謝麗媛，尹文兵，李 偉,3*，高 偉*

1首都醫(yī)科大學(xué) 中醫(yī)藥學(xué)院，北京 100069；2中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，真菌學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100101；3河南省科學(xué)院生物研究所有限責(zé)任公司，鄭州 450008

白僵菌屬(Beauveria)真菌屬于子囊菌門(mén)(Ascomycotina)糞殼菌綱(Sordariomycetes)肉座菌目(Hypocreales)蟲(chóng)草菌科(Cordycipitaceae)，是一類(lèi)常見(jiàn)的昆蟲(chóng)寄生菌。該屬中的球孢白僵菌(Beauveriabassiana(Bals.)Vuillant)感染或人工接種于蠶蛾科昆蟲(chóng)家蠶(BombyxmoriLinnaeus)4～5齡的幼蟲(chóng)后使其死亡而形成的干燥體稱為僵蠶，是一味傳統(tǒng)中藥，可用于肝風(fēng)夾痰，驚癇抽搐，小兒急驚，破傷風(fēng)，中風(fēng)口，風(fēng)熱頭痛，目赤咽痛，風(fēng)疹瘙癢，發(fā)頤痄腮等。研究發(fā)現(xiàn)，白僵菌次級(jí)代謝產(chǎn)物是僵蠶活性的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，且具有較好的藥理活性和生物活性。研究人員對(duì)該屬真菌中的次級(jí)代謝產(chǎn)物及其生物合成途徑進(jìn)行了廣泛的研究，迄今為止，已從該屬真菌中分離得到了多肽類(lèi)、聚酮類(lèi)、生物堿類(lèi)、苯丙素類(lèi)、萜類(lèi)、核苷類(lèi)等多種結(jié)構(gòu)類(lèi)型的化合物約158個(gè)，NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中公開(kāi)了17個(gè)白僵菌菌株的基因組測(cè)序數(shù)據(jù)，白僵菌素、白僵菌交酯、球孢交酯、卵孢素及纖細(xì)素等活性分子的生物合成基因簇及其生物合成途徑也已得到闡明。本文就白僵菌屬真菌產(chǎn)生的天然產(chǎn)物、藥理活性及生物合成途徑等方面的最新研究成果進(jìn)行全面的總結(jié)，為白僵菌來(lái)源的新結(jié)構(gòu)活性天然產(chǎn)物的基因組挖掘以及已知重要活性分子資源的深入開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供參考。

1 化學(xué)成分和藥理活性

1.1 多肽類(lèi)化合物

多肽類(lèi)化合物是白僵菌屬真菌產(chǎn)生的一類(lèi)主要化合物類(lèi)型，目前已發(fā)現(xiàn)大約78個(gè)多肽類(lèi)化合物，包括核糖體多肽類(lèi)(ribosomal peptides)和非核糖體多肽類(lèi)(non-ribosomal peptides，NRPs)，研究較為廣泛的有白僵菌素(beauvericins)、白僵菌交酯(beauverolides)、球孢交酯(bassianolide)等。

1.1.1 核糖體多肽類(lèi)化合物

核糖體多肽類(lèi)化合物是核糖體以mRNA作為模板，利用20種常見(jiàn)的蛋白源氨基酸進(jìn)行合成得到的產(chǎn)物(個(gè)別生物可利用硒代半胱氨酸和吡咯賴氨酸)。化合物1～14為從球孢白僵菌中分離發(fā)現(xiàn)的核糖體多肽類(lèi)化合物(見(jiàn)圖1)，這些化合物為鐵載體及相關(guān)的衍生物，但其中僅含兩個(gè)(1、3～8)或三個(gè)異羥肟酸基團(tuán)的化合物(14)顯示出鐵結(jié)合的活性[1]。

1.1.2 非核糖體多肽類(lèi)化合物

非核糖體多肽類(lèi)化合物是不依賴mRNA或其他RNA模板，利用蛋白源氨基酸或非蛋白源氨基酸，通過(guò)非核糖體肽合成酶進(jìn)行催化合成，非核糖體肽合成酶中每個(gè)腺苷?；Y(jié)構(gòu)域的特異性決定了被選擇和激活氨基酸的種類(lèi)和數(shù)量。目前已經(jīng)在白僵菌中分離得到約有64個(gè)NRPS類(lèi)型的化合物，其中多為環(huán)縮肽類(lèi)，代表性的六元環(huán)縮肽類(lèi)化合物有白僵菌素(beauvericins)、isaridins、破壞素(destruxins)和isariins及其衍生物(見(jiàn)圖2)。

白僵菌素及其衍生物的核心結(jié)構(gòu)由三個(gè)氨基酸殘基與三個(gè)羥基酸殘基交替連接構(gòu)成，從白僵菌中分離得到的白僵菌素類(lèi)化合物包括白僵菌素(15)、白僵菌素A～F(16～19、23、24)及其衍生物allobeauvericins A～C(20～22)。白僵菌素(15)從球孢白僵菌的菌絲體中首次分離得到，因其具有抗腫瘤、殺蟲(chóng)、抗菌、抗病毒等多種藥理活性而得到廣泛研究。例如，白僵菌素對(duì)人乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌等多種腫瘤細(xì)胞均具有較好的藥理活性[2]，其抗癌作用機(jī)制與氧化應(yīng)激[3]、刺激細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高[4]、誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯[4-6]及細(xì)胞凋亡[2,5]、抑制腫瘤細(xì)胞遷移及腫瘤中新血管生成[2]等有關(guān)。白僵菌素還具有較好的殺蟲(chóng)活性，可有效殺滅Aedesaegypti、Calliphoraerythrocephala、Leptinotarsadecemlineata、Lygusspp.等多種害蟲(chóng)[7]。白僵菌素A～B(16、17)也是從球孢白僵菌中首次分離得到的，白僵菌素D～F(19、23、24)則是Beauveriasp.FKI-1366中分離得到，白僵菌素C(18)以及allobeauvericin A～C(20～22)則于Beauveriasp.中分離得到，這些化合物均具有較好的殺蟲(chóng)活性，可有效殺滅蚊子幼蟲(chóng)、蒼蠅、有色甲蟲(chóng)等害蟲(chóng)，白僵菌素A～B(16、17)和allobeauvericin A～C(20～22)對(duì)瘧原蟲(chóng)均有較好的殺滅作用，其IC50分別為2.3、2.8、2.5、3.0和1.9 μM[8]。白僵菌素對(duì)人、動(dòng)物和植物的多種病原菌均具有很強(qiáng)的抗菌活性，且對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌無(wú)選擇性，其抗菌作用機(jī)制與細(xì)菌細(xì)胞壁無(wú)關(guān)，可能與細(xì)菌細(xì)胞器或某些酶系統(tǒng)有關(guān)[2]。白僵菌素雖無(wú)抗真菌活性，但當(dāng)其與酮康唑或咪康唑合用時(shí)具有顯著的抗Candidaparapsilosis活性[2]；還可通過(guò)阻斷多藥外排和抑制全局調(diào)節(jié)劑TORC1激酶增強(qiáng)吡咯類(lèi)抗真菌藥對(duì)耐唑類(lèi)念珠菌的活性[9]。白僵菌素A、D～F(16、19、23、24)還可增強(qiáng)咪康唑的抗真菌活性，其中白僵菌素D(19)和白僵菌素E(23)可顯著增強(qiáng)咪康唑?qū)Ψ颠蚰退幮桶咨钪榫幕钚訹10]。白僵菌素還是一種強(qiáng)抗炎劑，可通過(guò)抑制Src和Syk來(lái)減弱NF-κB依賴性炎癥反應(yīng)[11]，并通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)并誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞凋亡來(lái)減輕哮喘[12]。此外，白僵菌素可通過(guò)有效抑制ACAT活性降低膽固醇[13]，還可通過(guò)抑制HIV-1整合酶來(lái)發(fā)揮抗HIV活性[14]。

Isaridin及其衍生物是由α-羥基酸、β-丙氨酸和另外四個(gè)α-氨基酸組成的六元環(huán)縮肽類(lèi)化合物。目前從B.felina中分離得到isaridins A、B(25、26)、isaridin C2(27)、isaridins E-G(28、31、32)、desmethylisaridins C1、C2(29、33)、desmethylisaridin E(30)和desmethylisaridin G(34)10個(gè)isaridins類(lèi)化合物[15,16]。研究發(fā)現(xiàn)，desmethylisaridin C1(33)具有一定的抗大腸桿菌活性，其MIC值為8 μg/mL[15]；而desmethylisaridin E(30)和desmethylisaridin C2(29)則可分別通過(guò)抑制超氧陰離子產(chǎn)生和抑制彈性蛋白酶釋放來(lái)發(fā)揮抗炎作用，其IC50值分別為10.00 ± 0.80 μM和10.01 ± 0.46 μM[16]。

破壞素及其衍生物基本結(jié)構(gòu)中含一個(gè)羧基酸殘基和五個(gè)氨基酸殘基，從白僵菌B.felina中分離得到的破壞素及衍生物有destruxin A(35)、destruxin A1(36)、destruxin A4(37)、roseotoxin B(38)、[β-Me-Pro] destruxin E chlorohydrin (39)、chlorohydrin destruxin A4(40)、destruxin E chlorohydrin(41)、destruxin E diol(42)、destruxin Ed1(43)、desmethyldestruxin C(44)、destruxin C(45)、roseotoxin C(46)、destruxins B、B1(47、48)、homodestruxin B(49)、roseotoxin A(50)、destruxin C2(51)、destruxin D2(52)、destruxin E1(53)、destruxins D、D1(54、55)、destruxin F(56)、hydroxydestruxin B(57)、hydroxyhomodestruxin B(58)、[Phe3,N-Me-Val5] destruxin B(59)、pseudodestruxins B、C(60、61)在內(nèi)的27種破壞素類(lèi)化合物[17-19]。破壞素類(lèi)化合物具有廣泛的殺蟲(chóng)、植物毒性活性，例如：destruxin A(35)和destruxins B、B1(47、48)對(duì)白血病細(xì)胞和脾淋巴細(xì)胞具有較好的細(xì)胞毒性作用[20]，destruxin B(47)對(duì)大鼠心肌組織具有正性變力作用和負(fù)性變時(shí)作用，destruxin B(47)和homodestruxin B(49)可抑制乙型肝炎病毒表面抗原，destruxin B(47)還可作為液泡型ATP酶的特異性、劑量依賴性和可逆性抑制劑，chlorohydrin destruxin A4(40)則可作為促紅細(xì)胞生成素誘導(dǎo)劑[21]。綠僵菌Metarhiziumrobertsii也可產(chǎn)生破壞素及其衍生物，且其生物合成途徑已經(jīng)闡明[22]，通過(guò)生物合成簇的骨架基因DtxS1的BlastP 分析比對(duì)，在已測(cè)序的白僵菌基因組中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)合成破壞素的相似功能基因，但與白僵菌中的環(huán)孢菌素C合成酶(cyclosporin synthase)、球孢交酯合成酶(bassianolide synthase)、白僵菌素合成酶(beauvericin synthetase)和恩鐮孢菌素成酶(enniatin synthase)的相似性達(dá)40%左右。

從白僵菌中還產(chǎn)生具有多種活性的isariin、scopularide、isarfelin、球孢交酯和bassiatin等多種其他非核糖體多肽類(lèi)化合物。例如：Baute等[23]從Isariafelina(=B.felina)中分離得到化合物isariin和isariins B～D(62～65)，其中僅isariin C(64)和isariin D(65)具有較好的殺蟲(chóng)活性；Langenfeld等[24]從B.felina中分離得到的化合物iso-isariin B(66)對(duì)象蟲(chóng)類(lèi)害蟲(chóng)有一定殺滅作用，其LD50為10 μg/mL；而iso-isariin D(67)具有很強(qiáng)的鹵蟲(chóng)致死性，其LD50為26.58 μΜ[17]；Elbanna等[25]從Beauveriasp.CMB-F585 中分離得到的scopularides C-G(68～72)，但并沒(méi)有明顯的抗細(xì)菌、抗真菌或抗癌活性；有研究從白僵菌中分離得到了的環(huán)孢菌素A(73)，環(huán)孢菌素A作為免疫抑制劑被廣泛應(yīng)用于器官移植以及自身免疫病的治療，還具有一定的抗腫瘤、抗寄生蟲(chóng)、抗真菌、抗HIV和丙型肝炎病毒等活性[26]。Guo等[27]從I.felina中分離得到的isarfelins類(lèi)化合物isarfelins A、B(74、75)具有一定的殺蟲(chóng)、抗菌等活性；Geng等[28]則從Beauveriaamorpha中分離得到了具有酪氨酸酶抑制活性的槲寄生酰胺(76)；從B.bassiana中分離得到的球孢交酯(77)具有一定的抗癌、抗瘧原蟲(chóng)、抗分枝桿菌[29]、殺蟲(chóng)[30]等活性；從B.bassianaK-717中分離得到的血小板聚集抑制因子bassiatin(78)對(duì)HeLa細(xì)胞、L929細(xì)胞和MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞均具有細(xì)胞毒性作用[31]，對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)也有效[32]。

圖2 非核糖體多肽類(lèi)化合物15～78的結(jié)構(gòu)Fig.2 Structures of the nonribosomal peptides 15-78

1.2 聚酮類(lèi)化合物

聚酮類(lèi)化合物(polyketides，PKs)是通過(guò)聚酮合酶利用乙酰輔酶A和丙二酸單酰輔酶A作為構(gòu)造單元合成的一類(lèi)化合物，其終產(chǎn)物來(lái)源于聚酮中間體。目前已從白僵菌中分離得到了31個(gè)聚酮類(lèi)化合物(見(jiàn)圖3)，而且具有一定的藥理活性和生物活性。

圖3 聚酮類(lèi)化合物79～109的結(jié)構(gòu)Fig.3 Structures of the polyketides 79-109

白僵菌能產(chǎn)生包括oxirapentyns A～L(79～90)在內(nèi)的12個(gè)oxirapentyns類(lèi)化合物，并展示了重要的活性。Oxirapentyn A(79)從B.felinaSANK 13682中首次分離得到，具有一定的細(xì)胞毒性[33]；Smetanina和Yurchenko等[33-35]先后從I.feline中分離得到了oxirapentyns B～D(80～82)、oxirapentyn L(90)和oxirapentyns E～K(83～89)，其中oxirapentyn E(83)可作為植物生長(zhǎng)促進(jìn)劑來(lái)促進(jìn)玉米和大麥的生長(zhǎng)。卵孢素(91)是從B.bassiana中分離得到的一種紅色素，具有一定的細(xì)胞毒性，可通過(guò)誘導(dǎo)氧化應(yīng)激使ROS和丙二醛水平升高影響線粒體膜電位，造成DNA損傷而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[36]。卵孢素具有一定的殺蟲(chóng)作用，在球孢白僵菌將宿主殺死后，卵孢素還可以發(fā)揮其抗菌作用，抑制其他微生物生長(zhǎng)，以保證球孢白僵菌更好地利用宿主營(yíng)養(yǎng)進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖[37]。Smetanina等[38]從I.felinaKMM 4639中分離得到了化合物isariketides A和B(92、93)和isariketide A acetate(94)，其中isariketide A(92)和isariketide A acetate(94)對(duì)22Rv1、PC-3 和LNCaP細(xì)胞具有一定的細(xì)胞毒性。Gao等[39]從油松毛蟲(chóng)病原真菌布氏白僵菌B.brongniartii中分離得到具有殺蟲(chóng)活性的小分子毒素物質(zhì)間甲基苯甲酸甲酯(95)和對(duì)甲基苯甲酸甲酯(96)，這兩個(gè)化合物都對(duì)油松毛蟲(chóng)現(xiàn)出很高的注射毒性，但其飼喂毒性和表皮接觸毒性不高。Hu等[40]通過(guò)活性導(dǎo)向的分離從B.amorpha中分離得到了具有自由基清除活性的(-)-terredionol(97)和6-methyl-2,4-dihydroxyphenyl 4-O-methyl-beta-D-glucopyranoside(98)，后者具有與TroloxTMC、抗壞血酸或槲皮素相當(dāng)?shù)淖杂苫宄钚院椭|(zhì)過(guò)氧化抑制活性。Yamazaki等[41]從B.bassianaTPU942中分離得到了1-hydroxy-10-methoxy-dibenz[b,e]oxepin-6,11-dione(99)、chrysazin(100)和globosuxanthone A(101)，其中后兩種化合物具有抗白色念珠菌活性，globosuxanthone A(101)還可以抑制HCT-15(結(jié)腸)和Jurkat(T細(xì)胞淋巴瘤)的生長(zhǎng)，其IC50值分別為10.7 和2.3 μM。Oller-López等[42]從B.bassiana中分離得到了(+)-bassianolone(105)，該化合物為抗菌化合物cephalosporolides E和cephalosporolides F的前體，具有一定的抗革蘭氏陽(yáng)性菌和抗真菌等活性。Zenitani等[43]從B.felineQN22047中分離得到化合物gerfelin(106)，該化合物可以非競(jìng)爭(zhēng)性地抑制hGGPP合酶介導(dǎo)的香葉基二磷酸的合成。Lee等[44]從B.bassiana中分離得到了beauvetetraones A～C(102～104)，其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)暗示了該類(lèi)化合物可能在B.bassiana抗氧化應(yīng)激過(guò)程中起作用。此外，Krasnoff等[1]從B.bassiana中分離得到了鐵載體相關(guān)化合物mevalonolactone(107)，Luo等[45]從B.bassianaΔBbPacC突變體中分離純化到了黃色化合物bassianolone B(108)，de Souza Daniel等[46]則從B.bassiana中分離得到了具有抗菌活性的化合物5-hydroxymethyl-2-furanoic acid(109)。

1.3 聚酮-非核糖體多肽雜合類(lèi)化合物

PK-NRP(polyketide-nonribosomal peptides)雜合化合物是經(jīng)過(guò)聚酮合酶和非核糖體多肽合酶協(xié)同作用催化形成的一類(lèi)化合物，目前在白僵菌屬真菌中分離得到的PK-NRP雜合化合物約有36個(gè)，其中多數(shù)為白僵菌交酯類(lèi)化合物(見(jiàn)圖4)，該類(lèi)化合物也展示了優(yōu)良的藥理活性和生物活性。

圖4 PKS-NRPS雜合化合物110～145的結(jié)構(gòu)Fig.4 Structures of the NRPS-PKS hybrids 110-145

白僵菌交酯類(lèi)化合物屬于四元環(huán)縮肽類(lèi)化合物，由一個(gè)羥基酸和三個(gè)氨基酸組成，并偶聯(lián)一個(gè)多烯烴鏈。目前已從白僵菌中分離得到27個(gè)白僵菌交酯類(lèi)化合物。Elsworth等[47]從B.bassiana中先后分離得到了白僵菌交酯類(lèi)化合物beauverolide A(110)、beauverolide B(129)、beauverolide Ba(123)、beauverolide C(130)、beauverolide Ca(121)、beauverolides D、E(111、112)、beauverolide Ea(119)、beauverolide F(113)、beauverolide Fa(118)、beauverolides H～I(xiàn)(127、128)；Grove等[48]從B.bassiana中分離得到了beauverolide Ba(123)、beauverolide Ca(121)、beauverolide Ja(114)和beauverolide Ka(115)；Jegorov 等[49]從B.tenella中分離得到了beauverolide L(131)和beauverolide La(120)； Kuzma等[50]從B.bassiana中分離得到了beauverolide M(132)、beauverolide N(126)和beauverolide P(133)；Mochizuki和Namatame等從Beauveriasp.中分別分離得到了beauverolide I(125)、beauverolide II(124)[51]和beauverolide III(117)[52]；Matsuda等[53]則從Beauveriasp.FO-6979中分離得到beauverolide IV(136)、beauverolide V(116)、beauverolides VI、VII(134、135)和beauverolide VIII(122)。上述白僵菌交酯類(lèi)化合物具有廣泛的藥理活性，例如：beauverolide L(131)可以通過(guò)靶向MCP-1、MMP2和CTGF途徑抑制成肌纖維細(xì)胞分化來(lái)減輕肺纖維化[54]；beauverolide I(125)具有一定的抗衰老作用，可作為抗衰老劑的潛在先導(dǎo)化合物[55]； beauverolide III(117)可有效抑制脂滴形成，從而對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的早期事件產(chǎn)生影響[56]。

球孢菌素(137)和纖細(xì)素(138)為從B.tenella和B.bassiana中分離得到的兩種黃色化合物，它們均具有較好的殺蟲(chóng)作用。此外，纖細(xì)素還可作為鐵螯合劑防止球孢白僵菌中因鐵過(guò)載誘導(dǎo)產(chǎn)生的活性氧的毒性[57]。Andrioli等[58]從白僵菌中分離得到pyridovericin-N-O-(4-O-methyl-β-d-glucopyranoside)(139)、pretenellin B(140)、pyridovericin(141)、1-methyl-11-hydroxylumichrome(142)和lumichrome (143) 等化合物，其中pyridovericin(141)具有一定的細(xì)胞毒性。此外，Neumann和Takahashi等[59,60]分別從B.bassiana中分離到了具有中等細(xì)胞毒性的tetramic acid衍生物beauversetin(144)和活性未知的化合物pyridomacrolidin(145)。

1.4 其他類(lèi)型化合物

白僵菌還產(chǎn)生生物堿、苯丙素類(lèi)、萜類(lèi)和核苷類(lèi)等其他類(lèi)型的化合物，其中146～149為生物堿類(lèi)化合物，150～152為苯丙素類(lèi)化合物，153～155為萜類(lèi)化合物，156～158為核苷類(lèi)化合物(見(jiàn)圖5)，這些化合物也具有多樣的生物活性。例如：Fan等[61]從B.tenella發(fā)酵液中分離純化出2-哌啶酮(146)、六氫化-吡咯環(huán)[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮(147)和2-香豆?jié)M酮(150)多個(gè)化合物，其中2-哌啶酮和2-香豆?jié)M酮對(duì)油松毛蟲(chóng)具有顯著的殺滅活性；Du等[17]從B.felinaEN-135中分離得到了felinones A、B(151、152)，其中felinone B(152)對(duì)銅綠假單胞菌具有一定的抑制活性；Baek和Geng等[62,28]分別從B.bassianaCS1029和中B.amorpha分離得到的dhFAME(153)和2′-氨基-2′-脫氧鳥(niǎo)苷(156)均具有抑制黑色素生成的活性；Liu等[63]首次從B.bassiana中分離得到了N6-(2-羥乙基)腺苷(HEA)(158)，該化合物是第一個(gè)生物來(lái)源的鈣拮抗劑，具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖、抗炎、殺蟲(chóng)、保護(hù)腎臟和鎮(zhèn)靜等藥理活性，說(shuō)明該白僵菌菌株可作為HEA的來(lái)源，具有廣闊的研究前景。此外，de Souza Daniel等[46]從B.bassiana的乙酸乙酯提取物中分離得到了pyridine-2,6-dicarboxylic acid(148)和monomethyl dipicolinate(149)，從丁醇提取物中分離得到了β-adenosine(157)；而Yang等[64]則從白僵菌中分離得到了高效糖皮質(zhì)激素地塞米松合成的中間體16α-甲基-RSA(154)及其11α-羥基化產(chǎn)物(155)。

圖5 其他類(lèi)型化合物146～158的結(jié)構(gòu)Fig.5 Structures of other compounds 146-158

由此可見(jiàn)，白僵菌產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)和種類(lèi)復(fù)雜多樣的天然產(chǎn)物具有優(yōu)良的藥理活性和生物活性(見(jiàn)表1)，展現(xiàn)出極大的應(yīng)用和開(kāi)發(fā)潛力。

表1 白僵菌產(chǎn)生具有藥理活性的主要天然產(chǎn)物

2 白僵菌天然產(chǎn)物生物合成研究

隨著基因組測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，多種白僵菌菌株的基因組測(cè)序已經(jīng)完成。目前白僵菌素、白僵菌交酯類(lèi)化合物、球孢交酯、卵孢素和纖細(xì)素的生物合成基因及其功能已經(jīng)得到克隆和驗(yàn)證(見(jiàn)表2)，其生物合成途徑也得到了較為清楚的闡明。

表2 白僵菌中已知生物合成途徑的化合物及其生物合成關(guān)鍵基因

2.1 白僵菌素的生物合成

Xu等[65]從球孢白僵菌中獲得編碼白僵菌素的合成酶基因bbBeas，并通過(guò)基因敲除和異源表達(dá)等手段證實(shí)該基因負(fù)責(zé)白僵菌素的生物合成；在其合成過(guò)程中，以D-2-羥基異戊酸(D-Hiv)和N-甲基-L-苯丙氨酸(N-Me-L-Phe)為底物合成二肽中間化合物，然后將 3 個(gè)該中間化合物聚合形成低聚環(huán)狀化合物白僵菌素(見(jiàn)圖6)。鐮刀菌Fusariumproliferatum和Fusariumvenenatum也可合成白僵菌素，兩者白僵菌素合成基因fpBeas和fvBeas的氨基酸序列的相似性為62.9%，而球孢白僵菌bbBeas基因與鐮刀菌白僵菌素合成基因fpBeass和fvBeas的氨基酸序列的相似性分別為74%和58.4%，鐮刀菌與球孢白僵菌的白僵菌素合成基因中獨(dú)特的序列差異可能是其高產(chǎn)量的關(guān)鍵因素[66]。Bassiatin是白僵菌素三聚體的一個(gè)環(huán)化單體單元，參與了白僵菌素的生物合成，因此可能是該途徑的旁路產(chǎn)物[67]。Kim等[68]發(fā)現(xiàn)，白僵菌素合成酶是球孢白僵菌中一種新型的CaM結(jié)合蛋白，在白僵菌素的生物合成過(guò)程中，能夠以Ca2+依賴的方式與CaM相互作用。而球孢白僵菌2-酮異戊酸還原酶(BbKIVR)可在由環(huán)境刺激介導(dǎo)的白僵菌素生物合成中通過(guò)CaM信號(hào)傳導(dǎo)途徑發(fā)揮重要作用[69]。Yu等[70]將KIVR工程化到釀酒酵母BJ5464-NpgA中，進(jìn)一步提高了白僵菌素的產(chǎn)量，并通過(guò)加入l-Val改善了KIVR底物的供應(yīng)，增加了白僵菌素的產(chǎn)量；并利用該表達(dá)系統(tǒng)表征了來(lái)自F.venenatumNRRL 26139的白僵菌素合成酶 FvBEAS。白僵菌素合成酶催化白僵菌素合成時(shí)，在C1-A1-T1-C2-A2-MT-T2a-T2b-C3域結(jié)構(gòu)中，C3和C2輪流將兩種生物合成前體D-2-羥基異戊酸(D-Hiv)和L-苯丙氨酸(Phe)加入到二肽鏈中，最后C3使鏈環(huán)化，Yu等[71]通過(guò)使C2和C3與兩個(gè)SNAC連接的前體反應(yīng)重建了體外白僵菌素的生物合成。

圖6 白僵菌素生物合成基因簇(A)及其生物合成途徑(B)Fig.6 Biosynthetic gene cluster of beauvericin (A) and biosynthetic pathway (B)

2.2 白僵菌交酯類(lèi)化合物的生物合成

白僵菌中的白僵菌交酯化合物生物合成還未有研究，但Wang等[72]闡明了蛹蟲(chóng)草(Cordycepsmilitaris)中白僵菌交酯的生物合成基因簇，并推測(cè)其生物合成是在PKs-NRPs雜合裝配線上完成的。BlastP分析發(fā)現(xiàn)了白僵菌中白僵菌交酯類(lèi)化合物生物合成基因簇，與蛹蟲(chóng)草中相應(yīng)基因簇基因的氨基酸序列的相似性到達(dá)72.9%(見(jiàn)圖7A)。在其生物合成過(guò)程中，首先HR-PKS Cm3B催化乙酰輔酶A、丙二酸單酰輔酶A和SAM合成聚酮中間體，然后ATP依賴性乙酰輔酶A連接酶Cm3D將聚酮中間體轉(zhuǎn)化為硫酯的形式，乙?；D(zhuǎn)移酶Cm3C再將聚酮中間體轉(zhuǎn)運(yùn)至NRPS Cm3A中的第一個(gè)T結(jié)構(gòu)域。Cm3A將聚酮中間體、L-苯丙氨酸、L-丙氨酸和D-亮氨酸(或D-allo-異亮氨酸)組裝起來(lái)以形成beauverolide I(或beauverolide III)(見(jiàn)圖7B)。

2.3 球孢交酯的生物合成

Xu等[73]最先克隆了球孢白僵菌的bbBsls基因，該基因編碼一個(gè)非核糖體肽合成酶(NRPS)，bbBsls基因缺失突變菌株不再產(chǎn)生球孢交酯說(shuō)明bbBsls基因參與了球孢交酯的生物合成，盡管bbBsls基因所在基因簇的其他基因的功能仍未得到進(jìn)一步的驗(yàn)證(見(jiàn)圖8A)，但可結(jié)合已知環(huán)縮肽生物合成機(jī)制和球孢交酯的結(jié)構(gòu)特征和基因簇構(gòu)成對(duì)球孢交酯的生物合成途徑進(jìn)行推測(cè)。在其假定的生物合成過(guò)程中，首先以D-2-羥基異戊酸(D-Hiv)和N-甲基-亮氨酸(N-Me-Leu)作為底物合成二肽中間化合物，然后球孢交酯合成酶通過(guò)對(duì)該中間化合物進(jìn)行遞歸縮合來(lái)催化球孢交酯的形成(見(jiàn)圖8B)。Boecker等[74]將bbBsls基因?qū)牒谇惯M(jìn)行異源表達(dá)并喂養(yǎng)前體物質(zhì)15 mMD-Hiv，將bbBsls基因成功表達(dá)且球孢交酯的產(chǎn)量達(dá)到378.77±59.74 mg/L。

圖7 白僵菌交酯類(lèi)化合物生物合成基因簇(A)及生物合成途徑(B)[72]Fig.7 Biosynthetic gene cluster of beauverolides (A) and the putative biosynthesis pathway (B)

2.4 卵孢素的生物合成

Feng等[75]首先闡明了卵孢素的生物合成途徑，該途徑涉及一個(gè)含有七個(gè)生物合成基因的基因簇(圖9A)，其中PKS卵孢素合酶1(OpS1)催化乙酰輔酶A和3個(gè)丙二酸單酰輔酶A生成苔色酸，苔色酸被羥化酶OpS4羥化為中間體6-甲基-1,2,4-苯三酚，該中間體可被非酶促氧化為5,二脫氧-卵孢素或被雙加氧酶OpS7酶促氧化為6-甲基-1,2,4,5-苯四酚，6-甲基-1,2,4,5-苯四酚通過(guò)過(guò)氧化氫酶OpS5進(jìn)一步二聚為卵孢素(圖9B)。其中OpS3編碼含有Gal4的Zn2Cys6結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，該基因的缺失會(huì)導(dǎo)致突變株中與卵孢素生物合成相關(guān)的其他基因表達(dá)失活，而OpS3的過(guò)表達(dá)則顯著增強(qiáng)了基因簇其他基因的表達(dá)。此外，Bbsmr1可通過(guò)調(diào)節(jié)OpS3實(shí)現(xiàn)負(fù)調(diào)節(jié)作用[37]，Bbmsn2則為pH依賴性負(fù)調(diào)節(jié)劑，可根據(jù)外界PH變化進(jìn)行調(diào)整，以增加球孢白僵菌的毒力并促進(jìn)菌株的生長(zhǎng)[76]。

圖8 球孢交酯生物合成基因簇(A)及其假定的生物合成途徑(B)Fig.8 Biosynthetic gene cluster of bassianolide (A) and putative biosynthetic pathway (B)

圖9 卵孢素生物合成基因簇及其生物合成途徑Fig.9 Biosynthetic gene cluster of oosporein and the biosynthetic pathway

2.5 纖細(xì)素的生物合成

早在2007年白僵菌纖細(xì)素的生物合成基因簇和生物合成途徑就已經(jīng)得到初步闡明(見(jiàn)圖10A)，PKS-NRPS合成酶TenS與NRPS合成酶TenS3的共同作用產(chǎn)生前體pretenellin-A[77]。Halo等[78]利用基因敲除、反義RNA和基因共表達(dá)等方法對(duì)卵孢素生物合成途徑中最后一步進(jìn)行驗(yàn)證，從而完善了纖細(xì)素的生物合成途徑，其中TenS1編碼的細(xì)胞色素P450氧化酶催化pretenellin-A發(fā)生氧化環(huán)擴(kuò)展，使五元環(huán)結(jié)構(gòu)形成2-吡啶酮六元環(huán)，形成化合物pretenellin-B，TenS2編碼的細(xì)胞色素P450單加氧酶使2-吡啶酮環(huán)上的氮原子羥基化從而形成纖細(xì)素(見(jiàn)圖10B)。BlastP分析表明TenS2屬于細(xì)胞色素P450 N-單加氧酶的相對(duì)罕見(jiàn)類(lèi)別，其作用機(jī)理與已知的氮原子羥基化的方式均不相同。此外，prototenellin-D是纖細(xì)素的支路代謝途徑產(chǎn)物，可能是由基因組中未知基因編碼的氧化酶催化的；15位羥基化的產(chǎn)物pyridovericin和15-hydroxytenellin的存在表明在球孢白僵菌中可能存在對(duì)聚酮化合物側(cè)鏈的羥基化有選擇性的其他細(xì)胞色素P450酶發(fā)揮作用，13-hydroxypretenellin-B可能與pyridovericin是同一或其他P450氧化酶的產(chǎn)物。研究還發(fā)現(xiàn)了一個(gè)非纖細(xì)素的生物合成簇內(nèi)的甲基轉(zhuǎn)移酶可催化15-hydroxyaltenellin N1-羥基的甲基化，而過(guò)表達(dá)簇內(nèi)的特異性轉(zhuǎn)錄因子TenR后新發(fā)現(xiàn)包括甲基葡萄糖基化的產(chǎn)物在內(nèi)的四個(gè)新結(jié)構(gòu)的纖細(xì)素類(lèi)化合物，纖細(xì)素 BGC外部的GT-MT(糖基轉(zhuǎn)移酶-甲基轉(zhuǎn)移酶)基因負(fù)責(zé)吡喃葡萄糖苷的形成[79]。Jirakkakul等[57]發(fā)現(xiàn)球孢白僵菌鐵蛋白缺乏突變體中纖細(xì)素和鐵-纖細(xì)素復(fù)合物的產(chǎn)量顯著增加，說(shuō)明鐵蛋白和纖細(xì)素的生物合成之間的意想不到的聯(lián)系可能是鐵介導(dǎo)的氧化應(yīng)激期間的生存策略。Heneghan等[80]通過(guò)用米曲霉amyB啟動(dòng)子替換其所有四個(gè)組成基因的啟動(dòng)子，在異源宿主米曲霉中實(shí)現(xiàn)了球孢白僵菌完整纖細(xì)素生物合成途徑的受控表達(dá)，這樣產(chǎn)生的纖細(xì)素的濃度是天然宿主的五倍以上。Yakasai等[81]研究了球孢白僵菌CBS110.25的代謝產(chǎn)物纖細(xì)素在表觀遺傳修飾劑5-氮雜胞苷和亞磺?；p異羥肟酸的存在下以及在纖細(xì)素生物合成基因簇的個(gè)別基因被沉默的條件下的生物合成，發(fā)現(xiàn)合成了許多新化合物，這表明纖細(xì)素可能只是這條代謝途徑上各種可能產(chǎn)物中的一種結(jié)果。上述研究為纖細(xì)素的生產(chǎn)應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)。

圖10 纖細(xì)素生物合成基因簇(A)及其生物合成途徑(B)Fig.10 Biosynthetic gene cluster of tenellin (A) and the biosynthetic pathway (B)

3 展望

白僵菌作為一類(lèi)重要的昆蟲(chóng)病原真菌，具有強(qiáng)大的合成天然產(chǎn)物的潛力，能夠產(chǎn)生結(jié)構(gòu)類(lèi)型多樣的活性天然產(chǎn)物，包括肽類(lèi)、聚酮類(lèi)、生物堿類(lèi)、苯丙素類(lèi)、萜類(lèi)、核苷類(lèi)等，并表現(xiàn)出較好的抗腫瘤、殺蟲(chóng)、抗菌、抗炎等活性，其應(yīng)用主要集中在生物防治、生物催化等領(lǐng)域。此外，在活性化合物生物合成機(jī)制方面，已在白僵菌屬真菌中發(fā)現(xiàn)了白僵菌素合成酶基因bbBeas、球孢交酯合成酶基因bbBsls、卵孢素合成酶基因OpS2～OpS7和纖細(xì)素合成酶基因tenS分別是白僵菌素、球孢交酯、卵孢素和纖細(xì)素骨架結(jié)構(gòu)生物合成的關(guān)鍵酶基因，白僵菌交酯類(lèi)化合物在蛹蟲(chóng)草(Cordycepsmilitaris)中的生物合成機(jī)制得到闡明，其合成酶基因cm3負(fù)責(zé)該化合物的生成，但在白僵菌屬真菌中的生物合成機(jī)制尚未得到研究證實(shí)。并且，白僵菌素和纖細(xì)素已通過(guò)異源表達(dá)策略使其產(chǎn)量獲得大幅度的提高。在后基因組時(shí)代，合成生物學(xué)相關(guān)研究策略和技術(shù)的發(fā)展將大大促進(jìn)白僵菌天然產(chǎn)物在藥理活性應(yīng)用和生物合成方面的研究，進(jìn)而必將促進(jìn)白僵菌來(lái)源的新結(jié)構(gòu)活性天然產(chǎn)物的基因組挖掘和發(fā)現(xiàn)以及已知重要活性分子的開(kāi)發(fā)應(yīng)用。