王建業(yè)，唐寧，呂丹

玻璃化冷凍是生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用最廣也是最為普遍的冷凍方式，它廣泛應(yīng)用于卵裂期胚胎、囊胚期胚胎、卵母細(xì)胞，甚至是精子的冷凍[1-5]，極大地提高了冷凍胚胎移植(frozen embryo transfer, FET )周期患者的胚胎復(fù)蘇率和患者的累計(jì)妊娠率[6-7]，保障了FET周期患者成功率，減少了患者并發(fā)癥，也進(jìn)一步降低了不孕不育患者治療的總費(fèi)用。但早期不孕不育患者在接受體外受精-胚胎移植(in vitro fertilization-embryo transfer，IVF-ET)治療時(shí)多采用程序化的冷凍方式，對(duì)于這部分胚胎如果按照標(biāo)準(zhǔn)的慢速解凍(slow thawing, ST)方式進(jìn)行操作，解凍后胚胎有較高的卵裂球壞死率，胚胎利用率相對(duì)較低；按照玻璃化解凍(vitrificative thawing, VT)方式解凍玻璃化冷凍的胚胎，解凍后胚胎存活率高，胚胎利用率也相對(duì)較高[8-9]。但是否能用VT方式解凍程序化冷凍的胚胎，目前還在探討之中。本研究將比較VT和ST對(duì)程序化冷凍胚胎的影響，以期為程序化冷凍胚胎尋求更好的解凍方案。

1 資料與方法

1.1 一般資料

研究對(duì)象為2016年1月至2018年12月解放軍第九六〇醫(yī)院生殖中心接受IVF-ET技術(shù)進(jìn)行助孕治療的胚胎解凍移植患者。使用隨機(jī)數(shù)生成軟件產(chǎn)生隨機(jī)分組數(shù)值，患者按照就診先后順序所對(duì)應(yīng)的隨機(jī)數(shù)分為VT組(200例，解凍液使用日本加藤的玻璃化解凍液)和ST組(200例，解凍液使用Quinn’s的慢速解凍液)。兩組患者夫婦的胚胎在冷凍時(shí)均為程序化冷凍方式。納入研究的患者年齡<37歲，不孕原因?yàn)檩斅压芤蛩?，超促排卵方案為短方案。所有患者均按照醫(yī)院生殖倫理委員會(huì)要求，每一步操作都簽訂相應(yīng)的知情同意書。

1.2 方法

使用本中心常規(guī)方法，但略有改進(jìn)[10]，具體如下。

1.2.1 超促排卵 采用本生殖中心常規(guī)超促排卵方案，當(dāng)主導(dǎo)卵泡直徑達(dá)18 mm時(shí)，肌內(nèi)注射人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，hCG)5 000～10 000 U。

1.2.2 取卵、受精和胚胎觀察 hCG注射后36 h在超聲引導(dǎo)下經(jīng)陰道取卵，取卵后3～5 h行體外受精(in vitro fertilization，IVF)，19～20 h觀察受精情況，6～7 h行卵胞漿內(nèi)單精子注射( intracytoplasmic sperm injection，ICSI)，17～18 h觀察受精情況。授精后68～70 h觀察胚胎卵裂球和碎片數(shù)量，并以此判定卵裂期胚胎的級(jí)別。① Ⅰ級(jí)胚胎：卵裂球大小均勻，胞漿碎片<10% ；② Ⅱ級(jí)胚胎：卵裂球大小略不均勻，胞漿碎片<15% ；③ Ⅲ級(jí)胚胎：胞漿碎片<50%，卵裂球情況類似于Ⅱ級(jí)胚胎；④ Ⅳ級(jí)胚胎：胞漿碎片>50%。胚胎達(dá)6細(xì)胞以下，胚胎評(píng)級(jí)降低一個(gè)級(jí)別。解凍后胚胎有卵裂球死亡，胚胎評(píng)級(jí)降低一個(gè)級(jí)別。Ⅰ級(jí)和Ⅱ級(jí)胚胎為優(yōu)質(zhì)胚胎。Ⅰ～Ⅲ級(jí)胚胎為可用胚胎。兩組胚胎均在Labotect C 200培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。所有洗精和受精用培養(yǎng)液均使用Vitro Life產(chǎn)品。

1.2.3 所有解凍移植胚胎均使用程序化冷凍方法。

1.2.4 移植日測定患者子宮內(nèi)膜厚度，低于10 mm不予移植，不計(jì)入本研究統(tǒng)計(jì)范圍。

1.3 觀察指標(biāo)

① 比較兩組患者最初進(jìn)入IVF-ET周期時(shí)的基本情況，包括年齡、不孕年限、獲卵數(shù)、促性腺激素(gonadotropins，Gn)用量和基礎(chǔ)促卵泡成熟激素(follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH)值；② 比較兩組患者最初進(jìn)入IVF-ET周期時(shí)胚胎發(fā)育情況，包括MⅡ卵率、受精率、卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、可用胚胎率和冷凍胚胎率；③ 比較兩組患者胚胎復(fù)蘇情況，包括胚胎復(fù)蘇完整率和復(fù)蘇可用率；④ 比較兩組患者胚胎移植情況和臨床妊娠結(jié)局，包括胚胎移植日移植次數(shù)、移植胚胎數(shù)、內(nèi)膜厚度和臨床妊娠結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 患者基本情況

所有患者均曾在中心接受IVF助孕。最近一次IVF周期檢查顯示：兩組患者年齡、不孕年限、獲卵數(shù)、Gn用量和基礎(chǔ)FSH值差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，詳見下頁表1。

2.2 胚胎發(fā)育情況

最近一次IVF周期胚胎發(fā)育情況顯示：兩組患者M(jìn)Ⅱ卵率、受精率、卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、可用胚胎率和冷凍胚胎率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，詳見表2。

2.3 胚胎復(fù)蘇情況

VT組患者胚胎復(fù)蘇完整率和復(fù)蘇可用率明顯高于ST組，兩組差異均有非常顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，詳見表3。

2.4 胚胎移植及妊娠結(jié)局

胚胎移植日，兩組患者移植次數(shù)、移植胚胎個(gè)數(shù)和子宮內(nèi)膜厚度、移植后兩組患者臨床妊娠率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，詳見78頁表4。

3 討論

自1978年第1例試管嬰兒誕生以來，越來越多不孕不育患者受益于輔助生殖技術(shù)。在眾多的輔助生殖技術(shù)中，冷凍和解凍技術(shù)是最重要的技術(shù)之一，最常用的冷凍和解凍方法包括程序化冷凍與ST及玻璃化冷凍與VT。程序化冷凍是最早使用的冷凍方法，采用“植冰”方式防止細(xì)胞內(nèi)冰晶形成，使用麥管作為冷凍載體，程序化降溫方式；玻璃化冷凍是后來使用的冷凍方法，采用高濃度冷凍保護(hù)劑，在極速降溫中形成玻璃態(tài)方式防止細(xì)胞內(nèi)冰晶形成，使用冷凍環(huán)、冷凍鉤或者冷凍片作為冷凍載體，急速降溫方式。ST使用冷凍保護(hù)劑梯度遞降的方式置換細(xì)胞內(nèi)外液體，避免解凍時(shí)的冰晶損傷；VT同樣使用冷凍保護(hù)劑梯度遞降的方式置換細(xì)胞內(nèi)外液體，避免解凍時(shí)的冰晶損傷。現(xiàn)在多數(shù)學(xué)者和臨床胚胎學(xué)家認(rèn)為，玻璃化冷凍更適合胚胎的冷凍保存，玻璃化冷凍和解凍應(yīng)該全面代替程序化冷凍和ST[11-12]。只是兩種解凍方式使用的冷凍保護(hù)劑有所不同。這為我們使用VT方式代替ST方式，解凍程序化冷凍的胚胎，提供了一定的理論基礎(chǔ)。

本研究中，所有進(jìn)入冷凍周期的患者都是最近接受IVF周期并有冷凍胚胎，隨機(jī)數(shù)分配形成VT組和ST組。兩組患者在年齡、不孕年限、獲卵數(shù)、Gn用量和基礎(chǔ)FSH值方面沒有差異，有共同的比較基礎(chǔ)。進(jìn)一步的胚胎發(fā)育比較顯示MⅡ卵率、受精率、卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、可用胚胎率和冷凍胚胎率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而在影響冷凍和解凍的因素中，胚胎質(zhì)量和數(shù)量非常重要，胚胎發(fā)育的一致性使得兩組在比較解凍方法對(duì)冷凍效果的影響上有了較好的共同基礎(chǔ)，增加了比較的可行度。解凍結(jié)果顯示VT組患者胚胎復(fù)蘇完整率和復(fù)蘇可用率明顯高于ST組，這表明了VT能達(dá)到比ST較好的解凍結(jié)果，這也意味著解凍同樣數(shù)量的冷凍胚胎，經(jīng)過VT可以獲得更多的優(yōu)質(zhì)胚胎和可用胚胎用于胚胎移植。在實(shí)際的臨床實(shí)踐中，我們總是盡可能的保證在一次移植時(shí)有兩個(gè)優(yōu)質(zhì)胚胎，因此使用慢速冷凍意味著要解凍更多的胚胎。本研究中VT組解凍了523個(gè)胚胎，而ST組則解凍了603個(gè)胚胎。80個(gè)胚胎可能來自ST組解凍后的不可用胚胎，也可能來自復(fù)蘇后的多余可用胚胎。這表明ST不僅會(huì)造成更多的胚胎壞死，而且考慮到隨后的胚胎移植，還會(huì)造成更多的胚胎浪費(fèi)。由于兩組患者的移植次數(shù)、移植胚胎個(gè)數(shù)和子宮內(nèi)膜厚度沒有差異，移植后的臨床妊娠率也沒有差異，但VT組移植胚胎數(shù)(2.13±0.26)還是略低于ST組(2.48±0.42)，而VT組臨床妊娠率(55.0%)卻略高于ST組(53.5%)，這表明VT比ST對(duì)臨床妊娠結(jié)果有一定提高，雖然這種提高并沒有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 患者基本情況

表2 胚胎發(fā)育情況(%)

表3 胚胎復(fù)蘇情況(%)

總之，對(duì)于程序化冷凍的胚胎，VT比ST提升解凍效果明顯，能夠更好地提高冷凍胚胎的利用率，進(jìn)而提高不孕不育患者的累計(jì)妊娠率，降低患者的妊娠花費(fèi)，是相對(duì)較好的胚胎解凍方法。但由于本研究樣本量有限，加之缺乏相關(guān)機(jī)理的深入探討，對(duì)玻璃化方法解凍程序化冷凍胚胎的研究還需要深一步探究。

表4 胚胎移植及妊娠結(jié)局