（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院眼科，沈陽 110001）

單純皰疹病毒性角膜炎是由Ⅰ型單純皰疹病毒（herpes simplex virus type 1，HSV-1）感染引起的角膜疾病。HSV-1感染角膜后，病毒入侵角膜細(xì)胞，在角膜細(xì)胞內(nèi)復(fù)制、增殖，引起細(xì)胞病變，導(dǎo)致細(xì)胞水腫、破裂。單純皰疹病毒性角膜炎急性發(fā)作期的典型臨床表現(xiàn)為皰疹、樹枝狀或者地圖狀角膜潰瘍、角膜刺激癥狀。初次感染病毒后，機(jī)體免疫力強(qiáng)時(shí)可清除病毒，但如果機(jī)體免疫力無法清除病毒，病毒經(jīng)感覺神經(jīng)末梢侵入三叉神經(jīng)節(jié)，進(jìn)入三叉神經(jīng)節(jié)后病毒不再復(fù)制增殖，在三叉神經(jīng)節(jié)中潛伏即進(jìn)入潛伏期，HSV-1的特點(diǎn)為終身潛伏［1］。機(jī)體免疫功能降低時(shí)，潛伏感染的 HSV-1重新活化，引起單純皰疹病毒性角膜炎復(fù)發(fā)，單純皰疹病毒性角膜炎反復(fù)發(fā)作會(huì)使角膜的透明度改變，造成視力嚴(yán)重?fù)p害，甚至致盲。因此，單純皰疹病毒性角膜炎發(fā)病是病毒和免疫雙重作用的結(jié)果。單純皰疹病毒性角膜炎降低患者的視覺質(zhì)量，嚴(yán)重影響患者的生活，而且給家庭和社會(huì)造成巨大的負(fù)擔(dān)。目前，單純皰疹病毒性角膜炎尚無特效防治方法。因此，研制一種可以防止感染HSV-1的疫苗具有遠(yuǎn)大前景。

新型核酸疫苗誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的過程和病毒自然感染過程相似，但缺乏完整病毒結(jié)構(gòu)，降低了傳統(tǒng)減毒或者滅活疫苗病毒感染的風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)更穩(wěn)定，易于改造和構(gòu)建［2］。本研究通過聯(lián)合應(yīng)用生物信息學(xué)預(yù)測軟件，預(yù)測出HSV-1糖蛋白B（glycoprotein B，gB）和糖蛋D（glycoprotein D，gD）的潛在T細(xì)胞表位，結(jié)合數(shù)據(jù)庫中已知表位，成功構(gòu)建了HSV-1的T細(xì)胞多表位核酸疫苗，為今后的HSV-1核酸疫苗進(jìn)一步研究打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

293T細(xì)胞購自上海中喬新舟生物科技有限公司；真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX、HA-Tag購自上海吉?jiǎng)P基因科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；胎牛血清購自美國Hyclone公司；PBS購自中國雙螺旋公司；胰酶購自中國碧云天公司；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司；TureColor雙色預(yù)染蛋白Marker購自中國上海生工生物有限公司；PVDF膜購自美國Millipore公司；C57BL/6小鼠購自遼寧長生生物技術(shù)有限公司；殼聚糖購自美侖生物技術(shù)有限公司；γ干擾素（interferon γ，IFN-γ）ELISA試劑盒購自聯(lián)科生物有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 HSV-1 T細(xì)胞表位重組串聯(lián)抗原疫苗的設(shè)計(jì)：登錄美國國家生物技術(shù)信息中心網(wǎng)站（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov）獲得HSV-1（17株）gB和gD的氨基酸序列。登錄免疫表位數(shù)據(jù)庫（Immune Epitope Database，IEDB，http：//www.iedb.org）查閱已發(fā)表的表位，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)，篩選出gB和gD的無癥狀表位。T細(xì)胞表位的預(yù)測采用生物信息學(xué)軟件Syfpeithi（http：//www.syfpeithi.de/bin/MHCServer.dll/EpitopePrediction.htm）和IEDB［3］。將各表位按照在基因組上的序列進(jìn)行串聯(lián)，為了保證各表位的獨(dú)立性，更好地發(fā)揮免疫效應(yīng)，避免連接區(qū)產(chǎn)生新的表位，表位間加入甘氨酸絲氨酸（glycine serine，GS）做為間隔序列。同時(shí)，在序列起始部加入免疫球蛋白IgE引導(dǎo)序列MDWTWILFLVAAATRVHS，增加DNA疫苗的表達(dá)。末端加入HA-Tag標(biāo)簽進(jìn)行標(biāo)記，兩端加入NheⅠ/XhoⅠ酶切位點(diǎn)［4］。利用DNAMAN，將設(shè)計(jì)的多表位氨基酸序列復(fù)原成核苷酸序列，同時(shí)優(yōu)化密碼子，設(shè)計(jì)合成多表位基因盒，將其命名為Tg。

1.2.2 重組真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX-Tg的構(gòu)建：設(shè)計(jì)合成的多表位基因盒Tg由上海吉?jiǎng)P基因科技有限公司合成并定向克隆入質(zhì)粒pVAX，重組的質(zhì)粒命名為pVAX-Tg。

1.2.3 293T細(xì)胞的培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染：293T細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中。選擇生長良好的細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁、細(xì)胞生長至密度約為70%時(shí)，采用Lipofectamine 2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染方法參見轉(zhuǎn)染試劑說明書。同時(shí)設(shè)置 pVAX空載體轉(zhuǎn)染對(duì)照組，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞48 h。

1.2.4 Western blotting檢測體外轉(zhuǎn)錄和翻譯：質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞48 h后，提取細(xì)胞總蛋白進(jìn)行Western blotting檢測，用15%聚丙烯酰胺凝膠恒壓80 V電泳2.5 h。先進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色，觀察到清晰的條帶，進(jìn)行脫色。脫色結(jié)束后，將凝膠進(jìn)行掃描或照相，轉(zhuǎn)印至PVDF膜后封閉。孵育一抗，脫脂奶粉稀釋一抗HA-Tag 抗體，稀釋比例為1∶1 000，制成一抗工作液，倒入雜交袋中，放入PVDF膜，壓膜機(jī)封口進(jìn)行一抗孵育。一抗孵育結(jié)束后，取出PVDF膜浸入TBST液中，輕搖搖床5 min，重復(fù)上述步驟4次。繼續(xù)孵育二抗，稀釋二抗羊抗小鼠IgG-HRP，稀釋比例為1∶5 000，制成二抗工作液，倒入雜交袋中，放入PVDF膜，壓膜機(jī)封口，進(jìn)行二抗孵育。二抗孵育結(jié)束后，從雜交袋中取出PVDF膜浸入TBST液中，搖動(dòng)搖床5 min，重復(fù)此操作6次。底物化學(xué)發(fā)光ECL法顯影，置于暗室中進(jìn)行膠片曝光。

1.2.5 制備殼聚糖疫苗并免疫動(dòng)物：殼聚糖溶解在的NaAc-HAc溶液中配制成殼聚糖溶液，將DNA質(zhì)粒溶解在Na2SO4溶液中，將2種溶液預(yù)熱到55 ℃，等體積混合渦旋30 s，制成殼聚糖疫苗。選取健康雌鼠C57BL/6小鼠12只，分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組6只。2組小鼠在適宜生活環(huán)境下喂養(yǎng)1周后再建立模型。免疫情況：實(shí)驗(yàn)組小鼠肌肉多點(diǎn)注射pVAX-Tg，每只鼠100 μg/40 μL；對(duì)照組小鼠肌肉多點(diǎn)注射pVAX，每只鼠100 μg/40 μL。每隔2周免疫1次，共免疫3次，末次免疫1周后取血并分離血清。

1.2.6 ELISA試劑盒檢測小鼠血清IFN-γ濃度：洗板并拍干后加樣，復(fù)孔加入標(biāo)準(zhǔn)品，空白孔復(fù)孔加入標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，樣本孔加入血清樣本，每孔加入檢測抗體。封板膜封板震蕩，室溫孵育2 h。棄去液體洗滌，每孔加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素。封板膜封板，振蕩，室溫孵育45 min洗板，每孔加顯色底物TMB，避光室溫孵育20 min。每孔加終止溶液，終止反應(yīng)。測定并校準(zhǔn)吸光度值，計(jì)算出相應(yīng)的濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 HSV-1 gB和gD抗原的T細(xì)胞表位

根據(jù)文獻(xiàn)［5-7］，篩選出3條HSV-1 gB的無癥狀表位，2條HSV-1 gD的無癥狀表位。見表1。

利用生物信息學(xué)軟件Syfpeithi和IEDB，預(yù)測出HSV-1 gB和gD抗原的T細(xì)胞表位，分別命名為T1～T8。見表2。

表1 HSV-1 gB和gD的無癥狀表位Tab.1 Asymptomatic epitopes of HSV-1 gB and gD

表2 篩選的HSV-1 gB和gD的預(yù)測表位Tab.2 Predicted epitopes within HSV-1 gB and gD

將各表位按照其在基因組上的順序進(jìn)行串聯(lián)，表位間加間隔序列GS和內(nèi)源性蛋白水解酶位點(diǎn)RGRKRRS，并加入免疫球蛋白IgE引導(dǎo)序列和HATag標(biāo)簽。根據(jù)設(shè)計(jì)的多表位氨基酸序列復(fù)原成核苷酸序列，并命名為Tg，序列如下：ATGGATTGGACTT GGATTTTATTTTTGGTTGCTGCCGCAACCCGTGTCC ATTCTTACCCTTATGATGTCCCAGACTATGCTTTCG TAGTGTGGGCGCTTCTCGGTCTAGGCTCCACAGTT GCTGCCGGACACGCAACGCTGGGGTCAAATTTATT GACTACCCCTAAATTTACAGGTTCGTATCTTGCGA ACGGCGGATTCCTCATCGGGAGTAGCTCTATAGA ATTTGCTCGCCTAGGTTCCCGAATGCTGGGCGACG TCATGGCCGTAGGATCAGCATTAGCGGTGGGGTT GCTTGTTCTCCGGGGTAGAAAGAGGCGTTCGGCTG TCATTCTATTCGTAGTGATCGTTGGCAGTATACTGT TTGTCGTAATTGTGGGATTAGGGAGCGCCTTGGTT GATGCATCTCTTAAAATGGGTTCCTCACTCCCCAT CACGGTCTACTATGCGGGCTCGAGTCTACCAATAA CTGTATACTATGCTGGAAGCACCGTGGCCGTTTAC TCTCTGAAGATTTAA。將設(shè)計(jì)合成的多表位基因盒Tg交付給上海吉?jiǎng)P基因科技有限公司合成并定向克隆入質(zhì)粒pVAX，重組的質(zhì)粒命名為pVAX-Tg。

2.2 重組質(zhì)粒pVAX-Tg的真核細(xì)胞表達(dá)

SDS-PAGE凝膠電泳結(jié)果證實(shí)目的蛋白成功分離，SDS-PAGE凝膠電泳后進(jìn)行Western blotting鑒定。結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組pVAX-Tg出現(xiàn)了帶HA-Tag標(biāo)簽的陽性識(shí)別條帶，大小約18×103。而對(duì)照組pVAX未見帶HA-Tag標(biāo)簽陽性識(shí)別條帶，無目的蛋白的表達(dá)。見圖1。

圖1 pVAX-Tg的體外表達(dá)Fig.1 In vitro translation to detect pVAX-Tg expression

2.3 接種重組質(zhì)粒pVAX-Tg后小鼠產(chǎn)生細(xì)胞免疫反應(yīng)

IFN-γ是由T細(xì)胞產(chǎn)生的具有廣泛抗病毒和免疫調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞因子，本研究采用ELISA法檢測小鼠血清IFN-γ濃度，監(jiān)測細(xì)胞免疫的變化［8］。實(shí)驗(yàn)組小鼠接受重組質(zhì)粒pVAX-Tg免疫，對(duì)照組小鼠接受空載體質(zhì)粒pVAX免疫，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠血清IFN-γ濃度分別為（270.815±61.347）pg/mL和（96.428±20.452）pg/mL，實(shí)驗(yàn)組明顯高于對(duì)照組（P＜0.001）。

3 討論

HSV-1為廣泛存在于自然界的雙鏈DNA病毒，由核衣殼和包膜組成。核衣殼參與病毒的復(fù)制，包膜促進(jìn)HSV-1吸附宿主細(xì)胞。HSV-1包膜表面存在12種糖蛋白，分別為gB、gC、gD、gE、gG、gI、gH、gL、gJ、gM、gN和gK，糖蛋白在介導(dǎo)病毒入侵細(xì)胞和發(fā)揮免疫原性中起到重要作用。在這12種糖蛋白中，gB、gD的免疫原性最強(qiáng)，在介導(dǎo)病毒入侵和病毒潛伏中發(fā)揮重要作用，誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的體液免疫和細(xì)胞免疫，而且gB、gD的蛋白質(zhì)序列高度保守，不易突變［9］，因此本研究選取gB和gD的表位做為候選表位。雖然單一接種gB或gD核酸疫苗可以起到一定的免疫作用，但是免疫作用弱，保護(hù)作用不足以清除病毒感染，目前研究熱點(diǎn)主要是gB、gD多表位核酸疫苗。

近年來，生物信息學(xué)廣泛用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，在醫(yī)學(xué)各個(gè)領(lǐng)域做出突出貢獻(xiàn)。本研究通過生物信息學(xué)預(yù)測軟件預(yù)測HSV-1的gB、gD潛在T細(xì)胞抗原表位，聯(lián)合運(yùn)用多種軟件增加準(zhǔn)確性，結(jié)合已發(fā)表文獻(xiàn)中報(bào)道的明確具有保護(hù)作用的抗原表位，將預(yù)測表位和已知表位串聯(lián)起來，設(shè)計(jì)合成HSV-1多表位核酸疫苗。為了增加DNA疫苗的免疫原性，在起始段加入IgE引導(dǎo)序列，該免疫佐劑安全有效，對(duì)眼表無副作用，同時(shí)易于操作。序列間加入GS間隔序列和內(nèi)源性蛋白水解酶位點(diǎn)RGRKRRS，使各表位獨(dú)立發(fā)揮免疫作用，避免形成新的表位［4］。利用DNAMAN對(duì)序列進(jìn)行優(yōu)化選擇，將氨基酸序列復(fù)原成核苷酸序列，將核苷酸序列克隆入質(zhì)粒pVAX，成功構(gòu)建重組多表位核酸疫苗pVAX-Tg。該疫苗可在真核細(xì)胞中成功表達(dá)目的蛋白，與空載體相比，C57BL/6小鼠接種疫苗后血清IFN-γ顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。IFN-γ具有很強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)作用，對(duì)清除病毒有重要意義，可作為觀察疫苗是否有效的可靠指標(biāo)［8］。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建重組多表位核酸疫苗pVAX-Tg，并證實(shí)該疫苗能產(chǎn)生明顯的免疫反應(yīng)，為單純皰疹病毒性角膜炎的防治提供了新的方向，具有一定意義。今后還需進(jìn)一步探討更多針對(duì)疫苗的研究策略。