王一菲，劉新星，張青，鄭育聲，李東棟

海南大學(xué)熱帶作物學(xué)院,?？?570228

油棕(ElaeisguineensisJacq.)是棕櫚科單子葉熱帶植物，它主要生產(chǎn)2種棕櫚油和棕櫚仁油，占世界油量的36%[1]。其中，棕櫚油含有棕櫚酸、油酸、維生素E和類胡蘿卜素，具有極高的營養(yǎng)價值[2]。應(yīng)用基因工程手段鑒定油棕中與油脂代謝相關(guān)基因的功能，進(jìn)而對其脂肪酸種類和含量進(jìn)行遺傳修飾，對提高棕櫚油的產(chǎn)量及改善其品質(zhì)具有重要的價值。

然而，作為多年生木本植物，油棕植株再生體系周期很長，轉(zhuǎn)基因植株也不易獲得。因此，研究者通常將油棕基因異源表達(dá)于模式植物如擬南芥中，以研究其功能。但由于遺傳背景差別太大而無法取得滿意的效果。原生質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)化系統(tǒng)快速、高效，被廣泛用于亞細(xì)胞定位、蛋白與蛋白之間的互作、蛋白與啟動子之間的特異性結(jié)合等研究[3]。利用油棕原生質(zhì)體進(jìn)行基因的同源表達(dá)，將有效避免異源表達(dá)可能造成的差異結(jié)果。

目前，油棕原生質(zhì)體的分離[4-6]及瞬時轉(zhuǎn)化[7]雖然有過報道，但其原材料都是油棕胚性懸浮細(xì)胞。然而由胚性愈傷到胚性懸浮細(xì)胞要3個月[4]，耗時長。因此，本研究以油棕試管苗葉片為原材料，分離得到原生質(zhì)體，并借助綠色熒光蛋白和紅色熒光蛋白，對油棕葉肉原生質(zhì)體的雙質(zhì)粒瞬時共轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行優(yōu)化，旨在為油棕基因的同源表達(dá)、功能鑒定及蛋白質(zhì)與DNA、蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的互作研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

油棕(ElaeisguineensisJacq.)試管苗幼嫩葉片(發(fā)芽后25 d)，以海南大學(xué)熱帶棕櫚植物實驗室誘導(dǎo)獲得的油棕愈傷組織為基礎(chǔ)，通過芽誘導(dǎo)獲得幼嫩植株。綠色熒光蛋白載體pGreen Ⅱ 62-SK-EGFP和紅色熒光蛋白載體pGreen Ⅱ 0800-DsRed2載體皆購買于優(yōu)寶生物公司。纖維素酶、離析酶、MES酸和BSA購自Solarbio公司，甘露醇、PEG4000、氯化鎂等購自西隴科學(xué)公司。

1.2 油棕葉肉原生質(zhì)體的分離

油棕葉肉原生質(zhì)體分離參照擬南芥葉片原生質(zhì)體的分離方法[8]，稍有改動。將幼嫩油棕試管苗葉片切成0.5 mm寬的細(xì)絲，浸沒于15 mL過濾除菌后的酶解液中。酶解液的配方為：30 g/L的纖維素酶、8 g/L的離析酶、0.4 mol/L的甘露醇、20 mmol/L 的氯化鉀、20 mmol/L 的MES、10 mmol/L的氯化鈣和1 g/L的BSA。然后在室溫、避光、轉(zhuǎn)速為60 r/min的條件下孵育3.5 h。再將其用80 μm的細(xì)胞過濾篩過濾到離心管中，加入20 mL的洗液(30 g/L KCl、5 g/L CaCl2·2H2O和36 g/L 甘露醇，pH 5.6)，2 000 r/min、4 ℃離心5 min，棄上清。最后加入適量的懸浮液(30 g/L KCl和36 g/L甘露醇，pH 5.6)重懸原生質(zhì)體，使原生質(zhì)體的量為4×105/mL。

1.3 油棕葉肉原生質(zhì)體的瞬時轉(zhuǎn)化

油棕葉肉原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化方法參照文獻(xiàn)[7]進(jìn)行并有稍許改動。取200 μL的油棕原生質(zhì)體(4×105/mL)于2 mL 的離心管，加入10 μg 的pGreen Ⅱ 62-SK-EGFP質(zhì)粒和10 μg的 pGreen Ⅱ 0800-DsRed2質(zhì)粒，混勻，冰上靜置30 min后，45 ℃熱激5 min，再于冰上靜置2 min。然后室溫黑暗孵育30 min，轉(zhuǎn)移混合液于6孔板中。加入等量的PEG/Mg2+溶液(100 g/L 的PEG 4000和50 g/L的氯化鎂)，于黑暗中靜置孵育10 min。然后再加入4 mL的洗液(30 g/L KCl、5 g/L CaCl2·2H2O和36 g/L甘露醇，pH 5.6)，室溫弱光誘導(dǎo)16 h，4 ℃、2 000 r/min離心5 min，棄上清，加200 μL的洗液重懸原生質(zhì)體，在熒光倒置顯微鏡下觀察并計算轉(zhuǎn)化效率。

為了獲得更高的轉(zhuǎn)化效率，對轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行梯度設(shè)置：pGreen Ⅱ 0800-DsRed2質(zhì)粒質(zhì)量設(shè)置為1.25、2.50、5.00和10.00 μg，45 ℃熱激時間設(shè)置為5、10、15、20和25 min，PEG/Mg2+溶液中PEG 4000的質(zhì)量濃度設(shè)為100、200、400和600 g/L，氯化鎂的質(zhì)量濃度設(shè)為50、100、200和300 g/L，加入PEG/Mg2+溶液后孵育時間設(shè)為10、20和30 min，最后加入的洗液體積為2和4 mL。

1.4 轉(zhuǎn)化效率的計算

轉(zhuǎn)化效率參照Masani等[7]的方法計算。油棕葉肉原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化完成后，取原生質(zhì)體于熒光倒置顯微鏡下觀察。轉(zhuǎn)化效率=(發(fā)出熒光的原生質(zhì)體數(shù)目/總原生質(zhì)體個數(shù))×100%。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

每個樣本3個平行。所有數(shù)據(jù)利用SPSS軟件進(jìn)行顯著性分析。2組數(shù)據(jù)間的差異性檢驗方法為“獨立樣本t檢驗”，多組數(shù)據(jù)間的差異性檢驗方法為“Duncan’s multiple range test”。

2 結(jié)果與分析

2.1 油棕葉肉原生質(zhì)體的分離

以再生1個月內(nèi)的油棕幼芽葉片(圖1A)為原材料，按本文“1.2”的方法進(jìn)行操作，得到油棕葉肉原生質(zhì)體(圖1B)。

A. 油棕試管苗幼葉 Young leaves of oil palm plantlet； B. 油棕葉肉原生質(zhì)體 Oil palm mesophyll protoplasts.

2.2 油棕葉肉原生質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化

1)質(zhì)粒含量對油棕葉肉原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化效率的影響。將10 μg的綠色熒光蛋白質(zhì)粒pGreen Ⅱ62-SK-EGFP分別和1.25、2.50、5.00、10.00 μg的紅色熒光蛋白質(zhì)粒pGreenⅡ 0800-DsRed2，按照本文“1.3”的方法，共轉(zhuǎn)入相同含量的原生質(zhì)體中，計算轉(zhuǎn)化效率，結(jié)果(圖2A)顯示，轉(zhuǎn)化效率隨質(zhì)粒pGreen Ⅱ 0800-DsRed2含量的降低而升高，當(dāng)pGreen Ⅱ62-SK-EGFP質(zhì)粒為10 μg、pGreen Ⅱ0800-DsRed2質(zhì)粒為1.25 μg時，轉(zhuǎn)化效率最高，為0.068%。

2)PEG/Mg2+溶液的誘導(dǎo)時間對油棕葉肉原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化效率的影響。為了研究加入PEG/Mg2+溶液的孵育時間對轉(zhuǎn)化效率的影響，將10 μg的pGreenⅡ62-SK-EGFP質(zhì)粒和1.25 μg的pGreen Ⅱ 0800-DsRed2質(zhì)粒共轉(zhuǎn)入油棕葉肉原生質(zhì)體，對PEG/Mg2+溶液的誘導(dǎo)時間梯度設(shè)置為：10、20和30 min。結(jié)果顯示，當(dāng)誘導(dǎo)時間為20 min時，轉(zhuǎn)化效率最高，為0.418%(圖2B)。

3)PEG 4000質(zhì)量濃度對油棕葉肉原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化效率的影響。在PEG誘導(dǎo)的原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化體系中，PEG質(zhì)量濃度是影響轉(zhuǎn)化效率的重要因素之一，在質(zhì)粒含量和PEG/Mg2+溶液的誘導(dǎo)時間都是最優(yōu)的條件下，檢測了PEG/Mg2+溶液中的PEG4000的質(zhì)量濃度(100、200、400和600 g/L)對轉(zhuǎn)化效率的影響。結(jié)果顯示，當(dāng)PEG 4000的質(zhì)量濃度為200 g/L時，轉(zhuǎn)化效率最高，為0.500%，過低或過高濃度的PEG 4000都會使轉(zhuǎn)化效率降低(圖2C)。

4)熱激時間對油棕葉肉原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化效率的影響。結(jié)果(圖2D)顯示，在其他轉(zhuǎn)化條件皆相同，熱激時間分別為5、10、15、20和25 min時，轉(zhuǎn)化效率先是隨著熱激時間的增加而降低，當(dāng)熱激時間為10 min時，轉(zhuǎn)化效率比熱激時間為5 min的低；然而當(dāng)熱激時間再延長，轉(zhuǎn)化效率隨之升高，且熱激時間為20 min時，轉(zhuǎn)化效率達(dá)到最高，為0.528%；最后，當(dāng)熱激時間為25 min時，轉(zhuǎn)化效率最低。

5)氯化鎂質(zhì)量濃度對油棕葉肉原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化效率的影響。在質(zhì)粒含量、PEG/Mg2+溶液的誘導(dǎo)時間、PEG4000質(zhì)量濃度和熱激時間都為最優(yōu)的條件下，檢測了氯化鎂的質(zhì)量濃度分別為50、100、200和300 g/L時原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化效率。從圖2E可見，當(dāng)氯化鎂的質(zhì)量濃度為100和200 g/L時，轉(zhuǎn)化效率最高，為2.85%，為了節(jié)約成本，選擇100 g/L進(jìn)行后續(xù)實驗。

6)過夜培養(yǎng)時液體體積對油棕葉肉原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化效率的影響。在其他條件都為最優(yōu)的情況下，進(jìn)行了油棕葉肉原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化，然后分別加入2和4 mL的洗液進(jìn)行過夜培養(yǎng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)加入2 mL洗液時，轉(zhuǎn)化效率最高，為4.82%(圖2F)。

不同小寫字母表示經(jīng)Duncan’s multiple range test檢驗差異顯著。2組數(shù)據(jù)間的差異性檢驗方法為“獨立樣本t 檢驗”：”*”表示顯著性差異(P<0.05 )； “**”表示極顯著性差異(P< 0.01)。Different lowercase letters indicate significant differences (P<0.05) using Duncan’s multiple range test. “*” and “**” indicated significant differences (P<0.05) or (P<0.01) using independent-samples t test.

washing solution(F ) on transient transformation efficiency of oil palm mesophyll protoplasts

2.3 最優(yōu)條件下油棕葉肉原生質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)化

在最優(yōu)條件下即pGreenⅡ 62-SK-EGFP質(zhì)粒為10 μg、pGreenⅡ 0800-DsRed2質(zhì)粒為1.25 μg、45 ℃的熱激時間為20 min、PEG/Mg2+溶液中的PEG 4000質(zhì)量濃度為200 g/L、氯化鎂的質(zhì)量濃度為100 g/L、加入PEG/Mg2+溶液后的孵育時間為20 min，最后加入的洗液的體積為2 mL進(jìn)行了油棕葉肉原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化， 熒光倒置顯微鏡觀察結(jié)果(圖3)顯示，GFP和RFP都正常表達(dá)在整個原生質(zhì)體中，證明此油棕葉肉原生質(zhì)體的雙質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化體系可行。

圖3 雙質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化油棕葉肉原生質(zhì)體

3 討 論

原生質(zhì)體由于沒有細(xì)胞壁，更易于接受外源DNA，且瞬時表達(dá)周期短，能更快地獲得實驗數(shù)據(jù)，常被用于亞細(xì)胞定位、實時監(jiān)測胞內(nèi)生化反應(yīng)、qRT-PCR檢測基因的表達(dá)模式、驗證蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)與DNA的互作等，對鑒定植物基因的功能有著重要意義[9]。Bai等[10]利用大麥原生質(zhì)體進(jìn)行了亞細(xì)胞定位，發(fā)現(xiàn)OsSPCH定位于細(xì)胞核，OsLrgB定位于葉綠體；同時利用qRT-PCR檢測了共轉(zhuǎn)miR393a和其靶基因后的大麥原生質(zhì)體中靶基因的表達(dá)水平，從而證明了兩者間的靶向關(guān)系。Lin等[11]利用植物原生質(zhì)體檢測了CRISPR/Cas9的誘變效率；同時以煙草原生質(zhì)體為材料，利用CRISPR/Cas9對NtPDS進(jìn)行靶向突變，最終獲得突變后的再生植株。Liu等[12]通過擬南芥原生質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)化體系，鑒定出BnWRKY15和BnWRKY33都定位于細(xì)胞核；同時借助雙螢光素酶報告系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)BnWRKY15在擬南芥原生質(zhì)體中，能抑制BnWRKY33的反式激活能力。Menzel等[13]在擬南芥葉肉原生質(zhì)體中通過免疫印跡法檢測了flg22處理對PIP5K6磷酸化的影響。

以往報道的油棕原生質(zhì)體的分離大都是油棕細(xì)胞培養(yǎng)物，且多用于植株再生。Bass等[5]從油棕細(xì)胞培養(yǎng)物中分離出原生質(zhì)體，經(jīng)培養(yǎng)后再生出細(xì)胞壁。Sambanthamurthi等[6]從多胚培養(yǎng)物中分離出原生質(zhì)體，并培養(yǎng)得到微小愈傷組織。Masani等[4]由細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物分離得到原生質(zhì)體，并再生成植株。Masani等[7]還報道了來源于細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物的原生質(zhì)體的單個質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)化體系，轉(zhuǎn)化效率為4.76%。但是，獲得油棕胚性愈傷需要5～10個月，由胚性愈傷到胚性懸浮細(xì)胞則又要花費3個月[4]。以細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物為原材料分離原生質(zhì)體將會拖慢實驗進(jìn)程。而油棕葉片是最為容易獲得的材料，因此，本研究以油棕試管苗葉片為原材料，分離原生質(zhì)體，整個過程僅需5 h。與擬南芥葉肉原生質(zhì)體的分離相比[8]，油棕葉片所用酶解液中的纖維素酶和離析酶為擬南芥的2倍，可能與木本植物結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜、組織間內(nèi)含物更豐富有關(guān)[14]。

分離得到油棕葉肉原生質(zhì)體后，考慮到大多數(shù)實驗需要同時轉(zhuǎn)入2個基因，以驗證兩者間的關(guān)系，本研究按照Masani等[7]報道的最優(yōu)體系將2個質(zhì)粒(各10 μg)共轉(zhuǎn)入原生質(zhì)體中，然而轉(zhuǎn)化效率極低，僅有0.028%(圖2A)，這可能是由于原生質(zhì)體來源于葉片而非懸浮細(xì)胞，且轉(zhuǎn)入質(zhì)粒為2個。Peng等[15]發(fā)現(xiàn)熱激處理有利于提高秈稻原生質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)化的效率。本研究中，當(dāng)熱激時間為20 min時，油棕葉肉原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化效率達(dá)到最高，縮減或延長熱激時間都會使轉(zhuǎn)化效率降低。在PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化中，質(zhì)粒的質(zhì)量比、PEG濃度、PEG誘導(dǎo)時間對轉(zhuǎn)化效率具有重要影響。當(dāng)pGreen Ⅱ62-SK-EGFP質(zhì)粒為10 μg、pGreen Ⅱ0800-DsRed2質(zhì)粒為1.25 μg時，油棕葉肉原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化效率最高。高分子質(zhì)量的PEG溶液對原生質(zhì)體有毒害作用[16]，而PEG濃度過低，會導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效率過低，因此，PEG濃度是優(yōu)化原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵因素。本研究中油棕葉肉原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的最適PEG4000質(zhì)量濃度為200 g/L、誘導(dǎo)時間為20 min。Lazzeri等[17]發(fā)現(xiàn)，與Ca2+相比，Mg2+對PEG介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化有更好的促進(jìn)作用。本研究對氯化鎂的質(zhì)量濃度進(jìn)行了優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)其最適質(zhì)量濃度為100 g/L。此外，由于過夜孵育前，加入的洗液體積會直接影響到PEG、Mg2+的最終濃度，且此濃度下的PEG和Mg2+將與原生質(zhì)體一同孵育16 h，分別檢測了加入2 mL和4 mL時，油棕葉肉原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化效率，發(fā)現(xiàn)加入2 mL時，效率更高。然而，世界范圍內(nèi)，鮮少報道油棕原生質(zhì)體的瞬時轉(zhuǎn)化，與模式植物擬南芥相比，油棕原生質(zhì)體的瞬時轉(zhuǎn)化體系尚不成熟。本研究在最優(yōu)組合條件下，轉(zhuǎn)化效率為4.82%，遠(yuǎn)低于大麥(83%)[10]、擬南芥(90%)[18]、水稻[19](53%～75%)等體系。

本研究以油棕試管苗葉片為原材料，在酶解液中的纖維素酶為30 g/L、離析酶為8 g/L時，分離得到了油棕葉肉原生質(zhì)體，并對雙質(zhì)粒瞬時共轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行了優(yōu)化。最優(yōu)轉(zhuǎn)化條件如下：pGreenⅡ62-SK-EGFP質(zhì)粒為10 μg、pGreen Ⅱ0800-DsRed2質(zhì)粒為1.25 μg，45 ℃的熱激時間為20 min，PEG/Mg2+溶液中的PEG 4000的質(zhì)量濃度為200 g/L、氯化鎂的質(zhì)量濃度為100 g /L，加入PEG/Mg2+溶液后的孵育時間為20 min，最后加入的洗液體積為2 mL。此瞬時轉(zhuǎn)化體系為油棕基因的同源表達(dá)提供了可能，可以用于亞細(xì)胞定位、蛋白質(zhì)與DNA或蛋白質(zhì)互作、基因表達(dá)模式等研究，有效地縮短了試驗周期，為油棕基因的功能驗證提供了一種新的手段。