孫艷艷,劉寶乾,劉建飛,魏鑒騰*,邸多隆*

(1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；2.中國科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所 中國科學(xué)院西北特色 植物資源化學(xué)重點實驗室和甘肅省天然藥物重點實驗室，甘肅 蘭州 730000)

多糖是中藥中重要的一類有效成分，在免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗病毒、抗衰老、抗腫瘤、降血糖、降血脂等[1]方面展示出顯著而獨特的生理、藥理活性，已成為中藥研究的重要方向之一。多糖的分離純化是開展多糖研究與開發(fā)的重要基礎(chǔ)，目前用于大分子分離純化的色譜填料和層析介質(zhì)主要是天然多糖類和高分子聚合物類?；谖胶徒馕椒蛛x純化機制的大孔吸附樹脂(Macroporous adsorption resin,MAR)是一類重要的高分子聚合物分離材料，已在分離純化中藥中小分子有效成分方面取得重要進展，但在分離純化中藥多糖方面尚處于起步階段。近年來，MAR在多糖分離中的研究與應(yīng)用逐漸引起國內(nèi)外研究者的關(guān)注。

MAR是一種不含交換基團、具有孔結(jié)構(gòu)的有機高聚物，具有不溶于酸、堿及各種有機溶劑，比表面積大、吸附容量大、選擇性好、吸附速度快、解吸條件溫和、再生處理方便、使用周期長、節(jié)省費用等諸多優(yōu)點[2-4]。孫偉等[5]采用MAR技術(shù)富集純化桑白皮中的多糖成分，桑白皮多糖的純度提高了4.6倍，為桑白皮多糖的工業(yè)化生產(chǎn)提供了技術(shù)參考。Yang等[6]采用MAR技術(shù)分離純化南瓜渣中的多糖成分，色素和蛋白質(zhì)的吸附率分別為84.3%和75.9%，多糖的回收率為84.7%，為高效利用南瓜多糖資源提供了理論依據(jù)。Hu等[7]采用MAR技術(shù)和DEAE-52纖維素聯(lián)用技術(shù)從苔草中分離出單一的酸性多糖和中性多糖。Liang等[8]利用AB-8樹脂、Sephadex G75凝膠和Sephadex G200凝膠聯(lián)用技術(shù)從石斛中分離純化出2種單一多糖，并表征了多糖的結(jié)構(gòu)特征。MAR技術(shù)由于其獨特的吸附性質(zhì)和物理化學(xué)性質(zhì)，已在分離純化中藥有效成分方面被廣泛應(yīng)用，但由于在MAR與目標分子的構(gòu)效關(guān)系及其分離規(guī)律的基礎(chǔ)研究方面比較薄弱，導(dǎo)致無法在理論指導(dǎo)下進行MAR精準選擇。面對種類繁多的MAR，在預(yù)測和篩選對多糖具有最佳分離效能的MAR時，工作量巨大，且往往出現(xiàn)漏篩、誤篩。

R語言由Robert Gentleman和Ross Ihaka在20世紀90年代開發(fā)而來，其作為一種開源軟件，帶有豐富的工具包[9]，因統(tǒng)計與計算功能全面而深受國內(nèi)外研究者的青睞，已廣泛應(yīng)用于經(jīng)濟學(xué)、醫(yī)學(xué)、地球科學(xué)及農(nóng)學(xué)等研究領(lǐng)域的數(shù)據(jù)挖掘分析[10-11]。本研究采用R語言構(gòu)建MAR參數(shù)(如孔隙率、比表面積、孔容、孔徑)、葡聚糖與吸附量之間的多源信息模型，利用多源信息模型預(yù)測和篩選對不同分子量多糖具有最佳吸附性能的MAR，以期為中藥多糖的分離純化提供理論支撐。經(jīng)文獻檢索，未見相同文獻報道。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Agilent 1260液相色譜儀(美國Agilent Technologies)，包括：G1312A恒流泵、2200蒸發(fā)光檢測器、G1328B手動進樣器和Agilent Chemstation software工作站；TSKgel G3000PWxl色譜柱(7.8 mm i.d.×30 cm，7 μm)；KQ-250DE型數(shù)控超聲清洗機(昆山超聲儀器有限公司)；BSA224S-CW型萬分之一電子分析天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；DHG-9140A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、THZ-320臺式恒溫振蕩器(上海精宏實驗設(shè)備有限公司)。

無水乙醇(分析純，利安隆博華醫(yī)藥化學(xué)有限公司)；純凈水(杭州娃哈哈集團有限公司)；葡聚糖系列對照品(分子量分別為1 000、5 000、10 000、40 000和100 000，上海麥克林生化科技有限公司)；枸杞多糖(由中科院蘭州化學(xué)物理研究所中科院西北特色植物資源化學(xué)重點實驗室制備、提供)；LX-1180、LX-20、LX-T81、LX-T19和D101型(西安藍曉科技新材料股份有限公司)，主要性能參數(shù)(由西安藍曉科技新材料股份有限公司提供)見表1。

表1 MAR的主要性能參數(shù)Table 1 Main performance parameters of MAR

1.2 對照品溶液的制備

分別稱取不同規(guī)格的葡聚糖對照品(分子量為1 000、5 000、10 000、40 000和100 000)40 mg，加水溶解并定容至10 mL，搖勻，即得質(zhì)量濃度為4 mg·mL-1的系列對照品儲備溶液，備用。

1.3 色譜條件

TSKgel G3000PWxl色譜柱(7.8 mm i.d.×30 cm，7 μm)；流動相：100%水；流速：1 mL·min-1；檢測器：蒸發(fā)光檢測器；檢測溫度：80 ℃；進樣量：20 μL。

1.4 方法學(xué)考察

1.4.1 線性關(guān)系分別稱取不同規(guī)格的葡聚糖對照品(分子量為1 000、5 000、10 000、40 000和100 000)80 mg，加水溶解并定容至10 mL，即得質(zhì)量濃度為8 mg·mL-1的對照品儲備液，各加水稀釋制備成0.125、0.25、0.5、1、2、4、8 mg·mL-1的葡聚糖對照品溶液，按照“1.3”色譜條件進行測定。以不同分子量葡聚糖的質(zhì)量濃度為橫坐標(x)，峰面積為縱坐標(y)繪制標準曲線，得到上述5種葡聚糖的回歸方程和線性范圍(見表2)。由表2可知，同一種分子量的葡聚糖在0.125～8 mg·mL-1范圍內(nèi)，峰面積與葡聚糖的質(zhì)量濃度呈線性關(guān)系。

表2 不同分子量葡聚糖的回歸方程及線性范圍Table 2 Regression equations and linear ranges of different molecular weight glucans

1.4.2 精密度實驗取“1.2”制備的對照品溶液，按照“1.3”色譜條件測定多糖，重復(fù)進樣6次，色譜峰面積的相對標準偏差(RSD)為0.95%～4.1%，表明儀器精密度良好。

表3 MAR靜態(tài)吸附實驗結(jié)果Table 3 Experimental results of MAR static adsorption

1.4.3 穩(wěn)定性實驗取“1.2”制備的對照品溶液，按照“1.3”色譜條件分別于0、3、6、9、12、24 h進樣檢測，色譜峰面積的RSD為3.2%～4.8%，表明不同分子量的葡聚糖溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

1.4.4 重復(fù)性實驗精密稱取不同分子量的葡聚糖40 mg各6份，按照“1.2”方法制備樣品溶液6份，按照“1.3”色譜條件測定多糖，色譜峰面積的RSD為3.1%～4.8%，表明方法重復(fù)性良好。

1.5 吸附實驗

1.5.1 靜態(tài)吸附實驗稱取5種MAR(LX-1180、LX-20、LX-T81、LX-T19和D101) 各0.5 g，分別置于具塞錐形瓶中，加入4 mg·mL-1的多糖溶液40 mL，于30 ℃下恒溫振蕩吸附24 h后，測定濾液中的多糖，按公式(1)計算吸附量[12-14]。

(1)

式中，Q為吸附量(mg·g-1)，C0為吸附前多糖的質(zhì)量濃度(mg·mL-1)，C1為吸附殘液中多糖的質(zhì)量濃度(mg·mL-1)，V1為提取液體積(mL)，W為樹脂質(zhì)量(g)。按照上式計算得到5種MAR對不同分子量葡聚糖的吸附量見表3。

1.5.2 吸附預(yù)測模型建立采用“1.5.1”靜態(tài)吸附實驗數(shù)據(jù)，以葡聚糖的分子量/孔隙率、分子量/比表面積、分子量/孔容、分子量/孔徑為自變量參數(shù)，吸附量為因變量參數(shù)，利用Rstudio軟件建立回歸預(yù)測模型，并進行擬合性檢驗。

2 結(jié)果與討論

2.1 葡聚糖含量的測定

葡聚糖含量的測定方法多采用比色法[15-16]。本研究建立了高效液相色譜(HPLC)測定葡聚糖含量的方法，經(jīng)“1.4”方法學(xué)考察，表明該方法準確、可靠。不同分子量葡聚糖的HPLC色譜圖見圖1，可知分子量為1 000、5 000、10 000、40 000和100 000葡聚糖在色譜中的保留時間分別為9.68、8.78、8.49、7.52、6.73 min，說明葡聚糖分子量越小，越容易進入色譜填料的孔道，洗脫時所經(jīng)過的路徑越長，保留時間較長。不同分子量葡聚糖保留時間的規(guī)律符合凝膠色譜分離機理。

2.2 MAR主要性能參數(shù)與吸附量的相關(guān)性分析

影響多糖吸附效果的因素主要包括多糖分子量和MAR的孔隙率、比表面積、孔容、孔徑，分別考察了分子量/孔隙率、分子量/比表面積、分子量/孔容、分子量/孔徑對多糖吸附量的影響。如圖2所示，隨著上述4種比值的不斷增加，不同MAR對葡聚糖的吸附量均表現(xiàn)為先增加后降低。推測是由于隨著分子量的增加，葡聚糖無法進入MAR內(nèi)部，導(dǎo)致吸附量下降。

2.3 多源信息融合預(yù)測模型的建立

2.3.1 數(shù)據(jù)處理分子量/孔隙率、分子量/比表面積、分子量/孔容、分子量/孔徑和吸附量結(jié)果見表4。對采集的數(shù)據(jù)取自然對數(shù)，其特點歸納如下：數(shù)據(jù)集包含25組數(shù)據(jù)，每組數(shù)據(jù)包括4個自變量和1個因變量，其中因變量“吸附量”受其他4個自變量的影響。

2.3.2 模型架構(gòu)中藥多糖具有修復(fù)肝損傷、降血糖、抗凝血、抗腫瘤、抗氧化、抗病毒和免疫調(diào)節(jié)等多種生物活性，不同分子量范圍的多糖，生物活性有所差異[17]。本研究以25組數(shù)據(jù)中的變量為基礎(chǔ)，通過考察因變量受不同自變量之間的交互作用，構(gòu)建MAR吸附多糖的多源信息融合模型。利用該模型預(yù)測MAR對中藥多糖的吸附作用，可避免多糖分離過程中樹脂選擇的盲目性。

表4 MAR數(shù)據(jù)分析Table 4 Data analysis of macroporous adsorption resin

2.3.3 訓(xùn)練集與測試集劃分利用Rstudio軟件，采取隨機不放回抽樣模式，從25組數(shù)據(jù)中依次抽取17、18、19、20、21、22、23、24組數(shù)據(jù)作為訓(xùn)練集建立模型，其余數(shù)據(jù)作為測試集進行驗證。隨機重復(fù)25次，計算不同模型的r2和均方根誤差(RMSE)(圖3)。綜合考慮r2和RMSE值，選取23組數(shù)據(jù)作為訓(xùn)練集所建立的模型擬合度和預(yù)測能力較好。

2.3.4 利用訓(xùn)練集建立模型利用Rstudio軟件，采取隨機不放回抽樣模式，從25組數(shù)據(jù)中抽取23組數(shù)據(jù)作為訓(xùn)練集建立模型，依次重復(fù)20次，計算每次模型的擬合方程參數(shù)(見表5)。綜合考慮P值和r2，選擇表5中序號6的擬合方程作為預(yù)測模型方程(式2)，其r2為0.901 2,P值為0.000 782，RMSE為19.89。

Y=5.94X1-25.15X2+6.93X3+17.91X4+5.03X1X2-23.13X1X3+25.68X2X3+8.81X1X4-15.55X2X4+11.1X3X4-18.89X1X2X3+1.97X1X2X4-10.93X1X3X4+14.23X2X3X4-6.96X1X2X3X4-8.04(r2=0.901 2)

(2)

式中，Y為MAR對多糖的吸附量(mg·g-1);X1、X2、X3、X4分別為多糖分子量與MAR孔隙率、比表面積、孔容和孔徑的比值，并取自然對數(shù)。

表5 模型方程的參數(shù)Table 5 Parameters of model equation

2.3.5 利用測試集驗證模型利用Rstudio軟件以2組測試集數(shù)據(jù)對上述預(yù)測模型進行驗證，模型預(yù)測吸附量分別為36、97.3 mg·g-1，RMSE值為19.89，測試集的吸附量數(shù)據(jù)分別為7.85、96.85 mg·g-1，表明模型預(yù)測效果準確。

2.3.6 模型驗證實驗枸杞多糖是枸杞中發(fā)揮功效的主要物質(zhì)基礎(chǔ)之一[18]。枸杞多糖LBP-009是本實驗室篩選出具有修復(fù)和預(yù)防藥物性肝損傷的枸杞多糖部位，根據(jù)枸杞多糖LBP-009的分子量，利用多源信息模型預(yù)測MAR對枸杞多糖的吸附效果。結(jié)果表明，LX-T19、LX-T81、LX-20、LX-1180和D101型樹脂對枸杞多糖的吸附量分別為114.13、112.03、117.40、98.27、72.18 mg·g-1，其中吸附效果最好的MAR為LX-20。利用MAR靜態(tài)吸附實驗進行驗證，發(fā)現(xiàn)LX-20型MAR對枸杞多糖LBP-009的吸附量為111.23 mg·g-1，其結(jié)果與預(yù)測值基本吻合。由此可見，利用Rstudio軟件建立的多源信息融合模型是準確可靠的。

3 結(jié) 論

本研究以葡聚糖分子量與MAR的孔隙率、比表面積、孔容、孔徑比值為變量函數(shù)，利用Rstudio軟件構(gòu)建MAR對中藥多糖吸附量的多源信息預(yù)測模型，實現(xiàn)了從種類繁多的MAR中快速預(yù)測和篩選對多糖具有最佳分離效能的MAR。模型驗證實驗表明，所建立的預(yù)測模型準確性較高，可快速預(yù)測和篩選對中藥多糖具有最佳吸附效果的MAR類型，顯著地提高了工作效率，為MAR分離純化中藥多糖的研究提供了新思路。但該預(yù)測模型也存在一定的局限性：首先，本研究使用的目標分子和MAR樣本量較少，可能造成預(yù)測模型的偏差。其次，本研究采集數(shù)據(jù)時，只考慮MAR對中藥多糖的靜態(tài)吸附實驗，未結(jié)合靜態(tài)解吸附實驗和動態(tài)吸附/解吸附實驗結(jié)果，可能導(dǎo)致預(yù)測模型的局限性。同時，MAR分離多糖的影響因素十分復(fù)雜，本文考察的影響因素還不夠全面。