李云飛 華陳意 宗凱 孫娟娟 盛旋 余曉峰 王滿滿 陳雨 姚劍

摘要：真菌病害是制約水稻高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的重要障礙因素之一。為了研究水稻種子中真菌發(fā)生情況，對分離自水稻種子中的一株真菌進行系統(tǒng)發(fā)育分析及功能評價。在形態(tài)學(xué)鑒定基礎(chǔ)上，以通用引物ITS1/ ITS4對目標(biāo)真菌序列進行PCR擴增、序列對比分析、鄰接法（NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。通過菌落培養(yǎng)特征、孢子形態(tài)特征觀察，分離菌株S-51的形態(tài)特征與文獻中雪霉葉枯病菌（Microdochium nivale）的描述極為相似；序列比對結(jié)果表明，目標(biāo)真菌與雪霉葉枯病菌（M. nivale）相近，相似率為100%；系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，其與雪霉葉枯病菌株在同一條分支上，雪霉葉枯病菌M. nivale和M. musae的親緣關(guān)系最近。利用ITS片段開展的序列分析和系統(tǒng)進化樹構(gòu)建，結(jié)合形態(tài)特征，能夠確定分離自水稻種子中的S-51菌株為雪霉葉枯病菌（M. nivale）。

關(guān)鍵詞：水稻種子；雪霉葉枯病菌；ITS；分類地位；物種鑒定

中圖分類號：S412文獻標(biāo)志碼：A論文編號：cjas20190500034

A Fungus from Rice： Species Identification and Phylogenetic Analysis Li Yunfei1， Hua Chenyi1， Zong Kai1， Sun Juanjuan1， Sheng Xuan1， Yu Xiaofeng1， Wang Manman1， Chen Yu2， Yao Jian1

（1Technical Center of Hefei Customs， Hefei 230022， Anhui， China； 2Institute of Plant Protection and Agro-Products Safety， Anhui Academy of Agricultural Sciences， Hefei 230031， Anhui， China）

Abstract： Fungal disease is one of the important obstacles for high and stable yield of rice. In order to study the occurrence of fungi in rice seeds， the phylogenetic analysis and functional evaluation of a fungus isolated from rice seeds were carried out. On the basis of morphological identification， the target fungal sequence was amplified by PCR with ITS1/ITS4， and the phylogenetic tree was constructed by neighbor-joining （NJ） and analyzing the sequence. The morphological characteristics of strain S- 51 were very similar to those of Microdochium nivale in the literature， and the sequence alignment showed that the target fungi were similar to M. nivale， and the similarity rate was 100%. M. nivale and M. musae had the closest genetic relationship on the same branch as the strain of snow mold leaf blight. Sequence analysis and phylogenetic tree construction based on ITS fragments and combined with morphological characteristics could identify S-51 strain isolated from rice seeds as M. nivale.

Keywords： Rice Seed； Microdochium nivale； ITS； Taxonomic Status； Species Identification

0引言

水稻屬于禾本科（Gramineae）稻屬（Oyrzae），廣泛分布于熱帶和亞熱帶地區(qū)。水稻是世界上最重要的糧食作物之一，世界一半以上的人口以稻米為主要糧食來源[1]。據(jù)統(tǒng)計，全世界有122個國家種植水稻，栽培面積在1.40億～1.57億hm2。中國水稻的種植面積約占全國耕地面積的1/4，年產(chǎn)量約占全國糧食總產(chǎn)量的一半。在水稻生產(chǎn)過程中，病害問題是制約水稻高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的重要障礙因素之一，全世界水稻病害種類近百種，其中真菌病約50種[2-3]。水稻病害發(fā)生后防治與否，對產(chǎn)量損失影響極大，水稻病害經(jīng)綜合防治后可挽回損失80%以上。不同病害的流行規(guī)律各不相同，防治方法亦不一樣，因此病原物的準確分類鑒定顯得尤為重要。

形態(tài)學(xué)分類法，是基于細胞形態(tài)、大小、菌落形態(tài)、培養(yǎng)基上的生長狀態(tài)等指標(biāo)進行分類鑒定的一種方法[4]，各種生物的分類鑒定都是以形態(tài)特征為基礎(chǔ)發(fā)展起來的[5]。宋鎮(zhèn)慶等[6]根據(jù)形態(tài)特征對遼寧地區(qū)引起水稻苗綿腐病的真菌進行了分類鑒定。代麗婷[7]根據(jù)病菌形態(tài)特征對黑龍江省9個地區(qū)的冬小麥分離真菌進行了鑒定。賈菊生等[8]對分離于棉花、茄和蒼耳的6個菌株進行了形態(tài)學(xué)鑒定，確定其為大麗輪枝菌。但真菌形態(tài)特征復(fù)雜、種類繁多，缺乏統(tǒng)一標(biāo)準的描述，主觀性較強，且形態(tài)特征指標(biāo)易受多種因素的影響而不穩(wěn)定[9-10]。另外，真菌形態(tài)學(xué)研究不能應(yīng)用于人工培養(yǎng)的真菌中[11]。因此，形態(tài)學(xué)分類法只有結(jié)合分子生物學(xué)方法才能使分類鑒定效果更佳。胡渤洋等[12]對分離自楊柳科楊屬毛白楊的BUA-01菌株子實體形態(tài)特征進行了鑒定，同時基于ITS的系統(tǒng)發(fā)育樹對該菌株進行了分析，最終結(jié)合形態(tài)特征和ITS鑒定，確定BUA-01菌株為毛栓菌（Trametes hirsute）。張鉉哲等[13]從東北三省采集的26份水稻等谷物類樣品中分離獲得254株病原真菌，通過形態(tài)學(xué)方法鑒定，包括6種屬的病原菌，以分子生物學(xué)手段繼續(xù)進行了鑒定，保證了鑒定結(jié)果的準確性，分離獲得的病原菌分別為鐮孢菌屬、平臍蠕孢屬、根霉屬、曲霉屬、鏈格孢菌屬和枝孢屬。陳洪亮等[14]從大田感病水稻葉片上分離了病原真菌，隨后對病原菌的形態(tài)特征和分子生物學(xué)特征分別進行了研究，明確了該病原菌的分類地位，確定其為稻平臍蠕孢（Bipolaris oryzae）。

本研究先用傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)方法對分離菌株進行分類研究，再對ITS基因進行擴增和序列測定，利用鄰接法neighbor-joining （NJ）進行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，建立了目標(biāo)真菌的鑒定體系。將形態(tài)學(xué)鑒定和分子生物學(xué)鑒定相結(jié)合，對其分類地位進行確定。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)手段的不斷改進和創(chuàng)新，越來越多的學(xué)者重視真菌的分類研究，能夠解決真菌屬、種間系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系問題，也能為指導(dǎo)田間防治提供可靠依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試菌株供試菌株S-51為本實驗室自水稻種子中分離純化獲得。

1.1.2試劑耗材引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；2×PCR Taq Master Mix，購自天根生化科技（北京）有限公司；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA），購自青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1菌株的分離取50 g水稻種子置于無菌水中室溫浸泡處理1天，轉(zhuǎn)入-20℃下冷凍處理1天，1%次氯酸鈉消毒60 s，無菌水洗滌3次后，用滅菌濾紙吸干水分按10粒/皿置于PDA培養(yǎng)基上，在25～28℃，12 h黑暗/ 12 h光照（12 h光暗交替）條件下培養(yǎng)，第3天開始觀察，根據(jù)種子周圍新生菌落的形態(tài)和顏色進行分離。病原菌純化采用單孢子分離法[15]。

1.2.2培養(yǎng)性狀和形態(tài)學(xué)觀察觀察培養(yǎng)基上菌落的顏色、形態(tài)和大小等，采用十字交叉法測量菌落直徑。插片法取樣[16]，染色后光學(xué)顯微鏡下觀察菌絲、分生孢子等。另，保存菌株于CTAB緩沖液的Eppendorf管中用于DNA提取。

1.2.3分子生物學(xué)鑒定CTAB法提取菌株總DNA，使用真菌通用引物（ITS1/ITS4）進行PCR擴增。PCR擴增引物為ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）、ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）。PCR反應(yīng)體系50μL：模板2μL，2×PCR Taq Master Mix 25μL，10μmol/L正向引物和反向引物各1μL，滅菌雙蒸水補足至50μL。PCR反應(yīng)程序：94℃5 min；94℃45 s，55℃45 s，72℃1 min，35個循環(huán)；72℃7 min。PCR擴增產(chǎn)物進行DNA純化、測序，由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。

1.2.4系統(tǒng)發(fā)育樹的建立將測得的ITS序列在GenBank中進行Blast比對分析，比對和查找親源關(guān)系較近菌株的基因序列，并下載。使用MEGA7軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，從而確定菌株的分類地位[17]。

2結(jié)果與分析

2.1形態(tài)學(xué)特征

在PDA培養(yǎng)基上，初生菌落白色、后期菌落中間褐色，初生菌落背面淡黃色，氣生菌絲稀疏，呈薄絨狀，菌落生長速度略慢，培養(yǎng)7天的菌落直徑為4.5 cm，平均6.4 mm/d。菌落邊緣整齊，形成同心環(huán)，在每天光照12 h的條件下培養(yǎng)，菌落上最終形成顏色深淺程度不同的同心環(huán)，從內(nèi)到外顏色逐漸變淺（圖1）。培養(yǎng)7天開始產(chǎn)生分生孢子，可產(chǎn)生橙色孢子團。顯微鏡下觀察小型分生孢子長橢圓，無色；大型分生孢子新月形，兩端鈍圓，無色，以1個和3個隔膜居多。產(chǎn)孢細胞瓶形或倒梨形，頂端較細（圖2）。分離菌株S-51的形態(tài)特征與文獻中[7，18-19]雪霉葉枯病菌（Microdochium nivale）的描述極為相似。

2.2基因序列分析結(jié)果

應(yīng)用ITS通用引物進行PCR擴增，S-51菌株獲得了500 bp左右的清晰條帶，電泳結(jié)果見圖3，將純化的PCR產(chǎn)物直接測序，獲得了506 bp的序列。

2.3系統(tǒng)進化樹構(gòu)建

將測序所得的ITS序列（506 bp），通過NCBI上GenBank數(shù)據(jù)庫進行序列比對，比對發(fā)現(xiàn)菌株S-51序列與NCBI上Query coverage值超過95%、Max idenl值超過97%的序列比對結(jié)果中，除了雪霉葉枯病菌（M. nivale）外其他的結(jié)果均為Microdochium sp.信息。下載親源關(guān)系較近或同屬菌株的基因序列及其相關(guān)信息，使用Mega7中的鄰接法（NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。選取了11個與本試驗菌株相似性較高或關(guān)系較近的ITS區(qū)段序列，進行系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建，外類群（Outgroup）使用引起水稻紋枯病的立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）。從進化樹（圖4）上可以看出，本研究菌株S-51與Genbank編號為KJ780751.1的雪霉葉枯病菌（M. nivale）單獨聚為1枝，兩者的親緣關(guān)系非常近，支持率達100%，與外類群相距較遠。結(jié)果表明，S-51菌株與雪霉葉枯病菌（KJ780751.1）相似度極高，雪霉葉枯病菌M. nivale和M. musae的親緣關(guān)系最近。

3討論與結(jié)論

關(guān)于雪霉葉枯病菌開展的相關(guān)研究中，其寄主均為小麥[7，18-19]，僅Broggi等[25]于1997—1998年之間在阿根廷恩特雷里奧斯省稻米主產(chǎn)區(qū)進行了一次真菌學(xué)調(diào)查，發(fā)現(xiàn)M. nivale為Microdochium屬在水稻種子中的優(yōu)勢種，其他關(guān)于水稻中分離到該菌的相關(guān)報道很少。本研究對一株水稻種子中分離的真菌進行鑒定，確定其為雪霉葉枯病菌（M. nivale）。

由于某些真菌的屬或種在形態(tài)學(xué)特征方面差異極不明顯，給傳統(tǒng)的分類鑒定方法增加了難度，從分子水平來分析真菌的遺傳結(jié)構(gòu)已成為傳統(tǒng)分離鑒定的有效補充[20]。ITS區(qū)受到的選擇壓力較小，進化速率較快，在絕大多數(shù)真核生物中表現(xiàn)出了極為廣泛的序列多態(tài)性[21- 23]，可廣泛用于種間、種內(nèi)群體間的系統(tǒng)學(xué)研究[24]。筆者利用真菌通用引物ITS1和ITS4擴增了分離所獲菌株的部分rDNA-ITS序列，長度為506 bp，包括18S rDNA部分序列、ITS1-5.8S-ITS2全序列和28S rDNA部分序列。利用這個片段開展的序列分析和系統(tǒng)進化樹構(gòu)建，結(jié)合形態(tài)特征，能夠確定分離自水稻種子中的S-51菌株為雪霉葉枯病菌（M. nivale）。

研究中未見該菌在水稻上的危害癥狀，其是否能引起田間水稻發(fā)病，有待今后進一步調(diào)查研究。鑒于水稻種植目前在中國的重要地位，積極研究其潛在病害的發(fā)生情況，對預(yù)防病害的發(fā)生有著重要意義，也為生產(chǎn)中防控該病害提供了理論依據(jù)。

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