董靖，張露珊，劉紹春，張國(guó)棟，周順，楊秋紅，艾曉輝

1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所/湖北省水產(chǎn)品質(zhì)量安全工程技術(shù)研究中心，武漢 430223；2.岳陽(yáng)漁美康生物科技有限公司，岳陽(yáng) 414100

克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)俗稱小龍蝦，原產(chǎn)于墨西哥東北部和中美洲南部地區(qū)，1929年經(jīng)日本引進(jìn)到中國(guó)，因其可以為人類提供豐富的優(yōu)質(zhì)蛋白、維生素B和礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分而成為風(fēng)靡多個(gè)國(guó)家和地區(qū)的食品[1-2]。近年來(lái)隨著國(guó)內(nèi)小龍蝦養(yǎng)殖規(guī)模的逐漸擴(kuò)大，養(yǎng)殖的集約化程度也有所提升，但由于基礎(chǔ)薄弱、優(yōu)質(zhì)種苗供應(yīng)不足、病害多發(fā)和藥物濫用等問(wèn)題嚴(yán)重阻礙小龍蝦產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。尤其小龍蝦養(yǎng)殖進(jìn)入5月份后往往會(huì)大面積暴發(fā)疾病，造成小龍蝦大量死亡，通常稱為“五月瘟”[3]。其中，由強(qiáng)致病性的細(xì)菌、真菌、病毒和寄生蟲(chóng)等病原體導(dǎo)致的小龍蝦各種感染性疾病尤為嚴(yán)重[4]?；瘜W(xué)類抗菌藥物是日常生產(chǎn)中用于防治小龍蝦病害的主要手段，但極易導(dǎo)致環(huán)境中抗菌藥物的污染和細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生。此外，大量化學(xué)抗菌藥物的使用容易造成藥物在小龍蝦體內(nèi)的蓄積和殘留，影響小龍蝦產(chǎn)品的質(zhì)量安全[5-6]。

肺炎克雷伯菌隸屬于腸桿菌科克雷伯菌屬，是一種常見(jiàn)的條件性致病菌，也是一種重要的人獸魚(yú)共患病原菌，能導(dǎo)致魚(yú)類、陸生動(dòng)物和人的多種感染性疾病[7]。自1992年首次在海、淡水魚(yú)水產(chǎn)品中檢測(cè)到肺炎克雷伯菌后，肺炎克雷伯菌被發(fā)現(xiàn)能導(dǎo)致多種水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的感染，如大鯢(Andriasdavidianus)、團(tuán)頭魴(Megalobramaamblycephala)、中華鱉(Trionyxsinensis)等[8-10]。疫苗和化學(xué)抗菌藥物是治療肺炎克雷伯菌感染的主要手段，但目前尚無(wú)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖源肺炎克雷伯菌感染的疫苗面世。因此，對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖源肺炎克雷伯菌感染的治療主要依賴化學(xué)抗菌藥物[7,11]。而抗菌藥物的廣泛應(yīng)用和濫用也不可避免地導(dǎo)致了肺炎克雷伯菌耐藥菌株的產(chǎn)生。

2019年5月湖北省潛江市一小龍蝦養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)生了小龍蝦“五月瘟”，導(dǎo)致了大量的小龍蝦死亡。筆者通過(guò)對(duì)患病小龍蝦的病原學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)其存在肺炎克雷伯菌感染的情況，進(jìn)一步通過(guò)回歸感染試驗(yàn)確定了該分離菌株對(duì)小龍蝦的致病力。此外，通過(guò)藥敏試驗(yàn)和最小抑菌濃度測(cè)定等方法研究了該分離菌株的敏感性，旨在為小龍蝦“五月瘟”病原分析和疾病防控提供參考和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

患病小龍蝦樣品采集自湖北省潛江市某小龍蝦養(yǎng)殖場(chǎng)；用于回歸感染試驗(yàn)的健康小龍蝦來(lái)自長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所荊州基地；抗生素標(biāo)準(zhǔn)品頭孢拉定、氨曲南、氨芐西林、亞胺培南、頭孢唑林、頭孢吡肟、頭孢噻肟、多粘菌素E、美羅培南、環(huán)丙沙星、阿莫西林、頭孢他啶、氟苯尼考、四環(huán)素、苯唑西林、恩諾沙星、多西環(huán)素購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；頭孢唑肟、慶大霉素、阿奇霉素購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；藥敏紙片購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司；細(xì)菌基因組提取試劑盒、PCR Master Mix等分子生物學(xué)試劑購(gòu)自TaKaRa公司；腦心浸液(BHI)培養(yǎng)基購(gòu)自青島海博生物有限公司。

1.2 細(xì)菌分離和純化

取瀕死小龍蝦在無(wú)菌條件下用生理鹽水反復(fù)沖洗體表3～5次，在超凈工作臺(tái)中剖取小龍蝦的肝胰腺，用生理鹽水沖洗后采用勻漿器將其研磨均勻。取研磨液在腦心浸液(BHI)固體培養(yǎng)基上劃線，將平板置于30 ℃培養(yǎng)16～20 h。從平板中挑取單菌落反復(fù)劃線純化2～3次，將得到的純化菌株置于4 ℃保存，標(biāo)記為L(zhǎng)20190516。

1.3 回歸感染試驗(yàn)

從純化好的平板無(wú)菌挑取L20190516菌株的單菌落接種至BHI液體培養(yǎng)基中，30 ℃振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期。培養(yǎng)好的菌液用麥?zhǔn)媳葷峁芟♂尦?.5×108、1.5×107、1.5×106、1.5×105、1.5×104cfu/mL的菌懸液。選取活力較好、無(wú)明顯外傷的小龍蝦作為試驗(yàn)動(dòng)物，每組30尾，通過(guò)腹腔注射的方式在第2腹節(jié)和第3腹節(jié)之間注射菌液0.1 mL，陰性對(duì)照組注射0.1 mL無(wú)菌生理鹽水。將注射后的蝦暫養(yǎng)于玻璃缸內(nèi)，保持水溫23～25 ℃，溶氧在5.5～7.5 mg/L，期間正常換水但不投喂飼料。感染后每天觀察并記錄不同組別小龍蝦的活動(dòng)情況和死亡數(shù)，連續(xù)觀察10 d。通過(guò)Bliss法計(jì)算其半數(shù)致死濃度 (LC50)[12]。取感染后瀕死的小龍蝦肝胰腺進(jìn)行病原的分離和鑒定。

1.4 細(xì)菌生理生化鑒定

從純化的平板上挑取L20190516菌株的單菌落進(jìn)行革蘭氏染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)菌的形態(tài)特征。此外，將受試菌株的單菌落用無(wú)菌生理鹽水重懸后加入到API20E生化鑒定試劑條上，按產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)操作，在28 ℃條件下培養(yǎng)24 h后將鑒定試劑條置于ATB 32GN細(xì)菌鑒定系統(tǒng)中進(jìn)行生化鑒定。

1.5 細(xì)菌分子鑒定

參照細(xì)菌基因組提取試劑盒操作說(shuō)明書(shū)提取菌株L20190516的全基因，以提取的全基因組作為模板，采用16S rRNA通用引物進(jìn)行擴(kuò)增[13]。用于鑒定的通用引物核苷酸序列：上游引物(16S rRNA-F)：5′-AGAGTTTGATCATGGCTC-3′，下游引物(16S rRNA-R)：5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′， PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度約為1 500 bp。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)并測(cè)序。采用Blast軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行同源性比對(duì)。從Blast結(jié)果中選取與菌株L20190516同源性較高的相關(guān)已知序列，采用MEGA5.1軟件進(jìn)行多重序列比對(duì)分析，采用鄰接法(Neighbor-Joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，校正模型為Kimura 2-parameter，通過(guò)Bootstraps法自舉數(shù)集1 000次。

1.6 藥物敏感性測(cè)試

L20190516菌株對(duì)常用抗菌藥物的敏感性通過(guò)紙片擴(kuò)散法(K-B)進(jìn)行測(cè)定[14-15]。在超凈工作臺(tái)中無(wú)菌挑取L20190516單菌落至BHI液體培養(yǎng)基中，在30 ℃搖床中振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期。培養(yǎng)好的菌液通過(guò)離心收集菌體并用無(wú)菌PBS重懸，通過(guò)麥?zhǔn)媳葷峁軐⒕簼舛日{(diào)整至1.5×108cfu/mL。將菌液充分混勻后涂布至MH瓊脂培養(yǎng)基上，在30 ℃生化培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)18～24 h后用游標(biāo)卡尺測(cè)定不同抗菌藥物的抑菌圈直徑。敏感性結(jié)果判定參照杭州微生物試劑有限公司提供的判定標(biāo)準(zhǔn)。

1.7 最小抑菌濃度測(cè)定

采用CLSI推薦的肉湯微量稀釋法測(cè)定不同抗菌藥物的最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentrations,MICs)。在96孔板中將配好的抗菌藥物進(jìn)行倍比稀釋，每孔內(nèi)藥物體積為100 μL，然后加入100 μL稀釋好的菌懸液，使每孔中菌懸液的濃度為5×105cfu/mL。每種藥物設(shè)置3次重復(fù)，不加藥不加菌的孔設(shè)置為陰性對(duì)照，不加藥加菌的孔設(shè)置為陽(yáng)性對(duì)照。將加好的培養(yǎng)板放置于生化培養(yǎng)箱中，30 ℃條件下培養(yǎng)18～24 h。MICs定義為沒(méi)有細(xì)菌生長(zhǎng)的最小濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離株的培養(yǎng)特性

發(fā)病小龍蝦活力降低，應(yīng)激能力差，采食量下降，進(jìn)地籠后死亡的現(xiàn)象較多，其中大蝦死亡情況較為嚴(yán)重。剖檢發(fā)現(xiàn)其肝胰腺發(fā)白，腸道內(nèi)容物較少，肝胰腺積水。采取患病蝦的肝胰腺進(jìn)行細(xì)菌分離，得到的優(yōu)勢(shì)菌在平板上形成半透明、顏色灰白、中央隆起的光滑菌落。經(jīng)革蘭氏染色鏡檢發(fā)現(xiàn)該菌為短桿狀革蘭氏陰性菌。

2.2 分離株對(duì)小龍蝦的毒力

健康小龍蝦注射不同劑量的L20190516菌懸液后出現(xiàn)了一定程度的發(fā)病和死亡，高濃度攻毒組出現(xiàn)了急性死亡現(xiàn)象，在3 d內(nèi)全部死亡，而陰性對(duì)照組在試驗(yàn)期間沒(méi)有明顯的發(fā)病和死亡(表1)。感染后的小龍蝦表現(xiàn)為活動(dòng)減緩、無(wú)力等癥狀，剖檢發(fā)現(xiàn)其肝胰腺發(fā)白，有部分出現(xiàn)積水現(xiàn)象。采用Bliss法得到了該菌株對(duì)小龍蝦的LC50為2.13×105cfu/mL。對(duì)出現(xiàn)典型癥狀及瀕死小龍蝦進(jìn)行剖檢、細(xì)菌分離得到了與L20190516菌株性狀一致的菌落。

表1 分離株感染健康小龍蝦后的死亡率 Table 1 Mortality of the isolate on healthy crayfish

2.3 生化鑒定結(jié)果

對(duì)分離純化的優(yōu)勢(shì)菌接種于API20E生化鑒定條，經(jīng)過(guò)孵育后置于ATB細(xì)菌自動(dòng)鑒定系統(tǒng)中鑒定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)該優(yōu)勢(shì)菌的生化特征符合肺炎克雷伯菌的特征，相似度大于98%。生化鑒定結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 分離株的生化鑒定結(jié)果 Table 2 Biochemical characterization of the isolate

2.4 16S rRNA序列分析

通過(guò)PCR擴(kuò)增得到了分離株L20190516的16S rRNA片段，長(zhǎng)度約為1 500 bp，PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后直接測(cè)序。將得到的序列(MT409892)與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的已知基因序列同源性比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，分離株L20190516與肺炎克雷伯菌(KX237750.1、KU937377.1)、大腸桿菌(LR025099.1)、產(chǎn)氣克雷伯菌(LR134254.1)聚為一支(圖1)，同源性為99%。結(jié)合該菌株的生理生化特征和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)情況將該菌株判定為肺炎克雷伯菌。

2.5 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

通過(guò)K-B法測(cè)定20種化學(xué)抗菌藥物的敏感性，其結(jié)果見(jiàn)表3。該菌株對(duì)頭孢噻肟、多粘菌素B敏感，對(duì)新霉素、亞胺培南中度敏感，對(duì)恩諾沙星、多西環(huán)素、氟苯尼考等16種藥物耐藥。通過(guò)肉湯微量稀釋法測(cè)定20種藥物的最小抑菌濃度，結(jié)果如表4所示。

圖1 L20190516菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

表3 L20190516分離株對(duì)20種抗菌藥物敏感性 Table 3 Antibiotic susceptibility of L20190516strain to 20 kinds of antibiotics

表4 抗菌藥物對(duì)L20190516分離株的MICs Table 4 The MICs of antibiotics to L20190516

3 討 論

近年來(lái)，隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的迅猛發(fā)展，有關(guān)水產(chǎn)養(yǎng)殖來(lái)源的致病菌的報(bào)道越來(lái)越多，病害頻發(fā)對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展造成了一定的影響。隨著小龍蝦消費(fèi)市場(chǎng)的打開(kāi)，人們養(yǎng)殖小龍蝦的熱情高漲，養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大，隨著養(yǎng)殖規(guī)模和面積的不斷增加，小龍蝦病害也越來(lái)越多，給小龍蝦養(yǎng)殖造成了慘重的損失[16]。小龍蝦的細(xì)菌性病害主要由檸檬酸桿菌屬、氣單胞菌屬、假單胞菌屬、弧菌屬等引起[16-19]。本試驗(yàn)首次從湖北潛江發(fā)病小龍蝦中分離到1株優(yōu)勢(shì)菌，經(jīng)過(guò)回歸感染試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該菌株對(duì)健康小龍蝦致病，在感染小龍蝦體內(nèi)再次分離到該菌株，而陰性對(duì)照組未分離到；進(jìn)一步通過(guò)生理生化鑒定、16S rRNA鑒定和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建將該菌株鑒定為肺炎克雷伯菌。此外，本試驗(yàn)通過(guò)ELISA法(酶免生物)和鏡檢法分別排除了患病小龍蝦感染白斑綜合征病毒和寄生蟲(chóng)的可能?；貧w感染試驗(yàn)前將小龍蝦暫養(yǎng)10 d后再選取健康個(gè)體入組，試驗(yàn)時(shí)設(shè)置了注射無(wú)菌生理鹽水的陰性對(duì)照組且在試驗(yàn)過(guò)程中陰性對(duì)照組未發(fā)生死亡，表明各試驗(yàn)組小龍蝦的死亡均由感染肺炎克雷伯菌引起，而非未檢測(cè)到的未知病原體。

譚愛(ài)萍等[11]、盧玉婷等[20]、滕濤等[9]分別從鰻鱺、鯉、團(tuán)頭魴體內(nèi)分離到肺炎克雷伯菌，發(fā)現(xiàn)該菌主要引起養(yǎng)殖魚(yú)類的腹水、內(nèi)臟器官充血腫脹等癥狀，認(rèn)為肝臟(肝胰腺)可能是肺炎克雷伯菌主要侵害的靶器官。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)肺炎克雷伯菌能導(dǎo)致小龍蝦肝胰腺發(fā)白、采食量下降和腸道內(nèi)容物減少等主要癥狀，該菌感染主要發(fā)生于5月中旬水溫在25 ℃左右時(shí)。綜合以上信息可以推斷肺炎克雷伯菌是小龍蝦“五月瘟”的病原體之一。

自2001年首次發(fā)現(xiàn)了對(duì)碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的肺炎克雷伯菌后，產(chǎn)KPC酶及耐碳青霉烯類抗菌藥物的肺炎克雷伯菌不斷被發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致臨床中對(duì)肺炎克雷伯菌的治療越來(lái)越難[21]。滕濤等[9]研究了團(tuán)頭魴源肺炎克雷伯菌對(duì)27種抗菌藥物的敏感性，發(fā)現(xiàn)僅對(duì)磷霉素、復(fù)方新諾明和氨曲南3種藥物敏感。譚愛(ài)萍等[11]發(fā)現(xiàn)鰻源肺炎克雷伯菌僅對(duì)亞胺培南、鏈霉素和阿米卡星3種藥物敏感，對(duì)其余17種受試藥物均耐藥。童桂香等[22]分析了山瑞鱉(Paleasteindachneri)肺炎克雷伯菌的耐藥性，發(fā)現(xiàn)該菌對(duì)受試的30種藥物中的頭孢西叮、舒普深(頭孢哌酮、舒巴坦)和阿米卡星敏感，對(duì)特治星(哌拉西林、他唑巴坦)中度敏感，對(duì)其余26種藥物耐藥。從以上研究可以推斷出水產(chǎn)源肺炎克雷伯菌耐藥性較為嚴(yán)重，且大部分分離菌株具有多重耐藥性。本試驗(yàn)所分離的肺炎克雷伯菌僅對(duì)受試的20種抗菌藥物中的頭孢噻肟和多粘菌素B敏感，該結(jié)果提示本次分離的菌株為多重耐藥肺炎克雷伯菌。