賀 瑜 陳淑娟 何 勝 伍賢龍 蒲麗宇 彭亮躍 肖亞梅

(湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,省部共建淡水魚類發(fā)育生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,長沙 410081)

SP600125(C14H8N2O)是一種蒽吡唑化合物,作為c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)的高選擇性小分子抑制劑,其作用機(jī)制是通過與ATP相互競爭進(jìn)而與JNK結(jié)合抑制c-Jun的磷酸化,從而有效地抑制JNK的活性,對細(xì)胞的增殖、分化和凋亡產(chǎn)生顯著影響[1]。本實(shí)驗(yàn)室以培養(yǎng)的二倍體紅鯽(Carassius auratus,red var)尾鰭細(xì)胞為材料,SP600125孵育后四倍體細(xì)胞數(shù)量顯著增加。在此基礎(chǔ)上,通過進(jìn)一步優(yōu)化SP600125處理方式和流式分選體系,成功獲得了基于SP600125誘導(dǎo)的同源四倍體鯽細(xì)胞系(SP4N-fin,保藏編號為CGMCCNo.9155),該技術(shù)獲國家發(fā)明專利(專利號ZL 201410317420.2)。以SP4N-fin細(xì)胞為核供體,二倍體鯽未受精卵為受體,通過體細(xì)胞核移植技術(shù)(the Somatic Cell Nuclear Transfer Technique,SCNT),獲得了SCNT四倍體胚胎和1尾尾部畸形的幼魚[2]。雖未得到成魚,但充分顯示了SP600125誘導(dǎo)的四倍體鯽細(xì)胞具有良好的發(fā)育潛能,為開辟魚類多倍體育種新途徑做出了有益的探索。

多倍體是含有3套或3套以上完整染色體組的生物體,多倍化現(xiàn)象在自然界,尤其是植物中廣泛存在,多倍化事件產(chǎn)生大量新的遺傳材料,增加了基因組復(fù)雜性,推動(dòng)了物種的形成和進(jìn)化[3]。多倍體魚類對改善品質(zhì)、加快生長速度、延長壽命、提高產(chǎn)量、控制過度繁殖、保持物種多樣性和培育新品種等方面都具有重要意義,應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖可以帶來巨大的經(jīng)濟(jì)效益[4,5]。基于SP600125在體外可以誘導(dǎo)魚類細(xì)胞多倍化,本文繼續(xù)探究了用SP600125直接孵育受精卵以獲得多倍體魚的可能性。Valesio等[6]發(fā)現(xiàn)用JNK抑制劑SP600125處理發(fā)育中的斑馬魚(Danio rerio)會導(dǎo)致一系列劑量依賴性缺陷,如心包水腫、頜骨畸形、脊椎彎曲和發(fā)育遲緩等。本文的相關(guān)研究顯示,SP600125處理鯽受精卵會引起胚胎倍性發(fā)生改變,但同時(shí)發(fā)現(xiàn)SP600125也顯著影響胚胎發(fā)育并導(dǎo)致胚胎高死亡率,孵化出膜的處理組魚苗中出現(xiàn)大量脊椎彎曲和尾缺失等畸形個(gè)體。在此基礎(chǔ)上,進(jìn)一步分析了SP600125孵育對魚類骨骼發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)的影響,結(jié)果表明,在離體和在體狀態(tài)下,SP600125孵育會顯著影響骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(Bone morphogenetic proteins 2,bmp2)、淋巴細(xì)胞增強(qiáng)結(jié)合因子1(Lymphoid-enhancer-binding factor 1,lef1)、酪氨酸蛋白激酶7(Protein tyrosine kinase 7,ptk7)和骨保護(hù)素(Osteoprotegerin,opg)等一些與骨骼發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)。

1 材料與方法

1.1 SP600125孵育鯽受精卵

SP600125(Merck-Millipore,美國)溶解于10%二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO)配制成1 mmol/L原溶液,然后用超純水進(jìn)一步稀釋至理想濃度。采用SP600125直接孵育鯽受精卵(單細(xì)胞期)的預(yù)實(shí)驗(yàn)中,我們觀察到低濃度(＜10 μmol/L)SP600125對鯽胚胎發(fā)育影響較弱,而高濃度(＞1 mmol/L)下則胚胎死亡?；赟P600125處理鯽受精卵時(shí)長和濃度的預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,本實(shí)驗(yàn)選用100 μmol/L SP600125對鯽受精卵浸泡處理20min,而后吸去SP600125溶液,胚胎置于曝氣水中室內(nèi)靜水孵化。分別設(shè)置1% DMSO對照組和曝氣水空白對照組。

1.2 SP600125孵育鯽魚苗

在預(yù)實(shí)驗(yàn)中,使用不同濃度SP600125(0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8和2.0 μmol/L)對孵化出膜的紅鯽魚苗進(jìn)行了測試。發(fā)現(xiàn)濃度低于0.6 μmol/L SP600125對魚苗的發(fā)育沒有顯著的影響,而高濃度(＞1.8 μmol/L)則會導(dǎo)致魚苗在藥物孵育后的第1天就大量死亡?；陬A(yù)實(shí)驗(yàn),選取1.4 μmol/L SP600125溶液浸泡處理出膜第1天鯽魚苗,間隔6h換液一次,第7天統(tǒng)計(jì)存活率和畸形率。分別設(shè)置0.014% DMSO對照組和曝氣水空白對照組。

1.3 SP600125孵育鯽尾鰭細(xì)胞

二倍體鯽尾鰭細(xì)胞系(2N)以及利用SP600125誘導(dǎo)建立的同源四倍體鯽細(xì)胞系(SP4N)來源于本實(shí)驗(yàn)室。細(xì)胞體外培養(yǎng)體系和方法參見我們之前的報(bào)道[2]。以鯽尾鰭細(xì)胞系為材料,待細(xì)胞生長密度達(dá)到80%—90% 融合度時(shí)將細(xì)胞的培養(yǎng)液更換為含100 μmol/L SP600125的培養(yǎng)液培養(yǎng)48h,0.25%胰酶消化后離心收集細(xì)胞。

1.4 流式細(xì)胞儀倍性檢測

取孵化出膜第1天的魚苗,用尖頭鑷子挑去卵黃囊(每5尾一組,實(shí)驗(yàn)組共隨機(jī)取樣30組);3月齡處理組魚剪取尾鰭。將樣品分別置于加入了預(yù)先配好的ACD抗凝劑(0.48 g檸檬酸+1.32 g檸檬酸鈉+1.47 g葡萄糖+100 mLH2O)剪碎制備成細(xì)胞懸液,經(jīng)DAPI染液避光染色約10 min,樣品經(jīng)過20 μL尼龍過濾器過濾,得到的液體進(jìn)行上機(jī)(流式細(xì)胞儀)檢測。

1.5 熒光定量PCR檢測

熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,QPCR)引物(表1)由擎科生物公司合成。將收集的魚苗和細(xì)胞材料分別用酚氯仿法提取總RNA,Nanodrop2000測定總RNA樣品的純度和濃度。利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit,Fermentas公司),將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。Q-PCR按照SYBR Premix ExTaq試劑盒(Fermentas公司)說明書進(jìn)行操作。以β-actin內(nèi)參,采用2－ΔΔCt計(jì)算各基因的mRNA相對表達(dá)量。

表1 PCR引物序列Tab.1 Sequences of PCR primer

2 結(jié)果

2.1 SP600125孵育受精卵對鯽發(fā)育的影響

SP600125孵育受精卵20min后,胚胎置于曝氣水中常規(guī)培育。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示,SP600125處理導(dǎo)致胚胎發(fā)育滯后,孵化時(shí)間較空白對照組推遲5—7h,而DMSO對照組與空白對照組相比,胚胎發(fā)育時(shí)間無明顯差異(圖1)。觀察顯示,SP600125孵育受精卵不僅影響胚胎發(fā)育進(jìn)程,而且導(dǎo)致胚胎死亡,處理組胚胎平均存活率僅3.4%,死亡高峰出現(xiàn)在原腸胚期(76%)。DMSO對照組和空白對照組胚胎平均存活率分別為68.2%和90.2%。

圖1 SP600125孵育對鯽胚胎發(fā)育的影響Fig.1 The effect of SP600125 on the embryonic development of crucian carp

SP600125孵育受精卵處理組孵化后的魚苗出現(xiàn)大量的畸形個(gè)體,與空白對照組相比(圖2A),主要表現(xiàn)為心包腔水腫、頜骨畸形、脊椎彎曲甚至于尾部缺失等(圖2B—2D)。流式細(xì)胞儀倍性分析發(fā)現(xiàn),與空白對照組相比較(圖2E),SP600125處理組檢測到DNA含量的改變(圖2F、2G)。然而,我們對SP600125孵育受精卵處理組存活的55尾3月齡紅鯽的DNA含量進(jìn)行了測定,發(fā)現(xiàn)均為二倍體(圖2H)。

圖2 SP600125孵育對受精卵形態(tài)和倍性的影響Fig.2 Effects of SP600125 on morphology and ploidy of fertilized egg

2.2 SP600125浸泡魚苗對鯽發(fā)育的影響

鯽魚苗孵化出膜后即置于1.4 μmol/L SP600125溶液中持續(xù)浸泡處理7d,統(tǒng)計(jì)顯示處理組出現(xiàn)畸形魚苗占比為11.7%,而DMSO對照組和空白對照組魚苗畸形率僅為3.0%和0.9%。觀察顯示,SP600125處理7d后的畸形紅鯽主要表現(xiàn)為脊椎彎曲(圖3)。

2.3 SP600125孵育受精卵和魚苗對鯽骨骼發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)的影響

信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子1(Signal transducers and activators of transcription 1,stat1)、母抗Dpp小同源物6(Small mothers against decapentaplegic homolog 6,smad6)、堿性螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子(Basic helix-loop-helix transcription factor,twist1)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3(Signal transducers and activators of transcription 3,stat3)、lef1、bmp2、ptk7和opg等是目前已報(bào)道的與脊椎動(dòng)物骨骼發(fā)育密切關(guān)聯(lián)的功能基因[7—13]。采用熒光定量PCR分別檢測了上述8種基因在SP600125孵育受精卵后孵化的魚苗以及SP600125直接處理魚苗組的mRNA水平表達(dá)情況。如圖4A所示,與DMSO對照組和空白對照組相比較,SP600125孵育受精卵組的魚苗中stat1、smad6、ptk7、opg和stat3等5個(gè)基因mRNA表達(dá)量均有明顯升高(P＜0.05)。而在SP600125直接處理魚苗組中,除opg和stat3外,其余6個(gè)基因(stat1、smad6、lef1、bmp2、twist1和ptk7)的mRNA表達(dá)量與對照組(DMSO組和空白組)相比均有顯著差異(P＜0.05,圖4B)。

圖3 SP600125孵育鯽魚苗導(dǎo)致骨骼發(fā)育畸形(A和B分別為鯽胚胎出膜后3d和7d的魚苗)Fig.3 Skeletal malformations caused by SP600125 in crucian carp(A and B were 3-day and 7-day fry after hatching,respectively)

2.4 SP600125體外孵育鯽尾鰭細(xì)胞對骨骼發(fā)育基因表達(dá)的影響

在此前的研究中,Zhou等[2]將SP600125體外誘導(dǎo)的同源四倍體鯽細(xì)胞核移植到鯽未受精卵中,獲得的SCNT幼魚表現(xiàn)為尾部嚴(yán)重畸形。進(jìn)一步利用熒光定量PCR技術(shù),分別檢測了SP600125誘導(dǎo)的同源四倍體鯽細(xì)胞系(SP4N)和SP600125處理鯽尾鰭細(xì)胞中8種骨骼發(fā)育相關(guān)基因mRNA水平的表達(dá)情況。如圖5所示,stat1、smad6、lef1、bmp2和twist1基因在SP4N細(xì)胞中的mRNA表達(dá)量比鯽尾鰭細(xì)胞明顯增高(P＜0.05,圖5A)。在SP600125孵育鯽尾鰭細(xì)胞組中,除opg外,stat1、smad6、lef1、bmp2、twist1、ptk7和stat3等7個(gè)基因mRNA表達(dá)量與對照組細(xì)胞相比均顯著上升(P＜0.05),特別是stat1、smad6、bmp2、twist1和ptk7等5個(gè)基因表達(dá)差異尤其顯著(圖5B)

圖4 SP600126孵育對鯽骨骼發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig.4 The effects of SP600125 on the expression of several skeletal development-related genes in crucian carp

3 討論

SP600125被廣泛應(yīng)用于疾病發(fā)病機(jī)制研究[14,15],能促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡和抑制腫瘤的生長,并在乳腺癌[16]、淋巴瘤[17]和結(jié)腸癌[18]等得到臨床學(xué)應(yīng)用。SP600125也用于治療自身免疫性疾病和神經(jīng)退行性疾病[19]。此外,研究還發(fā)現(xiàn),SP600125處理后能夠阻滯G2/M期而影響小鼠胚胎干細(xì)胞的增殖[20],并且對維持胚胎干細(xì)胞的干性、體外培養(yǎng)及胚胎干細(xì)胞的自我更新等方面都發(fā)揮顯著作用[21],在多能性干細(xì)胞誘導(dǎo)等方面也得到應(yīng)用[22]。我們前期的研究表明,SP600125在體外具有誘導(dǎo)二倍體鯽細(xì)胞多倍化作用,建立了SP600125體外高效誘導(dǎo)魚類細(xì)胞四倍化體系,并獲得了穩(wěn)定的四倍體鯽細(xì)胞系[2],這為SP600125作為新型化學(xué)誘導(dǎo)劑來開展多倍體培育提供了可能性。在此基礎(chǔ)上,本研究首次嘗試用SP600125直接孵育受精卵,結(jié)果顯示SP600125處理受精卵雖然能夠引起紅鯽倍性發(fā)生改變,但也顯著影響鯽胚胎發(fā)育并導(dǎo)致胚胎高死亡率,同時(shí)伴隨著大量畸形魚苗的發(fā)生,目前尚未在處理組成魚中鑒定到多倍體。

SP600125孵育鯽受精卵處理組的胚胎及魚苗中有大量的畸形個(gè)體發(fā)生,其主要表現(xiàn)為脊椎彎曲和尾缺失等骨骼發(fā)育異常(圖2)。SP600125處理導(dǎo)致骨骼畸形在SP600125孵育鯽魚苗試驗(yàn)中也得以進(jìn)一步驗(yàn)證(圖3)。分子水平檢測結(jié)果表明,SP600125孵育影響stat1、smad6、bmp2、lef1、twist1和ptk7等一些與骨骼發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)。骨形態(tài)發(fā)生蛋白(Bone morphogenetic proteins,BMPs)是從脊椎動(dòng)物骨骼基質(zhì)中分離到的一類蛋白質(zhì),能誘導(dǎo)骨與軟骨形成,是促進(jìn)骨形成和誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化最重要的細(xì)胞外信號分子之一[23]。蠑螈附肢再生研究中發(fā)現(xiàn)如果bmp2過量表達(dá)可以促進(jìn)細(xì)胞凝聚和凋亡,導(dǎo)致再生過程中趾部的缺失[24]。lef1是骨骼發(fā)育及骨穩(wěn)態(tài)的重要調(diào)節(jié)因子[25],Tommy N等[26]發(fā)現(xiàn)lef1基因敲除雌性小鼠顯示出成骨細(xì)胞活性降低,導(dǎo)致骨量的減少,而lef1過表達(dá)則會抑制晚期成骨細(xì)胞標(biāo)志的表達(dá)和分化,抑制成骨細(xì)胞的終末成骨[27]。twist1在脊椎動(dòng)物不同發(fā)育時(shí)期的許多組織中都有表達(dá)并且參與調(diào)控細(xì)胞命運(yùn)決定、分化和成形等過程[28],研究發(fā)現(xiàn)twist1在成骨細(xì)胞分化及骨形成中起負(fù)性調(diào)節(jié)作用,過表達(dá)twist1抑制成骨細(xì)胞的分化[29]。而ptk7則是典型Wnt/β-catenin和非典型Wnt/PCP信號活性的關(guān)鍵調(diào)控因子,是脊椎動(dòng)物胚胎模式形成和形態(tài)發(fā)生所必需的[30]。在斑馬魚研究中發(fā)現(xiàn)ptk7突變與脊柱側(cè)凸發(fā)生相關(guān),ptk7缺失會導(dǎo)致軸向形成缺陷,包括軀干和尾巴內(nèi)缺乏會聚性伸展[31]。opg基因參與調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的分化和活化,維持骨形成與吸收的動(dòng)態(tài)平衡[32],OPG/ RANKL是非常重要的骨代謝調(diào)控通路,成骨細(xì)胞中OPG競爭性結(jié)合RANKL,抑制破骨細(xì)胞分化和骨吸收,在促進(jìn)骨形成和維持骨量中起重要作用[33]。無論是在體(受精卵和魚苗)還是在離體(培養(yǎng)的尾鰭細(xì)胞)狀態(tài)下,SP600125孵育都會引起smad6和stat1基因mRNA水平顯著上調(diào)(圖4和圖5)。smad6是SMADs中一種抑制性信號分子,smad6對BMPs信號傳遞起抑制作用,從而負(fù)調(diào)控BMPs信號通路[34],有研究發(fā)現(xiàn),smad6信號干擾能促進(jìn)bmp2誘導(dǎo)的骨向分化[35],降低smad6的表達(dá),可以改善大鼠骨組織病變[36]。stat1不僅參與免疫調(diào)節(jié),還參與破骨細(xì)胞的形成和成骨細(xì)胞的分化,研究表明stat1可以通過直接與成骨細(xì)胞分化必需的轉(zhuǎn)錄因子相互作用抑制骨形成,是骨吸收和骨形成的關(guān)鍵負(fù)調(diào)控因子[37]。在小鼠骨骼間充質(zhì)干細(xì)胞研究中發(fā)現(xiàn)過表達(dá)stat1顯著抑制成骨分化[38],而在成骨生成被抑制的小鼠中將stat1基因敲除中發(fā)現(xiàn),小鼠的骨量和成骨相關(guān)因子得到顯著性恢復(fù)[37]。

圖5 SP600125誘導(dǎo)的同源四倍體鯽細(xì)胞系(SP4N)(A)和SP600125孵育鯽尾鰭細(xì)胞(B)中幾種骨骼發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)Fig.5 The effects of SP600125 on the expression of several skeletal development-related genes in autotetraploid crucian carp cell line(SP4N)(A)and caudal fin cells in crucian carp(B)

綜上所述,SP600125在體孵育鯽受精卵引發(fā)胚胎(或部分細(xì)胞)多倍化效應(yīng),然而發(fā)生的骨骼發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)改變也直接影響鯽胚胎及魚苗正常生長與發(fā)育,并導(dǎo)致高畸形率和高死亡率。進(jìn)一步深入解析SP600125多倍化誘導(dǎo)分子調(diào)控機(jī)制,結(jié)合對SP600125孵育受精卵的藥物濃度和處理時(shí)長等參數(shù)的調(diào)整和優(yōu)化,在實(shí)現(xiàn)多倍化誘導(dǎo)的同時(shí)減少畸形胚胎發(fā)生。此外,本研究探究的是用SP600125直接孵育受精卵(單細(xì)胞期)以獲得多倍體魚,鑒于大多數(shù)魚類前兩次卵裂基本是同步的且形成合胞體,也可以在減少嵌合體發(fā)生的前提下嘗試低濃度SP600125孵育早期胚胎(二、四細(xì)胞期),探索SP600125作為化學(xué)誘導(dǎo)劑開展魚類倍性操作的策略和方法。