魏榮華 孔雯雯 周茂德 王維唯

廣州白云山拜迪生物醫(yī)藥有限公司生產(chǎn)部，廣東廣州 511495

人粒細胞巨噬細胞刺激因子（Recombinant Human Granulocyte Macrophage Colony Stimulating Factor，rhGM-CSF）是由基因工程菌發(fā)酵表達產(chǎn)生，經(jīng)分離提純后，制成無菌制劑。rhGM-CSF 主要用于治療因放、化療引起的白細胞減少以及預防化療后中性粒細胞的減少癥等[1-4]，也可作用于皮膚損傷，促進皮膚損傷創(chuàng)面的愈合[5-6]。

rhGM-CSF 注射液的生產(chǎn)過濾工藝屬于關鍵工藝，濾器的選型及材質(zhì)直接影響最終藥品的關鍵質(zhì)量屬性。根據(jù)美國注射劑協(xié)會（PDA）技術報告26號[7]及我國藥品GMP 指南[8]對液體無菌過濾要求，及國內(nèi)學者對無菌過濾確認研究，整個過濾工藝的確認研究至少應包括：過濾器的選型；細菌截留實驗；完整性測試；過濾工藝模擬；吸附性測試；兼容性測試；可提取物分析等方面[9-16]。本研究將針對rhGM-CSF 注射液過濾工藝中采用的LAGL04TP6 濾器和MPGL 02G H2 濾器（兩種濾器濾膜材質(zhì)均為0.22 μm 親水性聚偏二氟乙烯），考察濾器（濾膜）與藥液的相互作用，對吸附性、可提取物、兼容性等影響項目進行確認研究。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

rhGM-CSF 藥液（批號：20160902，廣州白云山拜迪生物醫(yī)藥有限公司）；GVWP 過濾膜、MPGL 2GC A3濾器、MPGL 02G F2 濾器、Milli-Q 純水系統(tǒng)、自動化完整性測試儀integritestR4（默克密理博）；Agilent 1100 高效液相色譜儀（美國安捷倫科技有限公司）；Sievers 900便攜式TOC分析儀（GE公司）；Nicolet 560 ESP型傅里葉紅外分光亮度檢測儀（美國Nicolet公司）。

1.2 方法

1.2.1 活性藥物成分吸附試驗

根據(jù)產(chǎn)品實際過濾的工藝參數(shù)，按照47 mm GVWP 膜片的規(guī)格等比例縮小流程工藝參數(shù)（如體積、壓力），模擬吸附試驗工藝參數(shù)如表1。

表1 吸附試驗條件對照

采用3 批次過濾膜片（分別編為試驗A、B、C）和1 批次rhGM-CSF 藥液進行上述的模擬過濾吸附試驗，對未過濾藥液（過濾體積0 mL）、過濾體積5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、80、92 mL藥液進行連續(xù)取樣及所有濾出液的匯集濾液共15個樣點，測定藥液中活性成分rhGM-CSF 濃度。按公式：濃度（%）=（樣品濃度/未過濾藥液濃度）×100%計算，在此測試中，未過濾藥液濃度視為100%。

1.2.2 濾器可提取物試驗

根據(jù)默克Millipore 公司開發(fā)的模型溶劑方法來檢測可提取物，采用與實際工藝相同或更差條件進行，模型溶劑近似于實際藥液。模型溶劑的選擇與試驗條件選擇如表2～3。

表2 模擬溶劑選擇分析

表3 可提取物試驗條件對照

采用3 批次的過濾器按上述試驗條件進行可提取物試驗，對測試后的樣品進行不揮發(fā)物（NVR）、總有機碳（TOC）、反向高效液相色譜（reversed phasehigh performance liquid chromatography，RP-HPLC）測定，當提取溶液的RP-HPLC 色譜圖中出現(xiàn)峰高≥10 mAU 的色譜峰，而陰性樣品中沒有出現(xiàn)該峰，則將提取液用于傅里葉變換紅外光譜（Fourier trans form infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）分析、組件分析進行標準品研究，進一步鑒定具有紫外吸收的化合物。

1.2.3 濾器兼容性試驗

采取rhGM-CSF 藥液在除菌過濾生產(chǎn)中的最高溫度及最長過濾接觸時間等最差條件進行，包括膜片兼容性測試和過濾器兼容性測試，試驗條件如表4。

表4 兼容性試驗條件對照

1.2.3.1 膜片兼容性測試 初始膜片稱重后，用純水在室溫、10 psi 壓力下進行過濾測試，并記錄初始純水的流速，再測試初始純水的泡點值。之后用rhGMCSF 藥液進行循環(huán)過濾，過濾溫度26～34℃，膜片接觸藥液時間不短于1 h，之后測定產(chǎn)品泡點值，并觀察膜片是否有膨脹、變色、脫落等可觀察到的物理變化。膜片再用純水沖洗干凈，測定最終純水的泡點值。最后用純水在室溫、10 psi 壓力下進行測試，并記錄最終純水的流速，測試完成后，干燥膜片稱重。進行3次重復測試。按公式計算：泡點率=產(chǎn)品泡點值/初始純水的泡點值，預估的最低產(chǎn)品泡點值=標準流體最低泡點值×泡點率平均值。1.2.3.2 濾器兼容性測試 用rhGM-CSF 藥液進行循環(huán)過濾，過濾溫度26～34℃，接觸藥液時間不短于1 h，測定產(chǎn)品泡點值，并觀察過濾器是否有膨脹、變色、脫落等可觀察到的物理變化。產(chǎn)品的泡點值應大于預估的最低產(chǎn)品泡點率。

2 結(jié)果

2.1 吸附性試驗結(jié)果

活性藥物成分rhGM-CSF 過濾前后濃度測試結(jié)果見表5所示，未見明顯吸附性損失，在產(chǎn)品工藝可控范圍。

2.2 可提取物試驗結(jié)果

濾器的模型溶劑可提取物試驗，結(jié)果如表6所示，等比縮小后每個Millipak 20 過濾器可提取的NVR總量為0.5 mg，TOC 為0.3 mg。FTIR 和RP-HPLC 圖譜見圖1～2，分析鑒定的化合物為聚丙烯酸酯，為濾器的組成材料，經(jīng)EMD Millipore 公司按照塑料的USP 六級生物安全測試和USP 小鼠安全測試標準，該材料無生物毒性。

表5 吸附試驗樣點濃度

表6 NVR、TOC 的結(jié)果分析

圖1 水提取物殘留與實驗室標準品FTIR 光譜

圖2 陰性對照和可提取物RP-HPLC 圖譜

2.3 兼容性試驗結(jié)果

膜片兼容性測試膜片泡點結(jié)果、重量變化、流速變化見表7～9，根據(jù)膜片泡點試驗結(jié)果預估產(chǎn)品泡點最小值為46.4 psi，濾器兼容性測試中產(chǎn)品泡點值為48 psi，產(chǎn)品的泡點值大于預估的產(chǎn)品泡點最小值，且測試的膜片和濾器的外觀均無明顯變化，以上結(jié)果表明不存在兼容性問題。

3 討論

過濾工藝過程影響因素較多，在考察藥液和濾器的相互影響時，對關鍵工藝參數(shù)模擬接近生產(chǎn)或更差條件進行確認研究。吸附性試驗關注目標藥物成分被吸附的影響，采取縮小濾器規(guī)格，減少藥液使用量，模擬過濾前后活性成分的含量變化，吸附效應越小，成分含量變化越小。由于實際藥液中的成分會增加NVR、TOC、HPLC 等分析背景信號，從而很難準確檢測出微量的可提取物成分，選擇模擬溶劑可模擬實際藥液的提取能力。本研究模型溶劑是根據(jù)藥液溶劑為水相，藥液（pH 6.5～7.5）與Milli-Q 超純水（pH 6～8）相近，且超純水比注射用水中的有機化合物含量更低的原則進行選擇。在試驗濾器方面也選擇了放大，擴大過濾面積，盡可能富集模型溶劑的可提取物，便于檢測分析。濾器兼容性試驗主要考察過濾過程中藥液與濾膜是否發(fā)生物理化學反應，從而引起濾膜的性質(zhì)變化，采用單片濾膜測試，能更好地觀察和測試濾膜相關性質(zhì)。本研究結(jié)果提示，rhGM-CSF 注射液所采用的過濾器及濾膜材質(zhì)在吸附性、可提取物、兼容性方面均符合公司藥品的質(zhì)量要求，能夠為過濾工藝確認及評估提供一定的數(shù)據(jù)支持。

表7 膜片泡點的結(jié)果分析

表8 重量變化分析

表9 流速變化分析

本次研究由于模擬條件基于關鍵工藝參數(shù)選擇、驗證成本及檢測手段局限性等多方面的原因，與實際藥液的生產(chǎn)過濾條件仍存在差異。對于藥液無菌過濾工藝的確認，不僅僅需要確認藥液與濾器之間的相互影響，仍需證明過濾器在實際過濾條件下濾除微生物的能力，進一步在完成微生物挑戰(zhàn)、細菌截留試驗、完整性測試、產(chǎn)品實際生產(chǎn)過程的質(zhì)控監(jiān)測等一系列的控制手段，完整驗證無菌過濾工藝的有效性[17-18]，系統(tǒng)地為企業(yè)藥品過濾生產(chǎn)工作的開展提供科學依據(jù)。