鄭傳癡，周旭美，高健美*

1遵義醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥劑科；2遵義醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，遵義 563000

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種常見于老年期的以進(jìn)行性認(rèn)知能力下降和社會功能障礙為臨床表現(xiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。據(jù)報道，預(yù)計到2050年AD患者總數(shù)預(yù)計達(dá)1億3 150萬，不僅嚴(yán)重影響中老年人身體健康和生活質(zhì)量，而且給患者和家庭帶來了沉重的精神負(fù)擔(dān)和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1]。而隨著我國人口老齡化加速，AD在老年人疾病譜中的地位日益突顯。因此，對AD的防治研究是全球關(guān)注的重點(diǎn)。AD的典型病理特征為β-淀粉樣蛋白(amyloidβ-protein，Aβ)沉積形成的老年斑，細(xì)胞內(nèi)Tau蛋白異常磷酸化引起的神經(jīng)纖維纏結(jié)和神經(jīng)元缺失[2]。但是其作用機(jī)制復(fù)雜，目前尚不清楚。其中，Aβ導(dǎo)致的神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷被認(rèn)為是導(dǎo)致AD的重要因素之一[3]。因此，研發(fā)抗Aβ導(dǎo)致的神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷的藥物意義重大。但目前尚無理想的防治AD的藥物。

我國中草藥資源十分豐富，某些記載的具有抗衰老和促智的傳統(tǒng)中藥已被證明可以改善AD動物模型的學(xué)習(xí)和記憶能力[4]。因此，從中草藥及其活性成分等天然產(chǎn)物中尋找有效的防治AD的藥物具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。異槲皮苷是多種中藥(例如多穗石柯、紅景天、桑葉、白花蛇舌草)的黃酮醇苷類活性成分之一，具有抗人肝癌細(xì)胞HepG2增殖作用[5]、抑制脂多糖誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的作用[6]、保護(hù)叔丁基過氧化氫誘導(dǎo)的人肝細(xì)胞氧化損傷的作用[7]。最近研究發(fā)現(xiàn)，異槲皮苷能夠抑制氧化應(yīng)激發(fā)揮對鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性的保護(hù)作用[8]，但是，其對AD細(xì)胞模型是否具有保護(hù)作用尚不清楚。因此，本研究擬通過Aβ25-35損傷PC12細(xì)胞建立體外AD模型，從氧化應(yīng)激的角度探討異槲皮苷的神經(jīng)保護(hù)作用并初步分析其作用機(jī)制，為異槲皮苷臨床用于防治AD提供藥理學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)藥物

異槲皮苷(成都普思生物科技股份有限公司，純度>98%，批號PS000510)。試驗(yàn)藥物用DMSO溶解，-20 ℃凍存，臨用前用DMEM培養(yǎng)液稀釋，采用0.22 μm微孔濾器過濾除菌，備用。

1.2 細(xì)胞

大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞株P(guān)C12來源于American Type Culture Collection (ATCC，Rockville，MD，USA)。接種于含10%胎牛血清，2%谷氨酰胺的DMEM培養(yǎng)液中，在37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 試劑

DMEM培養(yǎng)液(Hyclone公司)；Aβ25-35(Sigma公司)；甲基噻唑藍(lán)(3-(4，5-dimethyl-2-thiazolyl)-2，5-diphenyl tetrazolium bromide，MTT)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)、活性氧(reactive oxygen species，ROS)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)和丙二醛(malonaldehyde，MDA)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate-activated protein kinase，AMPK)、p-AMPK、過氧化物增殖體受體輔激活子-1α(peroxisome proliferator-activated receptor coactivator-1α，PGC-1α)、沉默信息調(diào)節(jié)因子3(sirtuin3，Sirt3)和異檸檬酸脫氫酶(isocitrate dehydrogenase，IDH2)抗體(Abcam公司)。

1.4 主要儀器

FormaTMSteri-CycleTMi250型二氧化碳培養(yǎng)箱(美國Thermo Scientific)；CX31型倒置顯微鏡(日本Olympus)；IX73型熒光顯微鏡(日本Olympus)；電泳儀(美國Bio-Rad)；全自動電泳凝膠成像分析系統(tǒng)(美國Bio-Rad)。

1.5 方法

1.5.1 成分-靶點(diǎn)分子對接

從RSCB 數(shù)據(jù)庫(http://www.rcsb.org/)中下載 AMPK蛋白的晶體結(jié)構(gòu)(PDB ID：2UV5)，使用AutoDockTools1.5.6軟件將晶體結(jié)構(gòu)中的水分子刪除，進(jìn)行加氫處理后保存為pdbqt格式文件。從PubChem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)中下載異槲皮苷化合物2D及3D結(jié)構(gòu)的SDF格式文件。利用Pymol軟件進(jìn)行蛋白小分子結(jié)構(gòu)處理，運(yùn)用AutoDock vina軟件進(jìn)行分子對接。

1.5.2 Aβ25-35對PC12細(xì)胞毒性損傷的濃度選擇

將濃度為1×105個/mL的處于對數(shù)生長期PC12 細(xì)胞接種于96孔板，培養(yǎng)12 h后，分別加入終濃度為5、10、20、40、80 μmol/L Aβ25-35溶液，分別作用培養(yǎng)12、24、48、72 h后，每孔加入 25 μL MTT(5 mg/mL)繼續(xù)作用4 h后，棄上清， 每孔加入150 μL二甲基亞砜，震搖10 min后，于酶標(biāo)儀492 nm波長處檢測吸光度值。

1.5.3 實(shí)驗(yàn)分組及藥物處理

將對數(shù)生長期的PC12細(xì)胞以1×105個/mL細(xì)胞密度接種于96孔板中，培養(yǎng)24 h后，隨機(jī)分為正常對照組、模型組(Aβ25-35)、異槲皮苷給藥組(1、10和100 μmol/L)。不同濃度1、10和100 μmol/L異槲皮苷預(yù)處理1 h后，再加入Aβ25-35繼續(xù)作用48 h。

1.5.4 MTT法檢測異槲皮苷對Aβ25-35損傷PC12細(xì)胞存活率的影響

PC12細(xì)胞按照“1.5.3”項方法經(jīng)藥物處理后，每孔加入25 μL MTT(5 g/L)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄上清，每孔加入150 μL DMSO溶解，振搖10 min后，于酶標(biāo)儀492 nm波長處檢測吸光度值。

1.5.5 LDH釋放率檢測異槲皮苷對Aβ25-35損傷PC12細(xì)胞細(xì)胞毒性的影響

PC12細(xì)胞按照“1.5.3”項方法經(jīng)藥物處理后，以4 000 rpm在4 ℃條件下離心10 min后，取上清，嚴(yán)格按照 LDH 測試盒說明書操作測定LDH釋放率。

1.5.6 形態(tài)學(xué)觀察

PC12細(xì)胞按照“1.5.3”項方法接種于6孔板，經(jīng)藥物處理后，于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化并拍照記錄。

1.5.7 異槲皮苷對ROS、MDA含量、SOD和GSH-Px活力的影響

PC12細(xì)胞按照“1.5.3”項方法經(jīng)藥物作用48 h后，3 000 rpm在4 ℃條件下離心10 min后，取上清，嚴(yán)格按照試劑盒操作測定ROS和MDA含量以及SOD和GSH-Px活力。

1.5.8 Western blot法檢測AMPK、PGC-1α、Sirt3、IDH2蛋白表達(dá)

PC12細(xì)胞按照“1.5.3”項方法經(jīng)藥物處理后，提取PC12細(xì)胞總蛋白后，采用BCA試劑盒測定蛋白濃度，加熱使之變性后，每孔上樣30 μg，經(jīng)12%十二烷基磺酸鈉凝膠電泳后，將蛋白采用半干法轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，封閉2 h后，加入相應(yīng)一抗：p-AMPK(1∶1 000)、AMPK(1∶1 000)、PGC-1α(1∶1 000)、Sirt 3(1∶1 000)、IDH2(1∶1 000)，于4 ℃孵育過夜，TBST洗膜后3次后，以辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗封閉孵育1 h后，采用ECL發(fā)光法經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)曝光顯影，條帶灰度值分析采用Image J軟件。

1.5.9 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果

2.1 異槲皮苷作用于AMPK蛋白的分子對接結(jié)果

通過分子對接技術(shù)分析異槲皮苷與AMPK結(jié)合情況的研究結(jié)果顯示：異槲皮苷與AMPK蛋白的結(jié)合能為﹣9.48 kJ/mol，其結(jié)合能≤﹣5 kJ/mol說明異槲皮苷能夠與AMPK蛋白結(jié)合。其氨基酸結(jié)合位點(diǎn)主要包括：ASN256、LEU249和LYS253(圖1)。以上結(jié)果提示AMPK可能為異槲皮苷對Aβ25-35導(dǎo)致的PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用的潛在靶點(diǎn)。

圖1 異槲皮苷與AMPK對接模式圖Fig.1 The molecular docking pattern diagram of isoquercitrin with AMPK注：A：異槲皮苷與AMPK結(jié)合表面3D可視化圖；B：異槲皮苷與AMPK結(jié)合位點(diǎn)的3D可視化結(jié)果；C：異槲皮苷與AMPK結(jié)合位點(diǎn)的2D模式圖。Note:A:3D visualization bingding surface of isoquercitrin with AMPK;B:3D visualization bingding sites of isoquercitrin with AMPK;C:2D visualization bingding sites of isoquercitrin with AMPK.

2.2 Aβ25-35對PC12細(xì)胞損傷的濃度選擇

通過MTT法檢測Aβ25-35對PC12細(xì)胞的損傷。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與空白對照組比較，5、10、20、40、80 μmol/L Aβ25-35能夠顯著抑制PC12細(xì)胞的活力(P<0.05)。由于20 μmol/L Aβ25-35作用48 h存活率接近50%，因此確定20 μmol/L Aβ25-35作用48 h為最佳作用濃度和時間用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)(圖2)。

圖2 Aβ25-35對PC12細(xì)胞損傷的影響Fig.2 The effect of Aβ25-35 on PC12 cell 注：與正常對照組比較，*P<0.05；** P<0.01。Note:Compared with control,*P<0.05;**P<0.01.

2.3 異槲皮苷對Aβ25-35損傷的PC12細(xì)胞存活率和LDH含量的影響

模型組(Aβ25-35)細(xì)胞活力較空白對照組顯著降低，LDH含量明顯升高(P<0.01)，與模型組比較，異槲皮苷(1、10和100 μmol/L)作用48 h能夠濃度依賴性的增加細(xì)胞存活率，降低LDH含量(P<0.05，P<0.01)(圖3、圖4)。

圖3 異槲皮苷對Aβ25-35損傷的PC12細(xì)胞存活率和LDH含量的影響Fig.3 The effect of isoquercitrin on cell viability of 注：A：正常對照；B：模型；C：異槲皮苷1 μmol/L；D：異槲皮苷10 μmol/L；E：異槲皮苷100 μmol/L。 與正常對照組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01，下同。Note:A:Control;B:Model;C:Isoquercitrin 1 μmol/L;D:Isoquercitrin 10 μmol/L;E:Isoquercitrin 100 μmol/L.Compared with normal group,**P < 0.01;Compared with model group,#P<0.05,##P<0.01,the same below.

圖4 異槲皮苷對Aβ25-35損傷的PC12細(xì)胞LDH含量的影響Fig.4 The effect of isoquercitrin on LDH level of

2.4 異槲皮苷對Aβ25-35損傷的PC12細(xì)胞形態(tài)的影響

模型組(Aβ25-35)細(xì)胞較正常對照組細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)皺縮、變圓且部分漂浮在培養(yǎng)液中；異槲皮苷(1、10和100 μmol/L)作用后較模型組細(xì)胞數(shù)量和形態(tài)均有所改善(圖5)。

圖5 異槲皮苷對Aβ25-35導(dǎo)致?lián)p傷的PC12細(xì)胞形態(tài)的影響(200 ×)Fig.5 The effect of isoquercitrin on cell morphology of Aβ25-35-induced PC12 cell injury (200 ×)

2.5 異槲皮苷對ROS、MDA含量和GSH-Px、SOD活性的影響

結(jié)果顯示，Aβ25-35模型組較正常對照組ROS和MDA含量顯著增加；而異槲皮苷(1、10和100 μmol/L)組較模型組ROS和MDA含量明顯降低(P<0.05，P<0.01)。同時，Aβ25-35模型組較正常對照組SOD和GSH-Px活力顯著降低；異槲皮苷(1、10和100 μmol/L)組較Aβ25-35模型組SOD和GSH-Px的活性明顯增加(P<0.05，P<0.01)(表1)。

表1 異槲皮苷對ROS、MDA含量和GSH-Px、SOD活性的影響

2.6 異槲皮苷對AMPK、PGC-1α、Sirt3、IDH2蛋白表達(dá)的影響

Aβ25-35模型組較正常對照組p-AMPK水平、PGC-1α、Sirt3和IDH2蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.01)；而異槲皮苷較Aβ25-35模型組p-AMPK水平、PGC-1α、Sirt3和IDH2蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.05，P<0.01)(圖6、圖7)。

圖7 異槲皮苷對AMPK、PGC-1α、Sirt3、IDH2蛋白表達(dá)的影響Fig.7 The effect of isoquercitrin on AMPK,PGC-1α,Sirt3 and IDH2 protein

3 討論

最近文獻(xiàn)報道，異槲皮苷能夠減少Aβ誘導(dǎo)的小鼠大腦淀粉樣變性，但是其作用機(jī)制尚不明確[9]。值得注意的是，異槲皮苷能夠通過激活調(diào)節(jié)體內(nèi)能量代謝的重要激酶AMPK發(fā)揮抗脂質(zhì)代謝紊亂的作用。因此，我們推測AMPK可能為異槲皮苷防治AD的作用靶點(diǎn)。分子對接是一種通過模擬配體和受體相互作用來篩選小分子化合物的藥物設(shè)計方法?？赏ㄟ^構(gòu)建關(guān)鍵靶點(diǎn)的分子對接模型，分析小分子化合物與關(guān)鍵靶點(diǎn)的相互作用[10]。因此，本研究首先采用分子對接技術(shù)分析異槲皮苷與AMPK的結(jié)合情況。研究結(jié)果顯示，異槲皮苷能夠與AMPK結(jié)合，提示AMPK可能為異槲皮苷防治AD的作用靶點(diǎn)。

目前，Aβ沉積被認(rèn)為是AD發(fā)病的始動因素和病理改變的重要因素，因此，本研究采用了公認(rèn)的Aβ25-35導(dǎo)致神經(jīng)元損傷模型建立體外AD模型進(jìn)一步觀察異槲皮苷的神經(jīng)保護(hù)作用[11]。本研究結(jié)果顯示，Aβ25-35明顯減低細(xì)胞活力，增加細(xì)胞LDH含量，提示Aβ25-35損傷細(xì)胞嚴(yán)重，與文獻(xiàn)報道一致[12]。而異槲皮苷能夠濃度依賴性的增加Aβ25-35損傷的細(xì)胞活力并降低其LDH含量，表明異槲皮苷具有保護(hù)Aβ25-35導(dǎo)致的細(xì)胞損傷作用，但是其作用機(jī)制有待于進(jìn)一步探索。有研究發(fā)現(xiàn)，Aβ導(dǎo)致的氧化應(yīng)激損傷是導(dǎo)致AD發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素。氧化應(yīng)激損傷是指體內(nèi)的ROS(主要包括羥自由基、過氧化氫、超氧陰離子等)與體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)(主要包括SOD、GSH-Px)失平衡導(dǎo)致的細(xì)胞損傷。本研究結(jié)果顯示，Aβ25-35可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS和脂質(zhì)過氧化物MDA明顯增加，同時降低抗氧化物酶SOD和GSH-Px的活力，表明Aβ25-35可導(dǎo)致神經(jīng)元氧化損傷，與文獻(xiàn)報道一致[13,14]。而異槲皮苷能夠濃度依賴性的減少ROS和MDA含量并提高抗氧化物酶活力，提示異槲皮苷對Aβ25-35導(dǎo)致的細(xì)胞損傷作用與其提高抗氧化物酶活力而清除Aβ25-35產(chǎn)生的過多ROS有關(guān)。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，AMPK/Sirt3信號通路與Aβ導(dǎo)致的氧化應(yīng)激損傷進(jìn)而引發(fā)AD的發(fā)生關(guān)系密切[15]。其中AMPK的活化可減少腦內(nèi)Aβ的沉積[12]。Sirt3是Sirtuin家族在進(jìn)化上高度保守的成員之一，在氧化應(yīng)激導(dǎo)致的AD發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要的作用。值得注意的是，AMPK能夠通過磷酸化激活其下游的PGC-1α進(jìn)而活化Sirt3，Sirt3可進(jìn)一步激活其下游的IDH2發(fā)揮抗氧化應(yīng)激損傷作用[16,17]。本研究結(jié)果顯示，Aβ25-35明顯降低AMPK的磷酸化水平及其下游PGC-1α的表達(dá)，同時下調(diào)Sirt3及其下游IDH2的表達(dá)，表明AMPK/Sirt3信號通路在Aβ導(dǎo)致的AD中發(fā)揮重要作用，與文獻(xiàn)報道一致[18,19]。而異槲皮苷可顯著增加AMPK的磷酸化水平及其下游PGC-1α的表達(dá)，同時上調(diào)Sirt3及其下游IDH2的表達(dá)，表明異槲皮苷通過調(diào)控AMPK磷酸化進(jìn)而激活Sirt3發(fā)揮抗Aβ導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷作用。盡管本研究初步明確了異槲皮苷對Aβ25-35導(dǎo)致的PC12細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用，但是其具體作用機(jī)制仍需深入研究。在進(jìn)一步的研究中將采用AMPK的抑制劑或其他信號通路相關(guān)siRNA干擾手段，驗(yàn)證該信號通路是否參與其中并在體內(nèi)動物模型中進(jìn)一步確定其藥效及其可能的作用靶點(diǎn)。

綜上所述，異槲皮苷能夠抑制Aβ25-35導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞氧化損傷，其作用與激活A(yù)MPK/Sirt3信號通路有關(guān)，但是仍需通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確定其藥效及其作用機(jī)制。