉淀法制備了Fe3O4/GO，并分別采用SEM、TEM、XRD、FT-IR 對GO 和Fe3O4/GO 的結構進行了對比表征；在此基礎上，分析了Fe3O4/GO 對沙門氏菌熒光探針猝滅的機理。結果表明：所制備的Fe3O4/GO 結構良好；Fe3O4/GO 具有熒光猝滅作用，當Fe3O4/GO 質量濃度為 3.2×10?4g/mL 時，熒光猝滅率可達96.86%；其猝滅機理為靜態(tài)猝滅；結合常數(shù)K 較大，兩者之間所形成的復合物較穩(wěn)定，對沙門氏菌DNA的檢測具有良好的選擇性。可為下一步更深層次地探究其熒光猝滅機理提供依據(jù)，為后續(xù)利用Fe3O4/GO 對熒光的猝滅作用及磁分離技術在沙門氏菌及其他致病菌檢測方面提供技術支撐。