董靖，劉永濤，胥寧，劉紹春，楊秋紅，楊移斌，周順，艾曉輝

1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所/湖北省水產(chǎn)品質(zhì)量安全工程技術(shù)研究中心，武漢 430223；2.岳陽(yáng)漁美康生物科技有限公司，岳陽(yáng) 414100

克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)俗稱小龍蝦，原產(chǎn)于北美洲，1929年自日本傳入中國(guó)，現(xiàn)已成為我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖的重要養(yǎng)殖品種之一。近年來(lái)，伴隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大和養(yǎng)殖密度的增加，克氏原螯蝦產(chǎn)業(yè)發(fā)展也遇到了問(wèn)題和挑戰(zhàn)，如野生資源下降導(dǎo)致的種質(zhì)退化、養(yǎng)殖模式標(biāo)準(zhǔn)化程度低、病害頻發(fā)等問(wèn)題[1]?？耸显r傳染性疾病具有暴發(fā)特征，通常會(huì)導(dǎo)致大量死亡甚至絕產(chǎn)，成為克氏原螯蝦健康養(yǎng)殖的主要威脅[2]。

摩氏摩根菌(Morganellamorganii)是一種廣泛存在于自然界中的條件性致病菌，能感染動(dòng)物和人，是一種人獸共患病原菌[3-4]。該菌呈短桿狀，革蘭氏染色陰性，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中能導(dǎo)致多動(dòng)水產(chǎn)動(dòng)物如中華鱉(Pelodiscussinensis)、大鯢(Andriasdavidianus)、烏鱧(Channaargus)、胡子鯰(Clarisfuscus)等出現(xiàn)內(nèi)臟充血出血、肌肉充血和皮膚出血潰爛等癥狀，嚴(yán)重者甚至出現(xiàn)大量死亡[5-8]。筆者從患病克氏原螯蝦肝胰腺內(nèi)分離到1株能導(dǎo)致克氏原螯蝦大量死亡的病原菌。筆者對(duì)該分離株進(jìn)行了分離鑒定,并檢測(cè)分析了該菌對(duì)常見(jiàn)抗菌藥物的敏感性以及抗菌藥物與天然化合物的聯(lián)合抑菌作用，旨在為克氏原螯蝦“五月瘟”病原分析和疾病防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

患病克氏原螯蝦從湖北省潛江市某養(yǎng)殖場(chǎng)采集；攻毒用健康蝦由筆者所在實(shí)驗(yàn)室臨床試驗(yàn)基地提供；藥敏紙片購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司；腦心浸液培養(yǎng)基、MH培養(yǎng)基購(gòu)自青島海博生物有限公司；天然化合物購(gòu)自四川維克奇公司；PCR Master Mix、細(xì)菌基因組提取試劑盒等分子生物學(xué)試劑購(gòu)自南京諾唯贊公司。

1.2 細(xì)菌分離和純化

取患病克氏原螯蝦，在無(wú)菌工作臺(tái)中用無(wú)菌生理鹽水沖洗體表3～5次后剖取其肝胰腺。肝胰腺經(jīng)無(wú)菌生理鹽水沖洗后在勻漿器中勻漿，取勻漿液在腦心浸液(BHI)固體培養(yǎng)基上劃線，28 ℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)16～20 h。從長(zhǎng)好細(xì)菌的平板挑取單菌落繼續(xù)劃線2～3次對(duì)細(xì)菌進(jìn)行純化，純化好的細(xì)菌標(biāo)記為QJ20190513，并制備甘油菌保存于-80 ℃。

1.3 回歸感染試驗(yàn)

QJ20190513分離株單菌落在BHI液體培養(yǎng)基培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期后采用麥?zhǔn)媳葷岱▽⒕簼舛日{(diào)整至1.5×108、1.5×107、1.5×106、1.5×105和1.5×104cfu/mL 5個(gè)不同的濃度梯度。將180尾試驗(yàn)用健康克氏原螯蝦隨機(jī)分為6組，試驗(yàn)組分別在第2腹節(jié)和第3腹節(jié)處注射制備好的菌懸液100 μL，注射無(wú)菌生理鹽水的健康蝦作為陰性對(duì)照組。感染后的蝦暫養(yǎng)于玻璃缸內(nèi)，水溫保持23～25 ℃，溶解氧5.5～5.7 mg/mL。感染后觀察8 d，記錄各組臨床癥狀和死亡數(shù)。將瀕死蝦的肝胰腺參照本文“1.2”方法進(jìn)行病原分離，并進(jìn)行鑒定。試驗(yàn)結(jié)束后采用Bliss法計(jì)算該菌株對(duì)健康克氏原螯蝦的半致死濃度(LC50)[9]。

1.4 生理生化鑒定

首先取單菌落進(jìn)行革蘭氏染色后鏡檢，觀察分離株的形態(tài)特征。此外，采用API20E生化鑒定試劑條進(jìn)行生化鑒定。參照試劑條說(shuō)明書(shū)，從平板上挑取菌落用無(wú)菌生理鹽水稀釋至合適濃度后加入試劑條各個(gè)孔中，在28 ℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h后判定結(jié)果。

1.5 細(xì)菌分子鑒定

參照試劑盒說(shuō)明書(shū)提取QJ20190513分離株的全基因組，以其為模板通過(guò)PCR的方法擴(kuò)增分離株16S rRNA片段，PCR上游引物(16S rRNA-F)：5′-AGAGTTTGATCATGGCTC-3′，下游引物(16S rRNA-R)：5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′。擴(kuò)增后得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后取目的條帶進(jìn)行凝膠回收并測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果用Blast軟件分析同源性并采用MEGA5.1軟件以鄰接法構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，校正模型為Kimura 2-parameter，通過(guò)Bootstraps法自舉數(shù)集1 000次。

1.6 藥敏試驗(yàn)

從BHI平板上挑取QJ20190513分離株的單菌落至BHI液體培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期，離心收集菌體。菌體經(jīng)無(wú)菌生理鹽水洗滌3次后采用麥?zhǔn)媳葷岱▽⒕簼舛日{(diào)整為1.5×108cfu/mL。用無(wú)菌玻璃棒將菌液均勻涂布于MH瓊脂培養(yǎng)基上，然后將藥敏紙片貼于平板上，28 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)16～18 h后測(cè)定抑菌圈直徑，判定該菌對(duì)不同藥物的敏感性。

1.7 聯(lián)合抑菌試驗(yàn)

采用棋盤(pán)法研究多西環(huán)素和10種不同天然化合物聯(lián)合后對(duì)QJ20190513分離株的聯(lián)合抑菌作用[10]。將藥物分別用MH肉湯在離心管中倍比稀釋，分別取50 μL恩諾沙星和天然化合物加入到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，使多西環(huán)素濃度從第2孔到第10孔(從左到右)依次降低，天然化合物濃度從B到H孔(從上到下)依次降低。培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期的菌液經(jīng)離心和無(wú)菌生理鹽水反復(fù)沖洗后，采用麥?zhǔn)媳葷岱ㄕ{(diào)整至濃度為5×106cfu/mL，取100 μL稀釋好的菌液加入到96孔板中，混合均勻后置于28 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)16～18 h，分別設(shè)置陰性和陽(yáng)性對(duì)照。記錄多西環(huán)素與天然化合物單獨(dú)使用的最小抑菌濃度(MIC)和聯(lián)合使用以后各自的MIC。聯(lián)合抑菌作用采用抑菌濃度指數(shù)FICI評(píng)價(jià)，計(jì)算公式如下：ICI=MICA藥聯(lián)合/MICA藥單獨(dú)+MICB藥聯(lián)合/MICB藥單獨(dú)。協(xié)同作用 (synergism,SYN；FICI≤0.5)；無(wú)關(guān)作用 (indifference,IND；0.54)。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離株的培養(yǎng)特性

從患病克氏原螯蝦肝胰腺純化的優(yōu)勢(shì)菌在BHI固體培養(yǎng)基上形成白色半透明的光滑菌落，革蘭氏染色后經(jīng)顯微鏡鏡檢發(fā)現(xiàn)該菌株為革蘭氏陰性短桿狀細(xì)菌。

2.2 分離株對(duì)克氏原螯蝦的毒力

將QJ20190513分離株以注射方式感染健康的克氏原螯蝦，發(fā)現(xiàn)感染后的克氏原螯蝦出現(xiàn)了活力下降等癥狀，且感染蝦出現(xiàn)了不同程度的死亡，死亡率與感染劑量呈正相關(guān)，在感染試驗(yàn)過(guò)程中陰性對(duì)照組未出現(xiàn)發(fā)病和死亡情況(表1)。進(jìn)一步剖檢發(fā)現(xiàn)，感染后的克氏原螯蝦肝胰腺發(fā)白甚至水腫，肌肉發(fā)白。此外，從癥狀明顯的感染蝦肝胰腺中分離到了1株優(yōu)勢(shì)菌，其培養(yǎng)特性與分離株QJ20190513基本一致。經(jīng)Bliss法計(jì)算得到該菌株對(duì)克氏原螯蝦的半數(shù)致死濃度LC50為2.8×105cfu/mL。

表1 QJ20190513菌株感染健康克氏原螯蝦后的死亡率 Table 1 Mortality of the QJ20190513 isolate on healthy crayfish

2.3 生化鑒定結(jié)果

采用API20E細(xì)菌鑒定試紙條和ATB細(xì)菌鑒定系統(tǒng)分析了分離株QJ20190513的生化特征，結(jié)果如表2所示。經(jīng)ATB系統(tǒng)判定該菌株的生化特征與系統(tǒng)中摩氏摩根菌的特征相符合，其相似度為99.9%。

表2 分離株QJ20190513的生化特征 Table 2 Biochemical characterization of the QJ20190513 isolate

2.4 分子生物學(xué)鑒定

通過(guò)PCR方法得到了分離株QJ20190513的16S rRNA片段，其長(zhǎng)度約為1.5 kb。將測(cè)序結(jié)果提交至Blast軟件與GenBank中已知序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，該菌株與摩氏摩根菌的同源性大于99%。通過(guò)MEGA軟件構(gòu)建發(fā)育樹(shù)(圖1)發(fā)現(xiàn)，分離株QJ20190513(MT890001)與摩氏摩根菌(AY464464.1)親緣關(guān)系較近，結(jié)合該菌株的生理生化特征將QJ20190513菌株鑒定為摩氏摩根菌。

圖1 QJ20190513菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.5 藥物敏感性

采用K-B法檢測(cè)了QJ20190513分離株對(duì)20種化學(xué)藥物的敏感性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，分離株對(duì)妥布霉素、新霉素、亞胺培南等7種藥物敏感，對(duì)卡那霉素中度敏感，對(duì)慶大霉素、鏈霉素、頭孢唑啉等12種藥物耐藥(表3)。

2.6 協(xié)同抑菌試驗(yàn)

從表3可見(jiàn)，QJ20190513菌株對(duì)多西環(huán)素不敏感，多西環(huán)素對(duì)QJ20190513菌株的最小抑菌濃度為64 μg/mL(表4)。受試天然化合物血根堿、和厚樸酚、二氫辣椒堿和異土木香內(nèi)酯對(duì)菌株 QJ20190513的生長(zhǎng)均有一定的抑制作用，其MIC分別為16、64、32和64 μg/mL (表4)。而當(dāng)多西環(huán)素與天然化合物聯(lián)合使用后僅二氫辣椒堿與多西環(huán)素具有協(xié)同抑制QJ20190513菌株的作用，其FICI為0.19，聯(lián)合使用后多西環(huán)素MIC下降了16倍，二氫辣椒堿MIC下降了8倍。

表3 QJ20190513分離株對(duì)20種抗菌藥物敏感性 Table 3 Antibiotic susceptibility of QJ20190513 strain to 20 kinds of antibiotics

表4 天然化合物與多西環(huán)素(單獨(dú)或聯(lián)合)對(duì)QJ20190513菌株的最小抑菌濃度 Table 4 The MIC values of natural products and doxycycline (alone or combination) against QJ20190513 strain

3 討 論

克氏原螯蝦對(duì)環(huán)境適應(yīng)能力較強(qiáng)，可在低氧、多種水溫和水質(zhì)環(huán)境差的地方生存，是近年來(lái)具有較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的養(yǎng)殖品種之一[11]。然而近年來(lái)由于克氏原螯蝦養(yǎng)殖面積和養(yǎng)殖密度的不斷增加，導(dǎo)致克氏原螯蝦的感染性疾病的報(bào)道也越來(lái)越多，如白斑綜合征病毒、弗氏檸檬酸桿菌、維氏氣單胞菌、副溶血弧菌和螺旋體等[11-14]。本試驗(yàn)首次發(fā)現(xiàn)摩氏摩根菌能夠?qū)е驴耸显r發(fā)病和大規(guī)模死亡，通過(guò)回歸試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該菌株對(duì)健康克氏原螯蝦具有較強(qiáng)的致病力，在感染后導(dǎo)致大量感染蝦的快速死亡。此外，人工感染的克氏原螯蝦表現(xiàn)出與天然發(fā)病蝦類似的癥狀，如活動(dòng)力下降、應(yīng)激能力差、肝胰腺發(fā)白、肌肉彈性下降和顏色變淺等?？耸显r與其他甲殼類動(dòng)物類似，缺乏脊椎動(dòng)物的獲得性免疫力，其抵御病原體主要依靠先天免疫系統(tǒng)[15]。因此，研究病原體對(duì)克氏原螯蝦的致病規(guī)律對(duì)于減少發(fā)病具有重要意義。

摩氏摩根菌是人類腸道中的正常菌群之一，通常不會(huì)導(dǎo)致人類疾病，但在特殊條件下能導(dǎo)致免疫力低下的人發(fā)生感染，在人類醫(yī)學(xué)上是一種少見(jiàn)的條件性致病菌[16]。摩氏摩根菌能導(dǎo)致多種不同動(dòng)物發(fā)病，包括陸生動(dòng)物和多種水生動(dòng)物。陸小萏等[17]從患病的錦鯉(CyprinuscarpioLinnae)中分離到1株摩氏摩根菌，經(jīng)人工感染發(fā)現(xiàn)其對(duì)健康錦鯉具有較強(qiáng)的致病力，該研究首次發(fā)現(xiàn)摩氏摩根菌能夠感染魚(yú)類。近年來(lái)，水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物感染摩氏摩根菌的報(bào)道越來(lái)越多，烏鱧、中華鱉、胡子鯰、鱸(Lateolabraxjaponicas)、大鯢等均能在天然條件下感染摩氏摩根菌并引起發(fā)病和死亡[6-8,18]。盡管目前尚無(wú)摩氏摩根菌通過(guò)水產(chǎn)動(dòng)物感染人的報(bào)道，但水產(chǎn)食品作為人類的主要蛋白質(zhì)來(lái)源之一，極易通過(guò)水產(chǎn)品加工、未煮熟的水產(chǎn)食品或發(fā)生污染的水域?qū)⒉≡鷶U(kuò)散到人類，從而導(dǎo)致嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題。因此，加強(qiáng)對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物摩氏摩根菌感染的防控不僅有利于降低水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)因感染造成的損失，對(duì)于保障水產(chǎn)動(dòng)物性食品安全和人類健康也具有重要意義。但目前尚未闡明摩氏摩根菌導(dǎo)致水產(chǎn)動(dòng)物感染的機(jī)制，因此迫切需要深入研究以控制摩氏摩根菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域的感染。

化學(xué)抗菌藥物是目前防治水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物細(xì)菌性疾病的主要手段，但藥物的長(zhǎng)期不合理使用導(dǎo)致了病原菌耐藥性的產(chǎn)生，給細(xì)菌性病害防控帶來(lái)了困難。研究發(fā)現(xiàn)，不同來(lái)源的摩氏摩根菌對(duì)抗菌藥物有不同程度的耐藥，如氨基糖苷類、酰胺醇類、β-內(nèi)酰胺類等[19]。本試驗(yàn)分離的摩氏摩根菌對(duì)受試的7種藥物高度敏感，1種藥物中等敏感，12種藥物耐藥；與以往的研究有一定差異，分析其原因可能與各地區(qū)不同養(yǎng)殖品種的用藥習(xí)慣及菌株來(lái)源有關(guān)。QJ20190513菌株對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖用獸藥新霉素、恩諾沙星和氟苯尼考高度敏感，但對(duì)多西環(huán)素耐藥，因此選取了多西環(huán)素篩選能與其有協(xié)同抑菌的天然化合物。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，受試天然化合物如血根堿等單獨(dú)使用時(shí)即表現(xiàn)出一定程度的抑菌作用，但僅多西環(huán)素與二氫辣椒堿聯(lián)用后其FICI<0.5，具有協(xié)同抑菌作用。協(xié)同抑菌作用能提高藥物的敏感性，延長(zhǎng)藥物的使用壽命，對(duì)于耐藥性摩氏摩根菌的防控具有重要意義。