胡蓉，汪慧慧，劉勇，熊興華*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.作物基因工程湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128)

三酰甘油合成過(guò)程是油菜油脂合成的重要步驟之一[1]。三酰甘油合成過(guò)程中，以甘油三磷酸(glycerol-3-phosphate，G3P)和?；o酶 A(acyl-CoA)為底物，在甘油-3-磷酸酰基轉(zhuǎn)移酶(snglycerol-3-phosphate acyltransferase，GPAT)[2-3]、溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶(lysophospholipid acyltransferase，LPAT 或 LPAAT)[4-5]、磷脂酸磷酸酶(phosphatidate phosphatase，PAP)[6]、二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶(diacylglycerol acyltransferase，DGAT)[7-8]等多種酶的作用下生成三酰甘油(triacylglycerol，TAG)。在該油脂合成過(guò)程中，溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶是關(guān)鍵酶之一。

CHEN 等[9]研究表明，花生LPAT 基因轉(zhuǎn)錄水平與花生種子的含油量有關(guān)，在種子不同的發(fā)育階段，高油花生種子中 LPAT 基因的轉(zhuǎn)錄水平比低油品種的高。ZOU 等[10]將酵母中克隆得到的 LPAAT基因轉(zhuǎn)入甘藍(lán)型油菜中，得到的轉(zhuǎn)基因油菜種子含油量顯著提高。MAISONNEUVE 等[11]將甘藍(lán)型油菜BnaLPAT 基因轉(zhuǎn)入擬南芥中過(guò)表達(dá)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因株系種子的含油量顯著提高。張軍平等[12]發(fā)現(xiàn)LPAAT 基因在酵母中的表達(dá)不僅提高了脂肪酸的含量，還能夠有選擇性地將不飽和脂肪酸結(jié)合到甘油三酯中。陳四龍[13]的研究表明，溶血磷脂酸酰基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)量與種子含油量的積累變化一致。在擬南芥數(shù)據(jù)庫(kù)中，已有5 個(gè)擬南芥AtLPAT (AtLPAT1、AtLPAT2、AtLPAT3、AtLPAT4、AtLPAT5)獲得注釋?zhuān)渲?，AtLPAT1、AtLPAT2、AtLPAT3 與植物正常發(fā)育相關(guān)。

目前許多基因的功能需要通過(guò)轉(zhuǎn)基因手段來(lái)驗(yàn)證[14]。本研究中，對(duì)BnaLPAT2 基因構(gòu)建過(guò)表達(dá)載體和種子特異性表達(dá)載體，將構(gòu)建好的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入擬南芥中并檢測(cè)分析其轉(zhuǎn)基因植株的脂肪酸含量，以期為進(jìn)一步研究甘藍(lán)型油菜BnaLPAT2 基因的功能提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試野生型擬南芥(Arabidopsis thaliana)為哥倫比亞型(Columbia)。野生型擬南芥、農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)GV3101 菌株與植物表達(dá)載體 pBI121 均由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)作物基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

限制性內(nèi)切酶 Sac Ⅰ、Hind Ⅲ、BamH Ⅰ、DNA Marker、T4DNA 連接酶、抗生素等購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；瓊脂糖購(gòu)自博日科技有限公司；pUCm-T 克隆載體、DNA 質(zhì)粒提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒等購(gòu)自上海生工生物科技有限公司；引物合成和測(cè)序由擎科生物技術(shù)有限公司完成。

擬南芥浸染緩沖液：大量元素5 mL/(100 mL)；微量元素1 mL/(100 mL)；鐵鹽1 mL/(100 mL)；蔗糖3 g/(100 mL)；Silwet-77為30 μL。定容至100 mL。

1.2 方法

1.2.1 構(gòu)建p35S-BnaLPAT2 過(guò)表達(dá)載體

在甘藍(lán)型油菜BnaLPAT2–A04 基因克隆的上游引物的5' 添加BamH Ⅰ(GGATCC)限制性內(nèi)切酶和保護(hù)堿基(CG)，即 BnaLPAT2-A04–F，(CGGGA TCC)GTCGTTGATTCATTCCCTGTC；下游引物5'添加Sac Ⅰ(GAGCTC)限制性內(nèi)切酶和保護(hù)堿基(C)，即BnaLPAT2-A04–R，(CGAGCTC)AGCTTCTT GTTGTGTATGTCG，以攜帶目的基因的 T 載體為模板，用上述引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系：DNA 模板 1 μL、2.5 mmol/L dNTP 2 μL、10×Buffer 2 μL、Taq 酶 0.5 μL、BnaLPAT2-F/BnaLPAT2-R 各0.75 μL、ddH2O 13 μL。PCR 反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性 3 min；94 ℃變性 45 s，54 ℃退火 45 s，72 ℃延伸90 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。隨后將PCR反應(yīng)產(chǎn)物在 1%的瓊脂糖凝膠中電泳檢測(cè)，回收目的片段。用BamH Ⅰ和Sac Ⅰ對(duì)目的片段和pBI121載體分別進(jìn)行雙酶切，酶切體系(50 μL)：DNA 10 μL、10×Buffer FD 5 μL、BamH Ⅰ 2 μL、Sac Ⅰ 2 μL、ddH2O 31 μL。37 ℃反應(yīng)3 h。反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行瓊脂糖凝膠檢測(cè)并膠回收備用。將膠回收后的目的基因和表達(dá)載體 pBI121 進(jìn)行連接反應(yīng)，使目的基因替換原載體上的GUS 基因，構(gòu)建p35S-BnaLPAT2 過(guò)表達(dá)載體。連接體系(10 μL)：insert DNA 3 μL、pBI121 DNA 1 μL、T4DNA連接酶0.5 μL、10×Buffer 1 μL、ddH2O 4.5 μL。16 ℃連接過(guò)夜并轉(zhuǎn)化大腸埃希菌感受態(tài)細(xì)胞。挑取菌落進(jìn)行PCR 鑒定。對(duì)鑒定出的陽(yáng)性菌落進(jìn)行測(cè)序，以確保載體構(gòu)建的準(zhǔn)確性。

1.2.2 構(gòu)建pNapin-BnaLPAT2 種子特異性表達(dá)載體

通過(guò)甘藍(lán)型油菜數(shù)據(jù)庫(kù)查找 Napin 啟動(dòng)子序列。根據(jù)序列設(shè)計(jì)引物 Napin-F(AAGCTT GTTCA AGCGAATGGCATACCG)和Napin-R(GGATCCTG TTTGTATTGATGAGTTTTGG)，下劃線為限制性內(nèi)切酶。

以甘藍(lán)型油菜‘湘油 15’的 DNA 為模板。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系(20 μL)：DNA 1 μL、2.5 mmol/L dNTP 2 μL、10×Buffer 2 μL、Napin-F/Napin-R 各 0.75 μL、Taq 酶 0.5 μL、ddH2O 13 μL。PCR 反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性 3 min；94 ℃變性 45 s，52 ℃退火 45 s，72℃延伸 90 s；35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。隨后將PCR 反應(yīng)產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠中電泳檢測(cè)，回收目的片段。將膠回收后的目的片段與pUCm-T載體連接。連接體系(10 μL)：目的片段 3 μL、pUCm-T Vector 0.5 μL、10×Ligation Buffer 1 μL、50% PEG 4000 1 μL、T4DNA Ligase 1 μL，加 ddH2O至10 μL。16 ℃連接過(guò)夜并轉(zhuǎn)化大腸埃希菌感受態(tài)細(xì)胞。篩選出陽(yáng)性菌落，使用T-vector 的通用引物M13-F/M13-R，以陽(yáng)性菌落為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。選取陽(yáng)性菌落搖菌測(cè)序。

用 Hind Ⅲ和 BamH Ⅰ對(duì)過(guò)表達(dá)載體 p35SBnaLPAT2 和攜帶Napin 啟動(dòng)子的T 載體分別進(jìn)行酶切。酶切體系(50 μL)：DNA 10 μL、10×BufferFD 5 μL、Hind Ⅲ 2 μL、BamH Ⅰ2 μL、ddH2O 31 μL。37 ℃反應(yīng)3 h。反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行瓊脂糖凝膠檢測(cè)并膠回收備用。膠回收Napin 啟動(dòng)子目的片段和過(guò)表達(dá)載體 p35S-BnaLPAT2 大片段后進(jìn)行連接，使Napin 啟動(dòng)子取代 CaMV35S 啟動(dòng)子，構(gòu)建pNapin-BnaLPAT2 種子特異性表達(dá)載體。連接體系(5 μL)：Napin 2.5 μL，載體 DNA 1 μL，T4 DNA連接酶 0.5 μL，10×Buffer 1 μL，16 ℃過(guò)夜連接，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌感受態(tài)細(xì)胞。挑取單菌落進(jìn)行PCR鑒定。對(duì)鑒定出的陽(yáng)性菌落進(jìn)行測(cè)序，以確保載體構(gòu)建的準(zhǔn)確性。

1.2.3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化擬南芥

采用 SanPrep 柱式質(zhì)粒 DNA 小量抽提試劑盒分別提取 p35S-BnaLPAT2 過(guò)表達(dá)載體和 pNapin-BnaLPAT2 種子特異性表達(dá)載體的質(zhì)粒。用 CaCl2凍融法將 p35S-BnaLPAT2 過(guò)表達(dá)載體和 pNapin-BnaLPAT2 種子特異性表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101，將含有重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌接種在含有卡拉霉素(50 mg/L)和利福平(50 mg/L)的YEB 固體培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)2～3 d。挑選單克隆菌落PCR 鑒定，-70 ℃保存陽(yáng)性菌株，備用。采用農(nóng)桿菌花絮浸染法轉(zhuǎn)化擬南芥，將轉(zhuǎn)化后收獲的種子平鋪于含有卡拉霉素(50 mg/L)的1/2 MS 固體培養(yǎng)基上篩選T0 代。將T0 代植株種植于植物培養(yǎng)箱(溫度24 ℃，光周期16 h/8 h)，收獲T0 代種子后再次篩選，直到篩選到純合株系。從轉(zhuǎn)基因擬南芥植株葉片中提取總DNA，對(duì)其進(jìn)行PCR 檢測(cè)。為保證目的基因轉(zhuǎn)化的可靠性，設(shè)計(jì)啟動(dòng)子和目的基因的引物35S-F(GTCTCTTACGACTCAATGACA)、BnaLPAT 2-R1(ATACTCGGAGAACCACATTGA)和Napin-F(T TCAAACCGTTCGGCTCCTAT)、BnaLPAT2-R2(TAA GTT TTGCCTCTGTGAAGC)。同時(shí)用Kan+基因引物對(duì)陽(yáng)性苗進(jìn)行抗性檢測(cè)，其擴(kuò)增產(chǎn)物大小為730 bp，所用引物：Kan+-F，CTATGACTGGGCACAACAGAC；Kan+-R，GCAATATCACGGGTAGCCAAC。

1.2.4 測(cè)定擬南芥種子脂肪酸成分

參照王昌倫[15]的方法測(cè)定擬南芥脂肪酸成分。收集一定量純合株系的種子，去除雜質(zhì)后置于37 ℃恒溫箱烘干至恒重，以相同條件下生長(zhǎng)的野生型擬南芥種子為對(duì)照，用氣相色譜儀檢測(cè)種子脂肪酸組分，3 次重復(fù)。檢測(cè)前的準(zhǔn)備：取20 mg 左右的種子放置在2 mL 的離心管中，充分研磨至粉末；加入4 mL 2%硫酸甲醇溶液，90 ℃萃取40 min 左右，預(yù)冷；加入5 mL ddH2O 和3 mL 正己烷，漩渦混勻，離心1 min；吸取500 μL 上清液至瓶中，上機(jī)，進(jìn)行氣相色譜分析。色譜儀型號(hào)為 Agilent 7890，進(jìn)樣量1 μL。柱箱加熱程序：初始溫度180 ℃，以20℃/ min 升溫至250 ℃，保持10 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物表達(dá)載體的構(gòu)建

以植物雙元表達(dá)載體pBI121 為骨架，改造過(guò)表達(dá)載體。pBI121-BnaLPAT2 過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建過(guò)程如下：根據(jù)pBI121 上原有的酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)兩端帶有BamH Ⅰ和 Sac Ⅰ的特異引物 BnaLPAT2-F、BnaLPAT2-R，采用雙酶切的方法，分別酶切原有載體的GUS 基因和pT-BnaLPAT2 載體，經(jīng)T4連接酶連接、大腸埃希菌感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化、重組質(zhì)粒的鑒定獲得所需的過(guò)表達(dá)載體，并將其命名為 p35SBnaLPAT2(圖1-a)。種子特異性表達(dá)載體的構(gòu)建過(guò)程如下：根據(jù)pBI121 上原有的酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)兩端帶有Hind Ⅲ和BamH Ⅰ的特異引物Napin-F、Napin-R，以‘湘油 15’的 DNA 為模板，PCR 擴(kuò)增 Napin 啟動(dòng)子，獲得694 bp 的目的片段。用相同的限制性內(nèi)切酶切除pBI121-BnaLPAT2 載體上的組成型啟動(dòng)子35S，經(jīng)T4酶連接、大腸埃希菌細(xì)胞轉(zhuǎn)化、重組質(zhì)粒的鑒定，獲得所需的種子特異性表達(dá)載體，并將其命名為 pNapin-BnaLPAT2(圖 1-b)。

圖1 植物表達(dá)載體的構(gòu)建結(jié)果Fig.1 Plant expression vector construction diagram

2.2 重組質(zhì)粒的鑒定

用BamH Ⅰ和Sac Ⅰ分別雙酶切pT-BnLPAT2和pBI121，回收目的條帶，連接并轉(zhuǎn)化大腸埃希菌感受態(tài)細(xì)胞，構(gòu)建過(guò)表達(dá)載體p35S-BnaLPAT2。從雙酶切鑒定結(jié)果(圖2-a)可以看出，經(jīng)雙酶切，獲得與預(yù)期大小(1372 bp)一致的目的片段，說(shuō)明過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建成功。用Hind Ⅲ、BamH Ⅰ分別雙酶切攜帶種子特異性啟動(dòng)子 Napin 的 T 載體和p35S-BnaLPAT2 過(guò)表達(dá)載體，回收目的條帶，連接并轉(zhuǎn)化大腸埃希菌感受態(tài)細(xì)胞，構(gòu)建種子特異性表達(dá)載體。從雙酶切鑒定結(jié)果可以看出，獲得了與預(yù)期大小(694 bp)一致的目的片段(圖2-b)，說(shuō)明種子特異性表達(dá)載體構(gòu)建成功。

圖2 BnaLPAT2 重組質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果Fig.2 Enzymatic identification of recombinant plasmid of BnaLPAT2

2.3 轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株的獲得

2.3.1 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌

采用凍融法將重組質(zhì)粒 p35S-BnaLPAT2 和pNapin-BnaLPAT2 分別轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞GV3101 中，并在含有卡那霉素(50 mg/L)和利福平(50 mg/L)的培養(yǎng)基上培養(yǎng)2～3 d，挑取長(zhǎng)勢(shì)良好的單菌落進(jìn)行菌落PCR 鑒定。結(jié)果如圖3 所示，擴(kuò)增出與目的條帶大小(1375 bp)一致的條帶，說(shuō)明植物過(guò)表達(dá)載體已成功轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌中。

圖3 農(nóng)桿菌菌落PCR 鑒定結(jié)果Fig.3 PCR results of Agrobacterium tumefaciens colony identification

2.3.2 擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化

采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法(浸花法)轉(zhuǎn)化擬南芥。正常培養(yǎng)擬南芥1 個(gè)月后側(cè)枝開(kāi)花，在盛花期進(jìn)行花序浸染，隔5 d 左右再次浸染，總共浸染3 次。待種子成熟后收取 T0 代的種子。將得到的 T0 代種子37 ℃烘干后，經(jīng)消毒、清洗之后鋪在含有卡那霉素抗性的1/2 MS 培養(yǎng)基上繼續(xù)篩選，直至培養(yǎng)基上種子全部發(fā)芽且長(zhǎng)勢(shì)良好(圖4)。

圖4 擬南芥轉(zhuǎn)化植株的抗性篩選結(jié)果Fig.4 Screening of Arabidopsis thaliana transformed plants

2.3.3 轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株的鑒定

取抗性篩選的轉(zhuǎn)基因植株抽薹期的幼嫩葉片，提取總DNA 并進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。為保證結(jié)果的準(zhǔn)確性，對(duì)每個(gè)植株設(shè)計(jì)不同的引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。根據(jù) Napin/35S 啟動(dòng)子和目的基因的序列設(shè)計(jì) 1 對(duì)引物，目的條帶為1000 bp；根據(jù)抗性標(biāo)簽Kan+設(shè)計(jì)1對(duì)引物，目的條帶為730 bp。通過(guò)PCR 擴(kuò)增(圖5)，2 對(duì)引物均擴(kuò)增出目的條帶(大小分別為 1000、730 bp)，證明擬南芥植株已經(jīng)整合了外源目的基因。

圖5 部分轉(zhuǎn)基因植株的PCR 檢測(cè)結(jié)果Fig.5 PCR detection of some transgenic plants

2.4 轉(zhuǎn)基因植株的脂肪酸含量分析

為了分析外源基因BnaLPAT2 對(duì)脂肪酸含量的影響，采用氣相色譜測(cè)定純合擬南芥株系種子中各類(lèi)脂肪酸的含量。選用在同一生長(zhǎng)環(huán)境下成熟度一致、種子飽滿度較好的野生型、pNapin-BnaLPAT2、p35S-BnaLPAT2 的轉(zhuǎn)基因純合株系的種子，烘干后研磨成粉末狀，經(jīng)甲酯化后進(jìn)行氣相色譜分析，測(cè)定擬南芥種子中的脂肪酸含量。

圖6 轉(zhuǎn)基因擬南芥脂肪酸分析Fig 6 Analysis of fatty acids in transgenic Arabidopsis

比較轉(zhuǎn)基因擬南芥與野生型擬南芥脂肪酸的含量(圖6)，發(fā)現(xiàn)2 種轉(zhuǎn)基因擬南芥中亞麻酸(C18∶3)含量大幅度提高，平均提高了20%。種子特異性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的 BnaLPAT2 轉(zhuǎn)基因株系中，亞油酸(C18∶2)和亞麻酸(C18∶3)的相對(duì)含量均明顯提高，分別增長(zhǎng) 1.04、2.73；35S 啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的BnaLPAT2 轉(zhuǎn)基因株系中，亞麻酸(C18∶3)的相對(duì)含量增加3.2，亞油酸(C18∶2)的相對(duì)含量降低0.7，油酸(C18∶1)的相對(duì)含量降低1.3。通過(guò)轉(zhuǎn)基因擬南芥種子甘油三酯脂肪酸組分分析，推測(cè) BnaLPAT2對(duì)亞麻酸(C18∶3)的親和力高于對(duì)亞油酸(C18∶2)和油酸(C18∶1)的親和力。

3 結(jié)論與討論

LPAT 是TAG 生物合成中的重要限速酶，TAG是油料作物種子中的主要儲(chǔ)藏物質(zhì)。TAG 合成的主要過(guò)程在質(zhì)體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上完成，碳原子數(shù)小于 16的主要在質(zhì)體上合成，碳原子數(shù)大于 16 的主要在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上合成[16-17]。

將不同啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的BnaLPAT2 基因轉(zhuǎn)入擬南芥中過(guò)表達(dá)，從測(cè)定的脂肪酸含量來(lái)看，轉(zhuǎn)基因植株中亞麻酸含量大幅度提高，說(shuō)明LPAT2 基因在油脂合成中的底物選擇上更偏向于亞麻酸。本研究中，pNapin-BnaLPAT2 和 p35S-BnaLPAT2 的轉(zhuǎn)基因株系中，亞油酸和亞麻酸均有不同幅度的提高，說(shuō)明LPAT2基因過(guò)表達(dá)對(duì)甘油三酯中亞油酸和亞麻酸含量的提高具有一定的作用。LASSNER[18]發(fā)現(xiàn)，LPAT 可以提高sn-2 位芥酸的比例，但不能提高芥酸的含量。本研究中，克隆得到的BnaLPAT2 基因通過(guò)不同啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)后在擬南芥中過(guò)表達(dá)，可以不同程度地提高亞油酸、亞麻酸的含量，從而改變脂肪酸各組分的含量，這為以后更深入地研究該基因提供了依據(jù)。