石林林，陳家豪，石瑞雪，費佳敏，張龍，李艷和,2

1.華中農(nóng)業(yè)大學水產(chǎn)學院/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水生物繁育重點實驗室/農(nóng)業(yè)動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室，武漢 430070；2.長江經(jīng)濟帶大宗水生生物產(chǎn)業(yè)綠色發(fā)展教育部工程研究中心，武漢 430070

Doublesex(Dsx)最早在黑腹果蠅(Drosophilamelanogaste)中發(fā)現(xiàn)，是果蠅性別決定級聯(lián)通路下游的兩性基因。該基因與秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans)的性別決定基因Maleabnormal-3(Mab-3)及其同源基因均屬于Dmrt基因家族(doublesex and Mab-3 related transcription factor)，它們編碼的蛋白均含有1個保守的DM(double-sex and mab-3)結構域[1-2]。性別決定機制的進化過程十分迅速，但Dmrt家族是個例外，它參與了從無脊椎動物到人類的性別發(fā)育，是一個保守性較高的古老的性別調(diào)控基因家族。Dsx在昆蟲性別決定的整個級聯(lián)通路中最為保守，因此，Dsx常被作為其他昆蟲及昆蟲以外的動物性別決定和分化研究的突破口。

甲殼綱動物被認為與昆蟲綱動物有著較近的進化關系，昆蟲類性別決定機制的研究發(fā)現(xiàn)給甲殼動物性別調(diào)控相關的研究人員帶來了新思路。目前，研究者已對多種甲殼動物的Dsx及同源基因進行了研究。研究者在大型溞(Daphniamagna)中獲得了Dmrt93B基因，發(fā)現(xiàn)其只在精巢中表達[3]；此外，還獲得Dsx基因，其中Dsx1已被確定為環(huán)境性別決定過程中調(diào)控大型溞雄性特征發(fā)育的決定基因[4]。在羅氏沼蝦(Macrobrachiumrosenbergii)中，克隆出了Dmrt11E基因，發(fā)現(xiàn)其在精子發(fā)生過程中可以定位到精原細胞和精子中[5]。在東方刺龍蝦(Sagmariasusverreauxi)中還發(fā)現(xiàn)了1個Y連鎖的含有DM結構域的基因(iDMY)，是常染色體上iDmrt1的刪減版本，該基因可能通過顯性負效應調(diào)控常染色體上iDmrt1基因的功能而發(fā)揮性別決定與分化的作用[6]。

克氏原螯蝦(Proambausclarkii)，俗名淡水小龍蝦，是我國重要的淡水蝦類養(yǎng)殖品種。因其獨特的風味，較高的營養(yǎng)價值，深受人們的喜愛，被稱為夏季消費的“網(wǎng)紅”?？耸显r整體產(chǎn)業(yè)在我國具有非常重要的經(jīng)濟地位，2018年，全國小龍蝦養(yǎng)殖總面積達112萬hm2，其主要養(yǎng)殖方式為稻田養(yǎng)殖(84萬hm2)和池塘養(yǎng)殖(近20萬hm2)，養(yǎng)殖總產(chǎn)量達163.87萬t，經(jīng)濟總產(chǎn)值達3 690億元(中國小龍蝦產(chǎn)業(yè)發(fā)展報告https://www.360kuai.com/pc/90bd39d9c1a16c541?cota=3&kuai_so=1&sign=360_57c3bbd1&refer_scene=so_1)?？耸显r單性養(yǎng)殖模式的實現(xiàn)，有助于提高經(jīng)濟效益；同時還可以作為其傳播的一道防線，降低養(yǎng)殖過程中逃逸蝦在外界環(huán)境中泛濫孳生，從一定程度上對生態(tài)環(huán)境起到保護作用。

性別決定和性別分化機制的了解是實現(xiàn)單性選育的基礎。目前，克氏原螯蝦性別調(diào)控相關基因的研究，除了胰島素樣促雄性腺激素基因(insulin-like androgenic gland hormone gene,IAG)[7]外，未見有其他報道。因此，本研究利用RACE技術從克氏原螯蝦中獲得了PcDsxcDNA，并利用qRT-PCR檢測該基因在成年克氏原螯蝦不同組織及早期發(fā)育階段不同時期的表達情況，以期為甲殼動物性別調(diào)控機制的研究提供理論基礎，為克氏原螯蝦的單性選育提供理論和技術指導。

1 材料與方法

1.1 樣本收集

試驗所用克氏原螯蝦來自華中農(nóng)業(yè)大學水產(chǎn)養(yǎng)殖示范基地，養(yǎng)殖水溫20～23 ℃。為了解克氏原螯蝦Dsx基因的表達特征，采集成年克氏原螯蝦(雌、雄)個體的神經(jīng)、腦、心臟、肝胰腺、腸、觸角腺、肌肉、鰓、血細胞、皮膚、性腺等組織，收集克氏原螯蝦無節(jié)幼體期、蚤狀幼體期的受精卵及出膜后1、3、6、13、15、17、23、28、41、48、98、103、109、115 d的克氏原螯蝦頭胸甲樣品(n=5)。所有的樣品保存于RNA保存液中，用于后續(xù)RNA提取。

1.2 總RNA提取及cDNA合成

取得的RNA組織樣品用TRIZol法(QIAGEN，德國)提取總RNA，用Thermoscientific DNase I(RNase-free)試劑盒除去基因組DNA后，按RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒(Thermo Fisher Scientific，美國)說明書反轉錄成cDNA。

1.3 克氏原螯蝦PcDsx基因克隆

克氏原螯蝦PcDsx基因的cDNA部分序列從筆者所在實驗室測得的克氏原螯蝦Survey序列中獲得[8]，利用Primer 5軟件設計特異性引物PcDsx F/R，然后，根據(jù)獲得的cDNA部分序列按照SMARTer? RACE 5′/3′ Kit(TaKaRa，日本)的說明書設計擴增3′和5′端序列的引物，并反轉錄特異性cDNA模板，擴增PcDsx3′和5′端序列。以上引物均由武漢擎科創(chuàng)新生物科技有限公司合成，擴增PcDsxcDNA序列所用引物信息詳見表1。

表1 實驗所用引物信息表 Table 1 Primer used in the experiment

1.4 生物信息學分析

將測得的序列修剪后進行拼接(DNASTAR Lasergene，USA)，拼接后的序列用在線軟件 ORFfinder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)和Blast (NCBI,https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)分析，用DTU Bioinformatics (http://www.bioinformatics.dtu.dk/)和ExPASy(https://web.expasy.org/compute_pi/)推導其氨基酸序列，并分析其蛋白分子質(zhì)量和等電點，通過SMART在線軟件(http://smart.embl-heidelberg.de/)預測結構域。用在線軟件I-TASSER(https://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/)預測蛋白的三維結構。各物種的同源氨基酸序列來自NCBI，在MEGA 5.1軟件上，用clustalW法對各物種Dsx DM結構域氨基酸序列進行比較分析，并用鄰接法(NJ)構建系統(tǒng)進化樹，各物種Dsx DM結構氨基酸序列如表2所示。

表2 序列比對及建樹所用的Dsx/Dmrt氨基酸序列信息 Table 2 The sequences information of Dsx/Dmrt used in sequence alignment and phylogenetic tree analysis

1.5 qRT-PCR

通過qRT-PCR檢測克氏原螯蝦PcDsx的表達情況。反應體系為20 μL，包括F/R引物(10 μmol/L)各0.2 μL、雙蒸水8.6 μL、cDNA模板1 μL和SYBR Green(TaKaRa，日本)10 μL。反應程序為：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性15 s 57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環(huán)。18S-RNA作為內(nèi)參基因,用2-ΔΔCt法計算PcDsx的相對表達量。

1.6 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)在Microsoft Excel 2016軟件上進行統(tǒng)計，所有試驗數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，在SPSS 23.0 軟件上進行單因素方差分析(One-way ANOVA)，采用LSD法進行多重比較檢驗差異顯著性，以字母或“*”代表差異顯著性(P<0.05)，用軟件GraphPad Prism 7 作圖。

2 結果與分析

2.1 克氏原螯蝦PcDsx 基因的克隆

從精巢組織中獲得了PcDsxcDNA全長序列(1 584 bp)，包括243 bp 5′ UTR、765 bp ORF(編碼254 aa)和576 bp 3′ UTR(圖1)。該基因的3′ UTR區(qū)有2個mRNA快速降解信號(ATTTA)，在降解信號之后有1個GT富集和2個“TTTTTT”(圖1)。該基因編碼的蛋白有254 aa，相對分子質(zhì)量和等電點分別為28 559.80和6.46，預測的PcDsx蛋白含有1個N-糖基化位點(N78)和1個由55個氨基酸殘基組成的DM結構域，其二級結構和三維結構如圖2所示。

利用MEGA 5.1軟件將表2中所有基因的DM結構域氨基酸進行多重序列比較及進化樹分析，結果如圖3A和圖3B所示?？耸显rPcDsx與南美白對蝦(Penaeusvannamei)Dmrt1-like、中國明對蝦(Fenneropenaeuschinensis)PchDsx、東方刺龍蝦SvDsx的 DM結構域有5個保守的半胱氨酸殘基(C)，可以形成一個鋅結合位點(CCHC)，在進化樹中其蛋白也聚為一支，其中PcDsx與SvDsx的同源性最高；而果蠅和豐年蟲(Artemiafranciscana)的Dsx以及甲殼類、哺乳類Dmrt的DM結構域則有6個保守的半胱氨酸殘基(C)，可以形成2個鋅結合位點(CCHC和HCCC)，而其蛋白與PcDsx的同源性也較遠(圖3B)。

2.2 PcDsx在成年克氏原螯蝦各組織中的表達情況

PcDsx在成年雌雄克氏原螯蝦不同組織中的表達情況如圖4所示，在成年雄性克氏原螯蝦中，觸角腺中PcDsx表達量最高，其次是食道下神經(jīng)節(jié)、肌肉組織、精巢、心臟，其他各組織PcDsx表達相對較低，尤其在血和皮膚中；在成年雌性克氏原螯蝦中，PcDsx表達量最高的組織亦是觸角腺，其次是卵巢、肝胰腺、后腸和肌肉。此外，除了食道下神經(jīng)節(jié)、腦、肌肉組織、精巢、心臟和血中的PcDsx表達水平在雌雄個體間不存在差異，其他組織中PcDsx的表達在雌雄個體間均有顯著性差異，其中，在雌性的觸角腺、卵巢、肝胰腺、前腸、中腸、后腸、鰓和皮膚中表達水平顯著性高于雄性組織。

起始密碼子(ATG)用紅色字體表示，終止密碼子(TGA)用紅色字體及下方加*表示；mRNA快速降解信號(ATTTA)用黃色表示；GTF富集和TTTTTTT用藍色表示。預測的N-糖基化位點用綠色斜體字體表示，DM(doublesex DNA-binding motif)結構域用斜體加下滑線表示。The start codon (ATG) was marked with red,and the stop codon (TGA) was marked with red and indicated with “*”. The mRNA rapid degradation signal (ATTTA) was shown in yellow. GT-rich and “TTTTTT” were marked with blue. Predicted N-glycosylated sites were indicated in green italic font. The deduced doublesex DNA-binding motif (DM) sequences were indicated by itlics and underlined.

A:預測的PcDsx蛋白結構域。“DM”表示DM結構域，紅色區(qū)域為低復雜度區(qū)域。B:預測的PcDsx蛋白三維結構圖。A:The Predicted domains of PcDsx. “DM” indicates doublesex DNA-binding motif,and red box indicates low complexity region. B:The predicred three-dimensiona structure of PcDsx.

2.3 PcDsx在克氏原螯蝦早期發(fā)育不同時期的表達情況

PcDsx在克氏原螯蝦早期發(fā)育不同時期的表達情況如圖5所示。從無節(jié)幼體期開始PcDsx的表達水平逐漸升高，在出膜后1～3 d出現(xiàn)高峰，此后，PcDsx的表達水平逐漸降低，在可以通過外部結構鑒別雌雄(出膜后23 d)后，雌性幼蝦中PcDsx的表達水平在出膜后41 d最高，在出膜后98 d次之，而在雄性幼蝦中PcDsx表達水平在出膜后115 d 最高，在出膜后109 d次之。有意思的是，在出膜后23 d，雌性幼蝦中PcDsx表達水平明顯高于雄性，在出膜后41、98、103 d亦是如此；而在出膜后28、48、109 d 和115 d則是雄性幼蝦明顯高于雌性。

A:Dsx/Dmrt DM結構域的多重比較分析，多序列比較的方法為clustal W法，保守性大于50%的氨基酸殘基用彩方形背景突出。B:Dsx/Dmrt DM結構域的進化分析。在MEGA 5.1軟件上采用 Neighbor-Joining法構建進化樹，bootstrap值設置為1 000次計算重復；克氏原螯蝦加紅色方框標記。多重比較及建樹所用 Dsx或Dmrt相關序列信息見表2。A:Multiple alignment analysis of Dsx/Dmrt DM domains. The alignment was performed by the clustal W algorithm. The identical residue sites in regions with more than 50% conserved level were highlighted with a colored square background. B:Evolutionary analysis of Dsx/Dmrt amino acid sequences. The analysis was constructed by the Neighbor-Joining method with bootstrapping 1 000 replicates,using MEGA 5.1 software. P. clarkii was marked with a red box. The Dsx/Dmrt related information used for multiple alignment and evolutionary analysis were listed in Table 2.

VG：腹部腹神經(jīng)索 Ventral ganglia；TG：胸部腹神經(jīng)索 Thoracic ganglia；SG：食道下神經(jīng)節(jié)Subesophageal ganglia；PN：圍食道神經(jīng) Periesophageal nerve；Br：腦Brain；Hea：心臟Heart；Hep：肝胰腺Hepatopancreas；FG：前腸 Foregut；MG：中腸Midgut；HG：后腸Hindgut；AnGl：觸角腺Antennary glands；Mu：肌肉Muscle；Gi：鰓Gill；Hem：血Hemocytes；Hy：皮膚Hypodermis；Te：精巢Testis；Ov：卵巢Ovary；TD：輸精管Testicular ducts；AG：促雄性腺Androgenic gland； *： P <0.05；**：P<0.01。PcDsx在成年雄性克氏原螯蝦各組織中表達的顯著性差異用大寫字母表示(P<0.05)，PcDsx在成年雌性克氏原螯蝦各組織中表達的顯著性差異用小寫字母表示(P<0.05)，PcDsx在雌雄相同組織中表達的顯著性差異用星號表示。Different upper-case letters indicated significant differences in the expression levels of PcDsx in different tissues of male P. clarkii (P<0.05). Different lower-case letters indicated significant differences in the expression levels of PcDsx in different tissues of female P. clarkii (P<0.05). Asterisks indicated significant differences in the expression levels of PcDsx between male and female the same tissue.

NS：無節(jié)幼體期 Nauplius stage； ZS：蚤狀幼體期 Zoea stage；1-115 d： 出膜后第1～115天The first-115 days after hatching.

3 討 論

在本研究中，我們獲得了PcDsxcDNA的全長序列，該基因具有Dmrt基因家族的特征，與同源性較高的南美白對蝦Dmrt1-like、中國明對蝦PchDsx、東方刺龍蝦SvDsx的 DM結構域相同，都只含有1個鋅結合位點(CCHC)，而同源性較遠的果蠅和豐年蟲的Dsx以及甲殼類和哺乳類Dmrt的DM結構域則含有2個鋅結合位點(CCHC和HCCC)。在PcDsx中發(fā)現(xiàn)了2個降解信號，降解信號會影響mRNA的穩(wěn)定性，不知該基因的mRNA的穩(wěn)定性在雌雄克氏原螯蝦間是否有差異，進而影響其在不同性別的克氏原螯蝦中的功能。

在東方刺龍蝦中，對性發(fā)育相關基因SvTKIR和SvDmrt1的研究發(fā)現(xiàn)，這2個基因在雌雄未成年蝦的觸角腺中表達水平均較高，而在成年蝦的觸角腺中的表達則表現(xiàn)出性別二態(tài)性，雌性中的表達水平顯著高于雄性[9]。在本研究中，PcDsx在成年雌性克氏原螯蝦的觸角腺組織中表達水平最高，且表達水平顯著高于雄性，筆者所在研究小組在對克氏原螯蝦PcSxl的研究中發(fā)現(xiàn)，該基因在成年雄蝦觸角腺組織中表達最高，而在雌性中的表達遠低于雄性(數(shù)據(jù)待發(fā)表)。目前，尚無法解釋這些基因在觸角腺中的性別二態(tài)性表達現(xiàn)象。觸角腺在蝦蟹類中的作用類似于哺乳動物的腎臟，用于調(diào)節(jié)滲透壓和離子平衡以及代謝廢棄物如尿液的排泄。有證據(jù)表明尿液中混有獨特的物質(zhì)，可以傳達社會地位、交配、聚合退敵、協(xié)調(diào)公共生活及其他社會行為的化學信號[10-12]，如若觸角腺參與這些信號或者交配信號的調(diào)節(jié)過程，那么這些基因在觸角腺中表現(xiàn)出性別二態(tài)性表達也有據(jù)可依[9]，但目前未見相關報道，尚需進一步深入研究。

在甲殼動物中，有的與昆蟲性別決定通路上的基因的同源基因，其表達水平對性別具有偏好性，例如，Sxl多具有偏雄性表達的特點，日本沼蝦(M.nipponense)[13]和中華絨蟹(Eriocheirsinensis)[14]如此，南美白對蝦中的Sxl-1、Sxl-3、Sxl-5和Sxl-6[15]亦是如此。日本沼蝦中Fem-1和Fem-1b[16-17]的表達對性別也具有偏好性。甲殼動物性別調(diào)控機制具有復雜多樣性，性別偏好性表達現(xiàn)象在不同物種中可能不盡相同，如淡水枝角水溞(D.pulex)中的Tra基因[18]和中國明對蝦中的Tra-2基因[19]的表達存在性別二態(tài)性，而大型溞中的Tra[20]和斑節(jié)對蝦(P.monodon)中的Tra-2[21]在雌雄間表達則并無明顯差異；本研究中PcDsx在雌性克氏原螯蝦的卵巢組織中的表達水平高于雄性精巢，而同源性較高的中國明對蝦Dsx以及長牡蠣Dsx則在雄性性腺中高表達[22-23]。

IAG是目前唯一被證實參與雄性甲殼動物性別分化的關鍵因子[24-25]，其可能與Dsx間存在直接或間接的調(diào)節(jié)關系。在羅氏沼蝦中，Dmrt11E基因的沉默會引起IAG轉錄水平下調(diào)[5]，同樣的，在中國明對蝦中，dsRNA干擾Dsx基因的表達后，也會使IAG基因表達水平下降，并且在IAG啟動子區(qū)域上預測出了Dsx結合位點，推測Dsx基因可能是IAG基因上游調(diào)節(jié)基因[22]。根據(jù)PcDsx和PcIAG在克氏原螯蝦早期發(fā)育時期的表達情況分析，推測PcIAG基因在直接或間接接收到PcDsx的調(diào)節(jié)信號后做出相應的反應，在出膜后1～3 d 表達水平達到最高，進而調(diào)控克氏原螯蝦的雄性第二性征，在出膜后23 d長出雄性特化的第一游泳足，至于克氏原螯蝦性別形成的時間我們無法判斷，還有待于深入研究。