鮑方劍 黃 雷 陳 偉 王思鵬 陳 琛 黃曉林 張德民 張化俊

(1.寧波大學(xué)海洋學(xué)院,寧波 315211;2.浙江省海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖研究所,溫州 325005)

隨著對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)高速發(fā)展,高密度集約化的養(yǎng)殖模式逐漸成為當(dāng)前市場(chǎng)的主流趨勢(shì)。為了維持高密度對(duì)蝦養(yǎng)殖生產(chǎn)系統(tǒng)中的水質(zhì)而進(jìn)行的大面積水體交換,極易向養(yǎng)殖體系中引入病原導(dǎo)致對(duì)蝦患病[1,2]。因此,對(duì)蝦高密度養(yǎng)殖體系中亟需一種能有效管控水體水質(zhì),減少外界環(huán)境水體輸入的技術(shù)策略。生物絮團(tuán)技術(shù)(Biofloc Technology)是一項(xiàng)環(huán)境友好型的水產(chǎn)養(yǎng)殖新技術(shù),該技術(shù)通過(guò)向水體中輸入額外的碳源,促進(jìn)異養(yǎng)細(xì)菌、硝化菌、真菌、藻類和原生動(dòng)物等的生長(zhǎng)和聚集,通過(guò)代謝活動(dòng)進(jìn)行有效的水質(zhì)管控。同時(shí),這些異養(yǎng)微生物及其分泌物,可依附于綠藻、絲狀真菌等[3],在恒定的曝氣、攪拌及外源碳輸入條件下,在水體中保持高度懸浮狀態(tài),進(jìn)一步形成生物絮團(tuán)[4],提高水體中氮的吸收與轉(zhuǎn)化[5]。

生物絮團(tuán)可以降低水體中過(guò)剩的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),有機(jī)物以及病原體,從而最大限度地減少養(yǎng)殖污水進(jìn)入外圍水域環(huán)境,實(shí)現(xiàn)更高的經(jīng)濟(jì)和環(huán)境效益。此外,生物絮團(tuán)可作為凡納濱對(duì)蝦的日糧[6],絮團(tuán)中的多種微生物以聚合的形式為對(duì)蝦提供蛋白質(zhì)、脂類、氨基酸和脂肪酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),并促進(jìn)對(duì)蝦的免疫因子的表達(dá)[7],從而提高對(duì)蝦的成活率[8]。同時(shí),生物絮團(tuán)可以抑制哈維氏弧菌的群體感應(yīng)能力[9],從而降低其對(duì)對(duì)蝦的致病風(fēng)險(xiǎn)。生物絮團(tuán)對(duì)水質(zhì)也具有顯著的調(diào)控效果,研究發(fā)現(xiàn)水體輸入碳源可以顯著降低其亞硝酸鹽、氨氮、硝酸鹽和化學(xué)需氧量水平[10];而且,輸入不同組分的碳源也會(huì)影響絮團(tuán)形成的種類,進(jìn)而影響絮團(tuán)對(duì)水質(zhì)的凈化效率[11]。同時(shí),對(duì)生物絮團(tuán)濃度的管控可以顯著提高對(duì)蝦的生長(zhǎng)速度,飼料轉(zhuǎn)換率和總生物量的產(chǎn)量[12]。當(dāng)前,生物絮團(tuán)技術(shù)已經(jīng)展示出在水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域的重要應(yīng)用潛力,但是對(duì)其形成的真核微生物過(guò)程及與水體真核微生物的互作特征研究仍然較為匱乏?；诖?本文研究在外源碳氮輸入條件下,對(duì)蝦養(yǎng)殖系統(tǒng)生物絮團(tuán)形成過(guò)程中的水體真核微生物與絮團(tuán)真核微生物的組成及群落結(jié)構(gòu),揭示在該養(yǎng)殖模式下養(yǎng)殖系統(tǒng)中微生物之間的相互作用,從而明確碳源輸入對(duì)生物絮團(tuán)形成的影響機(jī)制,為外源碳氮輸入促進(jìn)生物絮團(tuán)形成提供理論支持和應(yīng)用基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及樣品采集

本研究在浙江溫州的浙江水產(chǎn)養(yǎng)殖研究所永興基地(120°50′24″E,27°51′36″N)進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)時(shí),在600 L的小型對(duì)蝦養(yǎng)殖生態(tài)實(shí)驗(yàn)體系中輸入400 L的消毒海水,養(yǎng)殖系統(tǒng)配備增氧、排換水裝置。實(shí)驗(yàn)飼料購(gòu)于浙江省澳華飼料有限公司,粗蛋白含量為42%,碳、氮元素比值約為6。碳源為白色粉末狀蔗糖,純度為99%。設(shè)置三組實(shí)驗(yàn),通過(guò)調(diào)節(jié)蔗糖添加量維持輸入物的C/N比分別為10(CN10)和15(CN15);對(duì)照組不添加蔗糖即初始C/N為6(CK);每組設(shè)置6個(gè)重復(fù)。在每個(gè)實(shí)驗(yàn)體系中投放210尾(500尾/m3)凡納濱對(duì)蝦,使用相同的日常管理措施進(jìn)行對(duì)蝦養(yǎng)殖。

在第0、第11和第28天采集水體微生物;在形成穩(wěn)定的生物絮團(tuán)后(第28天),采生物絮團(tuán),分析其真核微生物群落組成。

水體微生物每個(gè)實(shí)驗(yàn)桶采2 L水樣,混勻。先用100 μm紗絹預(yù)過(guò)濾,再經(jīng)0.2 μm的聚碳酸酯膜(Millipore)過(guò)濾,收集微生物,置-20 ℃保存,用干冰運(yùn)送回實(shí)驗(yàn)室-80℃保存。利用Power Soil?DNA 提取試劑盒(MOBIO)試劑盒提取總DNA,用NanoDrop ND1000 核酸測(cè)(NanoDrop Technologies,Wilmington,DE,USA)定儀測(cè)定 DNA 濃度和純度,并進(jìn)行后續(xù)測(cè)序分析。

絮團(tuán)微生物每個(gè)實(shí)驗(yàn)桶采集2 L水樣,利用100 μm紗絹過(guò)濾,收集紗絹上生物絮團(tuán)過(guò)濾物,放入滅菌的1.5 mL EP管中,置-80℃保存。用Qiagen公司的DNA提取試劑盒提DNA,用 NanoDrop ND1000 核酸測(cè)定儀測(cè)定 DNA 濃度和純度,并進(jìn)行后續(xù)測(cè)序分析。

1.2 水體理化指標(biāo)測(cè)定

使用YSIQS600便攜式水質(zhì)檢測(cè)儀(YSI,USA)每日測(cè)定各實(shí)驗(yàn)體系的溫度、pH、溶解氧和鹽度。銨態(tài)氮、亞硝態(tài)氮、硝態(tài)氮、活性磷、葉綠素a和化學(xué)需氧量的分析方法均參照《海洋監(jiān)測(cè)規(guī)范》(GB 17378-2007)和《海洋調(diào)查規(guī)范》(GB 12763-2007)的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范進(jìn)行測(cè)定。

1.3 MiSeq測(cè)序及數(shù)據(jù)處理

針對(duì)真核微生物18S rRNA基因的V4可變區(qū),利用引物3NDF:5′-GGCAAGTCTGGTGC CAG-3′和V4eukR2R:5′-ACGGTATCTRATCRTCTTCG-3′[13]進(jìn)行擴(kuò)增。采用20 μL PCR反應(yīng)系統(tǒng),擴(kuò)增條件為:95℃預(yù)變性3min;95℃變性30s,55℃退火30s,72℃延伸45s,共27個(gè)循環(huán);72℃延伸10min,每個(gè)反應(yīng)3個(gè)平行。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)TaKaRa 的純化試劑盒(Takara Purification Kit,TaKaRa,Japan)純化后,將三個(gè)PCR產(chǎn)物混合并通過(guò)Quant-It Pico Green試劑盒(Invitrogen,Carlsbad,CA)定量。將樣品PCR產(chǎn)物以等摩爾量混合,利用TruSeq DNA樣品制備試劑盒(San Diego,CA,USA)構(gòu)建文庫(kù),送于上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行Illumina MiSeq測(cè)序。

通過(guò)QIIME v.1.9.0平臺(tái)(Quantitative insights into microbial ecology,http://qiime.org/)對(duì)下機(jī)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行樣品分裝、去嵌合體和質(zhì)量篩選[14];利用SILVA 132數(shù)據(jù)庫(kù)將相似性大于97%的序列歸為同一個(gè)分類操作單元(OTU),以每個(gè)OTU中豐度最高的作為代表序列,在SILVA132數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)確定其所屬類群;去除未鑒定序列,保留后生動(dòng)物(Metazoa)的OTU,得到的樣本的序列數(shù)為7028—64041。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

將每個(gè)樣品中的序列標(biāo)準(zhǔn)化為最小測(cè)序深度7020。在門水平(相對(duì)豐度大于 0.1%)分析每個(gè)樣品的群落組成。通過(guò)Bray-Curtis距離測(cè)量β-多樣性,并通過(guò)非度量多維尺度分析(NMDS)展示輸入碳源情況下真核微生物的演替規(guī)律?；贐ray-Curtis距離的相似性分析(ANOSIM)分析各組真核微生物群落的相似性。應(yīng)用冗余分析(RDA)和Mantel分析來(lái)評(píng)估環(huán)境因素對(duì)群落變異的貢獻(xiàn)度。使用SPSS計(jì)算40種最豐富的OTU和環(huán)境因子的Spearman相關(guān)性,篩選得到相關(guān)性系數(shù)ρ值大于0.6的OTUs,并通過(guò)R中的“pheatmap”包繪制熱圖[15]?；贐ray-Curtis距離對(duì)水體和絮團(tuán)樣品進(jìn)行平均聚類并繪制聚類樹,使用 “stats”包[16]和“ggplot2”[17]包進(jìn)行計(jì)算繪圖。利用R包的“psych”包[18]計(jì)算水體與絮團(tuán)微生物群落間相互作用相關(guān)性系數(shù),對(duì)水體和絮團(tuán)中浮游真核微生物豐度大于0.1%的OTU進(jìn)行相關(guān)性分析。篩選得到相關(guān)性系數(shù)ρ值大于0.6,顯著性P值小于0.05的相關(guān)性O(shè)TUs,用“gephi”[19]繪制無(wú)向性微生物互作網(wǎng)絡(luò)圖,并進(jìn)行加權(quán)隨機(jī)模塊化網(wǎng)絡(luò)分析。

2 結(jié)果

2.1 水體真核微生物群落組成

水體真核微生物在不同組別中存在顯著差異(圖1)。第0天,水體中主要門類為不等鞭毛類(Heterokonta,55.4%)、纖毛蟲(Ciliophora,32.5%)、眼蟲門(Euglenozoa,6.1%)和綠藻門(Chlorophyta,4.7%)。第11天時(shí),CK組中綠藻門相對(duì)豐度高達(dá)47.7%,較第0天提高了近10倍;而不等鞭毛類的相對(duì)豐度則降低到2%;而CN10組綠藻門比例相比第0天水體有升高,與CK組水體相對(duì)豐度接近;同時(shí),檢測(cè)到之前未出現(xiàn)的脊索動(dòng)物(Chordata),平均相對(duì)豐度為26.3%;CN15組的綠藻門低于CK組,相對(duì)豐度為僅為6.0%;三個(gè)實(shí)驗(yàn)中的不等鞭毛類相對(duì)豐度接近,均為2.1%。第28天,CK組的綠藻門較第11天的相對(duì)豐度有顯著升高,達(dá)到了80.4%;同時(shí)首次檢測(cè)到輪蟲門(Rotifera),平均相對(duì)豐度為11.3%。CN10組中綠藻門比例比CK組低4倍;輪蟲門的相對(duì)豐度為CK組的兩倍;腹毛動(dòng)物門(Gastrotricha)比例增長(zhǎng)為12.8%;CN15組中綠藻門相對(duì)豐度為40.8%,為相對(duì)豐度最高的類群;輪蟲門的相對(duì)豐度為35.8%。

圖1 養(yǎng)殖系統(tǒng)中真核微生物群落組成(門水平,相對(duì)豐度大于 0.1%)Fig.1 Microeukaryotic community compositions in aquaculture system at phylum level(relative abundance of ＞0.1%)

2.2 水體真核微生物群落結(jié)構(gòu)演替及影響因素

NMDS分析(圖2)發(fā)現(xiàn),在第11天,三個(gè)處理組的水體真核微生物群落具有差異,其中CK與CN15組差異顯著(表1);第28天時(shí),CK組與CN15組沿NMDS2軸分離;ANOSIM分析發(fā)現(xiàn)(表1),CK與CN15有顯著差異。

RDA分析(圖3A—C)及Mantel分析(表2)發(fā)現(xiàn),28d時(shí),溶氧、亞硝態(tài)氮、活性磷與蔗糖輸入對(duì)真核微生物群落結(jié)構(gòu)變異有顯著影響。在微生物群落組成方面,真核微生物群落受到DO(P＜0.05)的影響最為顯著,OTU5193(綠藻門,ρ=0.77)、OTU1634(輪蟲,ρ=0.78)和OTU6373(綠藻門,ρ=0.93)的相對(duì)豐度受DO影響最為顯著;輸入碳源與OTU1634(輪蟲,ρ=0.80)、OTU3672(輪蟲,ρ=0.75)、OTU131(纖毛蟲,ρ=0.73)和OTU7049(網(wǎng)黏菌綱Labyrinthulomycetes,ρ=0.74)的相對(duì)豐度正相關(guān),與OTU6373(綠藻門,ρ=-0.70)的相對(duì)豐度負(fù)相關(guān)。

2.3 絮團(tuán)真核微生物群落結(jié)構(gòu)

在第28天時(shí),絮團(tuán)中各組的優(yōu)勢(shì)真核微生物類群均為綠藻門(圖4A),平均占比91.4%。NMDS分析發(fā)現(xiàn)CN10組與CN15組沿NMDS1軸分離(圖4B)。基于Bray-Curtis 距離的聚類分析(圖4C)發(fā)現(xiàn),來(lái)源于水體和絮團(tuán)的微生物群落可顯著聚為兩類;同時(shí),經(jīng)ANOSIM分析發(fā)現(xiàn)絮團(tuán)和水體真核微生物群落差異顯著(表3)。

2.4 水體與絮團(tuán)真核微生物群落互作特征

微生物互作的Co-occurance網(wǎng)絡(luò)是由955個(gè)邊連接的198個(gè)節(jié)點(diǎn)組成的非隨機(jī)網(wǎng)絡(luò)(SES=3.7447),其中有173個(gè)邊是水體真核微生物與絮團(tuán)真核微生物的相互作用。綠藻有62個(gè)節(jié)點(diǎn)(絮團(tuán)27個(gè),水體35個(gè)),水體與絮團(tuán)相互作用的邊有114條;不等鞭毛類有22個(gè)節(jié)點(diǎn)(絮團(tuán)7個(gè),水體15個(gè)),水體與絮團(tuán)相互作用的邊有56條;輪蟲有23個(gè)節(jié)點(diǎn)(絮團(tuán)5個(gè),水體18個(gè)),水體與絮團(tuán)相互作用的邊有28條;纖毛蟲有23個(gè)節(jié)點(diǎn)(絮團(tuán)3個(gè),水體20個(gè)),水體與絮團(tuán)相互作用的邊有22條。

圖2 基于Bray-Curtis距離的非度量多維尺度分析真核浮游生物群落結(jié)構(gòu)Fig.2 Nonmetric multidimensional scaling(NMDS)analysis of microeukaryotic community structure based on Bray-Curtis distance

互作網(wǎng)絡(luò)由5個(gè)主要模塊組成(圖5B)。模塊1(Module I)主要由輪蟲、綠藻、腹毛動(dòng)物門組成,且多數(shù)OTUs在CK有更高的豐度(圖5C)。模塊2(Model II)主要為水體中的輪蟲、纖毛蟲、子囊菌門(Ascomycota)、不等鞭毛類與絮團(tuán)中的輪蟲、綠藻、不等鞭毛類的相互作用,且多數(shù)OTUs主要分布在CN10與CN15組,如水體中輪蟲豐度是CK組的近8倍與12倍,且CN15組中的纖毛蟲與子囊菌門有較高豐度;在絮團(tuán)中,CN10與CN15的綠藻豐度分別是CK的近3倍和2倍。模塊3(Model III)不包含絮團(tuán)OTUs,主要是水體中纖毛蟲、輪蟲等的相互作用。模塊4(Model IV)與模塊5(Model V)主要為水體中的不等鞭毛類、纖毛蟲、輪蟲與絮團(tuán)中的綠藻的相互作用。CK組中的綠藻與輪蟲在絮團(tuán)與水體中處于相同的模塊;實(shí)驗(yàn)組中綠藻與絮團(tuán)中綠藻處在相同的模塊,輪蟲、纖毛蟲和線蟲(Nematoda)處在相同的模塊。

表1 相似性分析不同時(shí)間段不同處理組真核微生物群落差異Tab.1 Similarity analysis of microeukaryotic community in different treatment groups at day 11 and day 28

圖3 冗余分析真核微生物群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子的關(guān)系Fig.3 Redundancy analysis(RDA)of the relationship between microeukaryotic community and environmental variables

3 討論

3.1 蔗糖輸入對(duì)水體和絮團(tuán)真核微生物群落組成的影響

綠藻是構(gòu)成水體和絮團(tuán)微生物群落的重要組成部分,在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中都有較高豐度,且不同組別差異較大。綠藻的豐度主要受氮磷營(yíng)養(yǎng)鹽和溶解氧的影響[20],對(duì)照組的氮、磷、溶解氧含量高于實(shí)驗(yàn)組,可能有利于綠藻的生長(zhǎng)。綠藻在絮凝作用下可組成絮團(tuán)骨架,有利于細(xì)菌和原生動(dòng)物等的附著,從而形成生物絮團(tuán)[21]。此外,綠藻可以吸收水體中的氨、磷,進(jìn)而改善水質(zhì),并降低水體透明度,避免對(duì)蝦的相互殘食[22]。但當(dāng)浮游藻類過(guò)度生長(zhǎng),易引起水體環(huán)境劇烈變化,從而導(dǎo)致水質(zhì)惡化[23],造成養(yǎng)殖水體生態(tài)系統(tǒng)崩潰。

表2 Mantel分析環(huán)境因子與真核微生物群落的相關(guān)性Tab.2 Mantel tests analysis the correlation between environmental factors and eukaryotic microbial communities

圖4 絮團(tuán)真核微生物組成及群落結(jié)構(gòu)Fig.4 Microeukaryotic community composition and structure in biofloc

在第11天時(shí),實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組中纖毛蟲和綠藻的相對(duì)豐度有較大差異,纖毛蟲在蔗糖輸入組具有更高的豐度。研究發(fā)現(xiàn),纖毛蟲的豐度與氮和磷含量顯著負(fù)相關(guān)[24],蔗糖的輸入使微生物代謝速率加快,提高了氮磷去除效率,從而使纖毛蟲在碳源輸入組中具有較高豐度。 此外,在養(yǎng)殖生態(tài)系統(tǒng)中,纖毛蟲能夠刺激菌落的形成與黏附,促進(jìn)其攝取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[25];同時(shí),纖毛蟲對(duì)于浮游植物具有攝食作用,被認(rèn)為是銨(“再生氮”)的重要來(lái)源,可以滿足初級(jí)生產(chǎn)者對(duì)氮的需要[26]。

在第28天時(shí),對(duì)照組中綠藻豐度較高,而碳源輸入組中輪蟲、腹毛動(dòng)物門和子囊菌門具有更高的豐度。該階段,養(yǎng)殖系統(tǒng)中有機(jī)質(zhì)含量增高,微生物絮團(tuán)增多,為輪蟲的生長(zhǎng)和增殖提供了有利的條件;同時(shí),輪蟲是對(duì)蝦幼蟲的重要食物來(lái)源[27]。子囊菌門可以降解水體中較難利用的顆粒及溶解腐殖質(zhì),隨后將其作為碳源和氮源輸入到食物網(wǎng)中,并改善水質(zhì)[28]?？梢?jiàn),輸入蔗糖能顯著改變真核微生物群落組成,對(duì)微生物絮團(tuán)的形成和養(yǎng)殖系統(tǒng)的穩(wěn)定具有重要作用。

表3 相似性分析水體與絮團(tuán)真核微生物群落結(jié)構(gòu)差異Tab.3 Analysis of similarity(ANOSIM)of microeukaryotic community in water and biofloc

圖5 Co-occurrance網(wǎng)絡(luò)分析絮團(tuán)與水體OTUs之間的相互作用Fig.5 Co-occurrence network among OTUs in water and biofloc based on correlation analysis

3.2 蔗糖輸入條件下真核微生物群落結(jié)構(gòu)變異的驅(qū)動(dòng)因素

當(dāng)前,針對(duì)水體與絮團(tuán)微生物群落的研究主要集中在原核微生物[29],對(duì)真核微生物群落結(jié)構(gòu)的研究還較為缺乏;然而,真核微生物群落結(jié)構(gòu)在維持養(yǎng)殖系統(tǒng)水質(zhì)以及保障對(duì)蝦正常生長(zhǎng)發(fā)育上的作用不容忽視。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,對(duì)照組與CN15組的群落組成差異不斷加大,而CN10組介于二者之間,與兩個(gè)組均沒(méi)有顯著差異。海水的細(xì)菌在碳氮比大于10時(shí)會(huì)保持較高生長(zhǎng)水平較高,然而高碳氮比條件下細(xì)菌的過(guò)度繁殖會(huì)顯著影響水質(zhì)[30]和絮團(tuán)的形成[31],進(jìn)而影響水體和絮團(tuán)的真核微生物群落結(jié)構(gòu)。

冗余分析和Mantel分析發(fā)現(xiàn),水體溶氧、亞硝態(tài)氮、磷酸鹽和碳源的輸入對(duì)水體真核微生物群落演替具有顯著影響。溶氧能顯著影響浮游植物的光合作用和呼吸作用,對(duì)細(xì)菌和真核微生物群落結(jié)構(gòu)具有顯著影響[32—34]。氮、磷是浮游植物生長(zhǎng)的必需元素,是構(gòu)成浮游植物細(xì)胞的重要物質(zhì)基礎(chǔ);磷常常作為限制性元素影響浮游植物的生長(zhǎng)[35,36]。此外,溶氧和亞硝態(tài)氮能顯著影響綠藻和輪蟲的豐度,如輪蟲豐度常與溶氧負(fù)相關(guān),與亞硝態(tài)氮正相關(guān)[37—39]。蔗糖輸入組中磷酸鹽含量高于對(duì)照組,這與Luis等[40]的結(jié)果類似,可能是由于微藻和其他固磷細(xì)菌的共同作用導(dǎo)致[41],進(jìn)而抑制了綠藻的生長(zhǎng),降低了其在蔗糖輸入組中的比例。因此,碳氮輸入對(duì)養(yǎng)殖水體水質(zhì)具有一定影響,并進(jìn)而影響微生物群落結(jié)構(gòu)和組成。

3.3 水體與絮團(tuán)真核微生物群落互作特征

在實(shí)驗(yàn)第28天時(shí),綠藻、輪蟲、纖毛蟲與不等鞭毛類在水體與絮團(tuán)具有較強(qiáng)的互作關(guān)系。在水體中碳氮比升高時(shí),輪蟲和纖毛蟲在水體和絮團(tuán)中的比例同時(shí)升高;而在低碳氮比組,真菌(Fungi)中的Zoopagales和壺菌門(Chytridiomycota)相互作用更加密切(圖5A)。壺菌門中的根囊壺菌目主要分布在對(duì)照組中;根囊壺菌目可寄生微藻和無(wú)脊椎動(dòng)物[42],對(duì)對(duì)蝦的生長(zhǎng)具有潛在危害作用。

在本研究中絮團(tuán)中占據(jù)優(yōu)勢(shì)的原生動(dòng)物為纖毛蟲,后生動(dòng)物中占據(jù)優(yōu)勢(shì)的為輪蟲的單巢綱(Monogononta),這與Azim等[4]的研究結(jié)果不同,可能是由于不同水體對(duì)于絮團(tuán)的微生物組成有一定的塑造作用。絮團(tuán)真核微生物群落間的相互作用要強(qiáng)于絮團(tuán)與水體真核微生物的相互作用(圖5C)。蔗糖輸入組的輪蟲在水體和絮團(tuán)中與對(duì)照組均無(wú)顯著差異;但隨著碳氮比的增加,輪蟲的比例也相應(yīng)升高。同時(shí),水體與絮團(tuán)中的輪蟲或具有一定的動(dòng)態(tài)交換能力(圖5C),可在一定程度上彌補(bǔ)對(duì)方數(shù)量上不足。碳源輸入會(huì)增加不等鞭毛類在水體與絮團(tuán)中的相互作用,特別是網(wǎng)黏菌綱在絮團(tuán)中的比例;此外,網(wǎng)黏菌綱的作用與根囊壺菌目類似,在有機(jī)質(zhì)降解中起著重要作用[43,44]?？梢?jiàn),在水體和絮團(tuán)中有著復(fù)雜的微生物互作關(guān)系,其中絮團(tuán)微生物內(nèi)部互作更為密切,且碳源輸入對(duì)微生物互作具有一定的影響。

4 結(jié)論與展望

綜上,向?qū)ξr養(yǎng)殖體系中輸入碳源,能夠改變真核微生物群落組成,提高纖毛蟲、輪蟲在水體的豐度,抑制綠藻過(guò)度生長(zhǎng),對(duì)微生物絮團(tuán)形成和養(yǎng)殖微生物系統(tǒng)的穩(wěn)定具有重要意義。增加輸入的碳氮比例會(huì)進(jìn)一步影響水體和微生物的群落變化,且溶氧、亞硝態(tài)氮、活性磷對(duì)群落演替都有顯著影響,如輸入碳源可增加不等鞭毛類、纖毛蟲和輪蟲在水體和絮團(tuán)中的相互作用,對(duì)養(yǎng)殖體系中藻類的過(guò)度繁具有一定的抑制作用,并提高對(duì)蝦對(duì)蛋白攝入。然而,當(dāng)前研究并未就蔗糖輸入條件下的真核微生物與原核微生物之間的相互關(guān)系進(jìn)行進(jìn)一步研究,因而無(wú)法對(duì)碳、磷、氮的流向進(jìn)行深入探討。同時(shí),高通量測(cè)序在后生動(dòng)物等多細(xì)胞生物相對(duì)豐度測(cè)定方面存在一定偏差,后續(xù)研究中會(huì)使用顯微計(jì)數(shù)的方式準(zhǔn)確測(cè)定后生動(dòng)物豐度。此外,后續(xù)研究可關(guān)注輸入蔗糖條件下的對(duì)蝦營(yíng)養(yǎng)結(jié)構(gòu)和免疫酶活變化,為生物絮團(tuán)技術(shù)應(yīng)用于凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖提供理論支持和技術(shù)指導(dǎo)。