張文文 姜亮亮 綜述 王晶 審校

卵巢癌是女性癌癥相關(guān)死亡的第五大常見(jiàn)原因，其死亡率超過(guò)任何其他婦科腫瘤。2018年，全球診斷出超過(guò)295 000例卵巢癌新病例，同年死亡人數(shù)約184 000例[1]。由于卵巢癌的隱蔽性及有限的篩查手段導(dǎo)致多數(shù)患者初治時(shí)已是晚期。盡管治療方法得以發(fā)展，但由于其預(yù)后差和易復(fù)發(fā)，其五年生存率仍不理想[2]。因此，迫切需要一種新穎有效的治療方法來(lái)改善預(yù)后。

近年來(lái)，隨著程序性死亡受體1(PD-1)抗體作為檢查點(diǎn)抑制劑以及嵌合抗原受體修飾的T細(xì)胞(CAR-T)療法在血液系統(tǒng)中的顯著突破[3]，利用自身免疫系統(tǒng)攻擊腫瘤的細(xì)胞免疫療法在實(shí)體瘤的研究中越發(fā)流行。CAR-T療法代表了癌癥免疫療法的里程碑式轉(zhuǎn)變，其利用表達(dá)嵌合抗原受體(CAR)的基因工程T細(xì)胞通過(guò)基因轉(zhuǎn)移技術(shù)重定向及重新編程后過(guò)繼轉(zhuǎn)移回自身，識(shí)別并附著于腫瘤表面，選擇性靶向并殺死表達(dá)相關(guān)抗原的腫瘤細(xì)胞[4]。許多研究表明，CAR-T療法在卵巢癌中取得了重大進(jìn)展。在本綜述中，我們概述了卵巢癌中CAR-T療法的生物學(xué)基礎(chǔ)、臨床應(yīng)用、所面對(duì)的挑戰(zhàn)及可能改善治療效果的策略(圖1)。

圖1 CAR-T在卵巢癌中的研究進(jìn)展示意圖

1 CAR的結(jié)構(gòu)

CAR是一種工程化的合成受體，它對(duì)腫瘤細(xì)胞的影響主要是由基本結(jié)構(gòu)決定的。CAR主要由細(xì)胞外抗原識(shí)別區(qū)(ScFvs)、間隔區(qū)、跨膜結(jié)構(gòu)域及細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)組成。ScFvs主要由重鏈和輕鏈的可變區(qū)組成，理論上可識(shí)別在靶細(xì)胞上表達(dá)的任何類型的表面抗原，而不受主要組織相容復(fù)合物(MHC)分子的限制[5-6]；間隔區(qū)又稱鉸鏈結(jié)構(gòu)域，為重輕鏈提供足夠的折疊空間，與ScFvs共同構(gòu)成細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域；跨膜結(jié)構(gòu)域則將細(xì)胞外部分與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域相連接，通常來(lái)源于CD8、CD3-ζ、CD4、OX40和H2-Kb[7]；信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)包括T細(xì)胞受體(TCR)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)組分和/或共刺激受體，其主要功能為激活T細(xì)胞[8]。

目前已有四代CAR在臨床實(shí)踐中應(yīng)用。1989年以色列一個(gè)研究小組首次將ScFv和CD3-ζ鏈基因連接刺激T細(xì)胞活化，創(chuàng)造出第一代CAR-T細(xì)胞[9]；由于這種CAR-T細(xì)胞的低效性及低持久性，研究者在原始基礎(chǔ)上加入共刺激分子(如CD28)[10]；為了進(jìn)一步增強(qiáng)體內(nèi)持久性及效應(yīng)性，研究者們開發(fā)出包含兩個(gè)共刺激結(jié)構(gòu)域的第三代CAR[11]；第四代CAR稱作“TRUCK T細(xì)胞”，它可以產(chǎn)生細(xì)胞因子(特別是IL12)用于促進(jìn)腫瘤微環(huán)境中CAR-T細(xì)胞的進(jìn)一步活化[12]。此外，最近研究者又開發(fā)出了各種新型CAR-T，如使用截短形式的CD19蛋白的自體T細(xì)胞、雙抗原靶向CAR、抑制性CAR等[13-15]。

2 CARs的轉(zhuǎn)導(dǎo)

CAR-T細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)是用遺傳學(xué)方法將特定基因轉(zhuǎn)移到小鼠和人T細(xì)胞中，主要包括傳統(tǒng)的載體系統(tǒng)及新興的基因組編輯技術(shù)。常見(jiàn)的載體系統(tǒng)包括病毒類及非病毒類載體，由于病毒能夠在體內(nèi)和細(xì)胞外傳播到全身，并且可以穿透細(xì)胞核且效率高，大多數(shù)的CAR-T研究都利用病毒載體進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)[16]，卵巢癌中常用的病毒方法包括逆轉(zhuǎn)錄病毒[17]、慢病毒[18]、腺病毒及腺相關(guān)病毒[19]，但其也有制造過(guò)程相對(duì)復(fù)雜，成本較高等缺點(diǎn)；與之相對(duì)的非病毒載體如脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移[20]、mRNA介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)[21]、轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)[22]則易于操作，可轉(zhuǎn)移大規(guī)模的基因，且炎癥感染率低，但同時(shí)也需要克服轉(zhuǎn)染率低和轉(zhuǎn)基因表達(dá)差等問(wèn)題。因此，在操作中盡可能的選擇適合的載體是必不可少的。

除了載體系統(tǒng)，新興的基因組編輯技術(shù)也是CAR-T療法必需的?；蚪M編輯技術(shù)包括最初的大范圍核酸酶、轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)核酸酶(TALEN)和鋅指核酸酶(ZFN)的分子技術(shù)，以及近幾年使用最廣泛的CRISPR/Cas9平臺(tái)。CRISPR/Cas9是在細(xì)菌和古細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的Ⅱ型獲得性免疫防御系統(tǒng)，CRISPR序列由散布在高度保守的重復(fù)DNA序列中的“間隔”序列組成。間隔序列與外來(lái)核酸互補(bǔ)，并允許Cas9降解外來(lái)物質(zhì)并保護(hù)其免受入侵病毒(即噬菌體)、質(zhì)粒和其他類型的外來(lái)核酸的侵害[23]。CRISPR/Cas9利用可定制的單鏈向?qū)NA(sgRNA)形式的核酸靶向基因組中的特定基因座，并利用核酸內(nèi)切酶Cas9(一種雙鏈RNA特異性核糖核酸酶)靶向任何DNA操作[24]。與其他可編程核酸酶相比，CRISPR/Cas9系統(tǒng)更簡(jiǎn)便、靈活和多重基因編輯潛力等[25]。據(jù)最新研究顯示，CRISPR/Cas9系統(tǒng)與病毒或非病毒轉(zhuǎn)基因傳遞方法相結(jié)合，可用于將CAR-T細(xì)胞調(diào)節(jié)劑導(dǎo)入特定的基因組位點(diǎn)[26-27]，并改善激活誘導(dǎo)細(xì)胞死亡(AICD)現(xiàn)象。這項(xiàng)新興技術(shù)有可能徹底改變以CAR-T細(xì)胞為基礎(chǔ)的癌癥治療方法。盡管該技術(shù)可用于克服常規(guī)CAR-T療法中存在的若干障礙，但是想真正投入臨床仍須解決臨床翻譯中的諸多挑戰(zhàn)，如用大規(guī)模轉(zhuǎn)染系統(tǒng)生產(chǎn)CRISPR/Cas9編輯的CAR-T細(xì)胞時(shí)電穿孔后淋巴細(xì)胞活力降低，在細(xì)胞收獲時(shí)不能達(dá)到目標(biāo)輸注劑量[28]，Cas9-sgRNA結(jié)合和切割與靶DNA序列高度相似的序列導(dǎo)致基因組中不需要的位點(diǎn)發(fā)生突變等[29]。盡管面對(duì)很多挑戰(zhàn)，未來(lái)幾年，CRISPR/Cas9仍可能成為基于基因編輯的許多療法的引擎。目前，Salas-Mckee所在的中心正在進(jìn)行CRISPR/Cas9技術(shù)的首次人體試驗(yàn)，該技術(shù)使用多重sgRNA提高工程化T細(xì)胞在癌癥中的療效[30]。

3 卵巢癌中CAR-T細(xì)胞治療的合理性及優(yōu)勢(shì)

CAR-T細(xì)胞在單個(gè)融合分子中結(jié)合了抗原特異性和T淋巴細(xì)胞活化特性[31]。盡管CAR-T療法在血液系統(tǒng)中取得了顯著成效，但在實(shí)體瘤中的嘗試卻不盡人意。和血液系統(tǒng)疾病相比，實(shí)體瘤很難找到針對(duì)性的特異性抗原；而且CAR-T細(xì)胞必須克服實(shí)體瘤特殊的組織病理學(xué)特征、異常的血管系統(tǒng)、腫瘤微環(huán)境、免疫抑制分子和免疫調(diào)節(jié)劑等對(duì)其抗腫瘤活性的限制[4]。雖然將CAR-T應(yīng)用于實(shí)體瘤存在挑戰(zhàn)，但其仍為治療卵巢癌提供了新的視角[32-33]。第一項(xiàng)關(guān)于卵巢癌的CAR-T研究是由Hwu等[33]在1993年進(jìn)行的，他們?cè)诼殉舶┙M織的腫瘤浸潤(rùn)細(xì)胞(TILs)上遺傳表達(dá)針對(duì)葉酸結(jié)合蛋白(MOV18)的scFV。這種修飾的TILs成功裂解卵巢癌細(xì)胞，為探索針對(duì)卵巢癌的CAR-T療法打開了新的機(jī)會(huì)之窗。

就卵巢癌而言，CAR-T治療有兩個(gè)優(yōu)勢(shì)。其一，卵巢癌細(xì)胞表面表達(dá)很多腫瘤相關(guān)抗原，據(jù)報(bào)道除CA125外，癌細(xì)胞還表達(dá)超過(guò)60種腫瘤相關(guān)抗原[34]。這為CAR-T設(shè)計(jì)提供了更多的目標(biāo)；目前，許多臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行以明確其治療卵巢癌的安全性和可行性，在一項(xiàng)針對(duì)間皮素(CART-meso)的CAR-T細(xì)胞試驗(yàn)(NCT02159716)中，初步結(jié)果顯示在沒(méi)有腫瘤外效應(yīng)或細(xì)胞釋放綜合征的情況下，輸注的CAR-T細(xì)胞具有良好的耐受性[31]。目前正在進(jìn)行的臨床試驗(yàn)還有NCT03799913和NCT03916679等。最近，Rodriguez-Garcia等[35]還開發(fā)并評(píng)估了靶向苗勒氏抑制物質(zhì)2型受體(MISIIR)的CAR，他們發(fā)現(xiàn)這種CAR-T細(xì)胞在體外可表現(xiàn)出抗原特異性反應(yīng)，并溶解了一組患者來(lái)源的卵巢癌腫瘤標(biāo)本，在體內(nèi)消除了MISIIR過(guò)表達(dá)的腫瘤。除此之外，在卵巢癌中還測(cè)試了包括MUC16[36]、PSMA[37]和5T4[32]等多種腫瘤抗原用于CAR-T療法；其二，卵巢癌的主要轉(zhuǎn)移區(qū)為腹膜腔，所以可以仿照腹腔注射化療藥物，直接向有腹腔轉(zhuǎn)移的卵巢癌患者腹腔內(nèi)注射(IP)CAR-T細(xì)胞使得其與卵巢癌細(xì)胞直接接觸，很大程度避免了通過(guò)靜脈(Ⅳ)注射造成的T細(xì)胞浸潤(rùn)及歸巢問(wèn)題[8]。最近，John團(tuán)隊(duì)利用體內(nèi)卵巢癌模型發(fā)現(xiàn)局部腹腔注射TAG72-BBζCAR-T細(xì)胞可以消除抗原陽(yáng)性疾病并且延長(zhǎng)小鼠總生存期，而靜脈注射則對(duì)疾病的控制無(wú)效[38]。這也充分說(shuō)明CAR-T療法在卵巢癌中區(qū)別于其他實(shí)體瘤的優(yōu)勢(shì)。

4 卵巢癌中CAR-T細(xì)胞治療的挑戰(zhàn)

第一個(gè)不得不提的挑戰(zhàn)是其副作用—細(xì)胞因子釋放綜合征(CRS效應(yīng))，其是由T細(xì)胞活化和增殖引起的過(guò)繼性T細(xì)胞療法后可見(jiàn)的嚴(yán)重全身毒性，與C反應(yīng)蛋白、白細(xì)胞介素(IL)以及干擾素的循環(huán)水平升高有關(guān)。2017年Tanyi等[39]在一名患有復(fù)發(fā)性卵巢癌的患者中發(fā)現(xiàn)了一種新的現(xiàn)象--區(qū)室性CRS，她在用自體CART-meso治療過(guò)程中產(chǎn)生大量胸水，其中IL-6明顯增加，且胸膜腔內(nèi)CART-meso細(xì)胞水平明顯多于外周血液?？梢钥闯雎殉舶┥L(zhǎng)和擴(kuò)散的獨(dú)特性質(zhì)可導(dǎo)致對(duì)CAR-T療法的意外反應(yīng)。針對(duì)這一挑戰(zhàn)，研究者也在不斷做新的嘗試，最近一個(gè)研究團(tuán)隊(duì)利用共表達(dá)與腫瘤微環(huán)境中存在的趨化因子環(huán)境相匹配的受體可能使CAR-T療法更有效的原理設(shè)計(jì)了一個(gè)可增強(qiáng)IL-8反應(yīng)能力的CAR-T細(xì)胞，觀察發(fā)現(xiàn)，其可增強(qiáng)對(duì)腫瘤的控制，但并未發(fā)現(xiàn)明顯的CRS效應(yīng)，體重也無(wú)減輕[40]。

第二個(gè)挑戰(zhàn)是靶向非腫瘤毒性，主要是由于所選抗原在腫瘤細(xì)胞及少數(shù)正常細(xì)胞表面均表達(dá)，導(dǎo)致CAR-T細(xì)胞攻擊腫瘤細(xì)胞同時(shí)殃及正常細(xì)胞以致其損傷。目前已開發(fā)出可行的策略以使CAR-T細(xì)胞通過(guò)調(diào)節(jié)scFvs親和力區(qū)分腫瘤組織與正常組織[41]，降低scFvs親和力但保持表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)靶向CAR-T細(xì)胞的強(qiáng)大抗腫瘤功效可以消除或強(qiáng)烈抑制對(duì)正常組織的反應(yīng)性[42]。如基于組合分裂信號(hào)受體和順序作用受體概念設(shè)計(jì)的CAR-T細(xì)胞[43-44]。

同時(shí)，研究者們正在嘗試用CAR-T療法聯(lián)合其他治療方式解決這些問(wèn)題。北京一個(gè)研究小組利用血管破壞劑(VDA)和CAR-T細(xì)胞聯(lián)合，破壞或抑制腫瘤部位異常血管系統(tǒng)，增加血管通透性并進(jìn)一步促進(jìn)CAR-T細(xì)胞向腫瘤部位的浸潤(rùn)[45]。此外，還有研究者把薄膜鎳鈦合金(TFN)作為CAR-T細(xì)胞的傳遞和支持設(shè)備向患有卵巢癌的小鼠中植入，并發(fā)現(xiàn)植入后T細(xì)胞快速擴(kuò)增，與傳統(tǒng)T細(xì)胞注射相比，CAR-T細(xì)胞的密度峰值增加了232倍，并可將高密度的T細(xì)胞直接遞送至腫瘤部位，最大程度發(fā)揮療效[46]。此外例如聯(lián)合化療、PD1阻斷、嵌合受體疫苗等方法也在嘗試中[47-48]。

5 小結(jié)與展望

CAR-T療法已成為一種潛在的癌癥治療方法，在卵巢癌中也顯示出了它獨(dú)有的價(jià)值，越來(lái)越多的臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行以驗(yàn)證其在卵巢癌中的安全性和有效性。此外，CAR-T療法與其他方法聯(lián)合也是一種有前景的治療策略，如化學(xué)療法、免疫檢查點(diǎn)阻斷、細(xì)胞因子治療等。然而，這種新穎有效的方法還沒(méi)有廣泛應(yīng)用于卵巢癌患者是因?yàn)檫€存在許多挑戰(zhàn)和不足。因此，應(yīng)用CAR-T細(xì)胞療法治療包括卵巢癌在內(nèi)的實(shí)體瘤仍任重而道遠(yuǎn)。