劉思凡，劉子雨，李萍，吳莉，黃浩然，單守明*

(1.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川 750021；2.寧夏大學(xué)葡萄酒學(xué)院，寧夏 銀川 750021)

葡萄漿果中的酚類物質(zhì)含量豐富，結(jié)構(gòu)復(fù)雜。依據(jù)其化學(xué)結(jié)構(gòu)主要可分為類黃酮酚和非類黃酮酚兩大類[1]。酚類物質(zhì)的含量及其組成成分對于葡萄的果實(shí)品質(zhì)以及葡萄酒的外觀、口感、穩(wěn)定性等有重要影響，其含量和種類在不同的種及品種間表現(xiàn)出顯著差異。URCAN 等[2]研究表明，圓葉葡萄中含有較多的鞣花酸類多酚物質(zhì)。不同品種的圓葉葡萄中鞣花酸含量的變化規(guī)律也有所不同[3]。山葡萄中總花色苷的含量高于歐亞種葡萄，以雙糖苷為主，而歐亞種葡萄的花色苷則以單糖苷為主[4]。野生白色毛葡萄的總酚含量高于‘雷司令’和‘白羽’[5]。釀酒葡萄品種中的白藜蘆醇含量顯著高于鮮食葡萄品種[6]。

歐山種葡萄是中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物研究所利用中國野生山葡萄和歐亞栽培品種雜交育成的釀酒葡萄品種，果實(shí)品質(zhì)優(yōu)良，抗寒、抗病性較好[7]。寧夏賀蘭山東麓產(chǎn)區(qū)地理?xiàng)l件優(yōu)越，是公認(rèn)的釀酒葡萄生長最佳生態(tài)區(qū)之一[8]。筆者選擇賀蘭山東麓產(chǎn)區(qū)歐山種 6 個(gè)紅色釀酒品種(品系)為研究對象，對其成熟期酚類物質(zhì)含量及其合成相關(guān)基因苯丙氨酸裂解酶基因(PAL)、肉桂酸–4–羥化酶基因(C4H)、類黃酮 3'–羥化酶基因(F3'H)、類黃酮 3'，5'–羥化酶基因(F3'5'H)相對表達(dá)量進(jìn)行綜合分析，以期為寧夏產(chǎn)區(qū)篩選較適宜推廣的歐山種釀酒葡萄品種(品系)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為2013 年定植的6 個(gè)歐山種紅色釀酒葡萄品種(品系)北紅、北玫、北璽、北馨、新北醇、北醇。

1.2 方法

試驗(yàn)于2018 年10 月上旬在寧夏賀蘭山東麓平吉堡農(nóng)業(yè)科技示范園進(jìn)行。

選取無病蟲害、著生方向一致的葡萄果穗3 穗，在每穗果的中部采集果粒60 粒，除梗后液氮速凍，研磨成粉，置于–80 ℃冰箱保存，備用。

1.2.1 酚類物質(zhì)的測定

葡萄果實(shí)樣品單寧的含量采用 Folin–Denis 比色法[9]測定，總酚采用 Folin–Ciocalteu 比色法[9–10]測定。

參照文獻(xiàn)[11–12]方法，提取葡萄果實(shí)單體酚，測定蘆丁、表兒茶素、白藜蘆醇、咖啡酸、沒食子酸、兒茶素含量。

1.2.2 葡萄果實(shí)酚類合成相關(guān)基因表達(dá)量的測定

葡萄果實(shí)樣品中總RNA的提取按照TIANGEN RNAprep Pure 多糖多酚植物總RNA 提取試劑盒說明書進(jìn)行。以總RNA 為模板，用Takara PrimeScript TM RT regent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real–Time)試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄與純化。選取EF 基因?yàn)閮?nèi)參基因，基因PAL、C4H、F3'H、F3'5'H 的引物如表1 所示，由上海生工生物工程有限公司設(shè)計(jì)完成。

PCR 反應(yīng)體系 25 μL：模板 DNA 1 μL(模板濃度 200 ng/μL)，上、下游引物各 0.5 μL，2×UltraSYBR Mixture(CWBIO) 12.5 μL，ddH2O 10.5 μL。反應(yīng)程序采用2 步法：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性 15 s，60 ℃退火/延伸 1 min，40 個(gè)循環(huán)。每次循環(huán)第2步進(jìn)行熒光采集，以ddH2O 代替cDNA 的NTC 為對照，所有PCR 反應(yīng)設(shè)置3 次生物學(xué)重復(fù)。試驗(yàn)結(jié)果參照 HASHIMTO 等[13]的方法，用 2–△△Ct對數(shù)據(jù)進(jìn)行定量分析。

表1 qRT-PCR 引物序列Table 1 Primer sequences of real-time fluorescence quantitative PCR

1.3 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用DPS 7.05、Excel 2007 和Sigma Plot 12.5處理和分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 歐山種釀酒葡萄果實(shí)酚類物質(zhì)的含量

2.1.1 不同品種(品系)間總酚和單寧含量的差異

由表2 可以看出，北紅葡萄果實(shí)總酚和單寧含量最高，分別為13.60 mg/g 和4.69 mg/g，與其余品種(品系)的差異顯著，北醇總酚含量最低，僅為3.15 mg/g；除北紅外，其余品種(品系)單寧含量均較低。

2.1.2 不同品種(品系)間白藜蘆醇含量的差異

歐山種葡萄果實(shí)中白藜蘆醇含量都較低，含量為0.08～4.90 mg/kg，平均含量1.04 mg/kg。北紅果實(shí)中白藜蘆醇含量顯著高于其余品種(品系)的，達(dá)到4.9 mg/kg，北璽的白藜蘆醇含量僅為北紅含量的19%，但也顯著高于其余4 個(gè)品種(品系)的。

2.1.3 不同品種(品系)間酚酸類物質(zhì)含量的差異

北紅果實(shí)中咖啡酸和沒食子酸的含量均最高，分別為5.92 mg/kg 和3.15 mg/kg；北璽果實(shí)中酚酸含量與北玫、北馨咖啡酸和沒食子酸含量差異不顯著，但顯著高于其余 3 個(gè)品種(品系)；北馨果實(shí)中沒食子酸含量較高，為2.17 mg/kg，其咖啡酸含量最低，僅為0.56 mg/kg；北玫果實(shí)中沒食子酸和咖啡酸含量分別為1.83 mg/kg 和0.98 mg/kg，咖啡酸和沒食子酸總量僅低于北紅和北璽。

2.1.4 不同品種(品系)間黃酮類物質(zhì)含量的差異

歐山種葡萄果實(shí)的蘆丁含量都較高，北紅蘆丁含量最高，為28.35 mg/kg，與其余品種(品系)的差異顯著。葡萄果實(shí)中兒茶素含量遠(yuǎn)高于表兒茶素，北紅表現(xiàn)差異最顯著，北璽果實(shí)中表兒茶素含量僅低于北馨的，為 8.79 mg/kg，兒茶素含量為 17.53 mg/kg，顯著低于北紅和北醇的；北馨果實(shí)中表兒茶素含量顯著高于其他品種的，為9.49 mg/kg；北玫果實(shí)中表兒茶素和兒茶素含量均較低，北醇 11號果實(shí)中兒茶素含量較高，為19.2 mg/kg，表兒茶素含量較低，為2.05 mg/kg；新北醇果實(shí)中表兒茶素含量顯著高于北醇，兒茶素含量顯著低于北醇的。

表2 供試歐山種釀酒葡萄品種(品系)果實(shí)中酚類物質(zhì)的含量Table 2 Polyphenols content in fruits of different wine grape varieties

2.2 歐山種釀酒葡萄果實(shí)酚類物質(zhì)合成相關(guān)基因的相對表達(dá)量

由圖1 可知，6 個(gè)葡萄品種(品系)中，北紅PAL和C4H 基因相對表達(dá)量均最高，而北玫PAL 和C4H基因相對表達(dá)量均最低。與對照新北醇相比，北馨PAL 基因的表達(dá)上調(diào)，C4H 基因的表達(dá)下調(diào)，PAL相對表達(dá)量顯著高于C4H 的；北璽PAL 和C4H 基因的相對表達(dá)量均上調(diào)，但C4H 的相對表達(dá)量顯著高于PAL 的；北醇PAL 和C4H 基因均表達(dá)上調(diào)。

與對照相比，北璽F3'H 和F3'5'H 基因的表達(dá)均上調(diào)且相對表達(dá)量較高，北醇、北紅F3'H 基因的表達(dá)均上調(diào)，F(xiàn)3'5'H 基因的表達(dá)下調(diào)；北醇F3'5'H 表達(dá)下調(diào)，北玫和北馨F3'H 和F3'5'H 基因表達(dá)均下調(diào)。

圖1 歐山種釀酒葡萄果實(shí)酚類物質(zhì)合成相關(guān)基因的相對表達(dá)量Fig.1 Comparison of expression levels of phenolic compounds related genes in fruit of hybrid of Vitis vinifera and Vitis amurensis wine grapes during maturity

2.3 歐山種釀酒葡萄果實(shí)酚類物質(zhì)合成相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平與單體酚含量的相關(guān)性

歐山種葡萄果實(shí)單體酚含量與酚類物質(zhì)合成相關(guān)基因相對表達(dá)量的相關(guān)系數(shù)(表3)表明：北紅葡萄咖啡酸和表兒茶素含量與 F3'5'H 基因相對表達(dá)量呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)均為0.99；蘆丁含量與C4H 基因相對表達(dá)量呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.99。北璽葡萄蘆丁含量與C4H 基因和F3'5'H 相對表達(dá)量分別呈顯著、極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為 0.99 和 1.00。

表3 北紅和北璽葡萄果實(shí)單體酚含量與合成相關(guān)基因相對表達(dá)量的相關(guān)系數(shù)Table 3 Correlation coefficients between the monomeric phenols in Be ihong and Be ixi gr ape f ruit and the r elative expression of synthetic related genes

3 討論

葡萄果實(shí)中的酚類物質(zhì)成分高度依賴葡萄品種，對葡萄酒的外觀、收斂性、入口性和保健性以及酒體質(zhì)量起決定性作用[14]。JEANDET[15]研究結(jié)果表明，白藜蘆醇含量與品種密切相關(guān)，并在果實(shí)成熟過程中不斷減少。本研究結(jié)果表明，歐山種葡萄果實(shí)的白藜蘆醇含量為0.08～ 4.90 mg/kg，平均含量為1.04 mg/kg；沒食子酸含量相較于咖啡酸含量在葡萄品種(品系)中差異較大，這與MOSKOWITZ[16]

研究結(jié)果相一致。黃酮醇類物質(zhì)的含量較高，北紅積累的類黃酮物質(zhì)(蘆丁)含量較多，相比于歐亞種葡萄中(兒茶素和表兒茶素)[17]，歐山種葡萄中的遠(yuǎn)低于歐亞種葡萄的。

葡萄成熟過程中，葡萄果實(shí)中酚類物質(zhì)通過苯丙氨酸代謝途徑持續(xù)積累。酚類物質(zhì)的種類和含量在不同葡萄種、品種、品系間呈顯著差異，這主要與葡萄果實(shí)中酚類合成基因的調(diào)控有關(guān)，花色苷合成主要受到PAL、C4H、F3'H、F3'5'H 等基因的調(diào)控。歐山種葡萄除北玫外，其余品種與對照新北醇相比PAL 基因表達(dá)均上調(diào)，北紅PAL 基因相對表達(dá)量是對照的 20 倍以上，這與孫潤澤等[18]研究結(jié)果相似。C4H 基因表達(dá)上調(diào)，可以增加苯丙烷代謝酚酸類物質(zhì)(香豆酸、阿魏酸和咖啡酸)的合成[19]，酚酸類物質(zhì)與 C4H 基因呈現(xiàn)相關(guān)性，但本研究中北紅、北玫的咖啡酸含量與C4H 基因相關(guān)程度低，可能是歐山種葡萄綜合抗性比歐亞種葡萄強(qiáng)，不完全依靠肉桂酸–4–羥化酶合成的香豆酸、阿魏酸和咖啡酸等病原菌抑制物，也能在不利條件下進(jìn)行正常的生長發(fā)育。F3'H 和F3'5'H 在類黃酮合成途徑中分別參與合成二氫槲皮素和二氫楊梅酮，二者進(jìn)而形成花青素和花萃素類花色苷。趙權(quán)[20]研究發(fā)現(xiàn)雙紅山葡萄成熟期F3'5'H 轉(zhuǎn)錄水平高于F3'H 的轉(zhuǎn)錄水平。而在本試驗(yàn)中，只有北玫表現(xiàn)與雙紅相似，其余品種(品系)均表現(xiàn)相反的情況，這可能與品種特性、產(chǎn)地和年份等有關(guān)。