郭舒臣，鄭玉忠，郭 瑞，曾鑫海，梁惠芬，陳奕東，楊應(yīng)楷， 董婷霞,2，王懷友，詹華強(qiáng),2*

(1.深圳市可食用及藥用資源研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 香港科技大學(xué)深圳研究院，廣東 深圳 518057；2.香港科技大學(xué) 生命科學(xué)部暨中藥研發(fā)中心，香港 999077；3.中國(guó)藥科大學(xué) 中藥學(xué)院，江蘇 南京 211198；4.韓山師范學(xué)院 食品工程與生物科技學(xué)院，廣東 潮州 521041；5.廣東濟(jì)公保健食品有限公司，廣東 潮安 515638)

老香黃(也稱老香櫞、佛手香黃)是嶺南特有的保健和藥用制品，具有增進(jìn)食欲、理氣化痰的功效，可治胃痛、腹脹、嘔吐、嗝噎、痰多咳喘等病癥[1]。它是由蕓香科植物佛手(CitrusmedicaL.var.sarcodactylisSwingle)的果實(shí)炮制而成。佛手是我國(guó)傳統(tǒng)的“藥食兩用”中藥之一[2]，但本身味道苦澀辛辣，不宜直接食用，故嶺南地區(qū)的潮汕鄉(xiāng)民以佛手(也稱香櫞)為原料，經(jīng)過(guò)鹽腌、曬干、炊熟、浸中藥份液、九蒸九曬，腌制成色黑如漆、口感綿軟的老香黃，同時(shí)可以久藏不壞，又可以保存藥效[3]。佛手的主要化學(xué)成分有揮發(fā)油類、黃酮類、香豆素類、多糖、氨基酸和無(wú)機(jī)鹽等多種生理活性物質(zhì)[4]，在抗氧化、抗炎[5]、調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤、降糖、降脂、改善胰島素抵抗方面發(fā)揮著重要的作用[6]。但是目前老香黃多以作坊制作為主，在腌制過(guò)程中，工序較為復(fù)雜，且無(wú)標(biāo)準(zhǔn)的制備方法，導(dǎo)致老香黃成品在化學(xué)成分、組成及含量上差異很大，直接影響了老香黃的質(zhì)量。市場(chǎng)上不同貯藏年份的老香黃，具有功能和品質(zhì)上的差異[7]。迄今為止，老香黃缺少有效可靠的質(zhì)量控制及其品質(zhì)鑒定方法，而建立老香黃的質(zhì)量評(píng)價(jià)體系，找到差異性化學(xué)標(biāo)志物去判別不同年份的老香黃成為難點(diǎn)。

目前針對(duì)老香黃的成分分析，僅有運(yùn)用高效液相色譜(HPLC)對(duì)2個(gè)指標(biāo)成分進(jìn)行定量分析的報(bào)道[8]。隨著液相色譜-質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的高速發(fā)展，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)因具有快速、分離度好、靈敏度高的特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于多種物質(zhì)的同時(shí)測(cè)定[9-10]。本研究以原料佛手中的化學(xué)成分為基準(zhǔn)，通過(guò)文獻(xiàn)篩選了21個(gè)具有代表性的化學(xué)質(zhì)量標(biāo)志物[11-12]，采用UPLC-MS/MS方法對(duì)老香黃中的化學(xué)標(biāo)志物進(jìn)行快速定性與定量分析。

為了有效快速篩選中藥化學(xué)標(biāo)志物，常常采用化學(xué)模式識(shí)別技術(shù)，該技術(shù)在中藥鑒別、定性表征、質(zhì)量控制、組效關(guān)系等研究中均有廣泛應(yīng)用[13]，包括主成分分析(Principal component analysis,PCA)、聚類分析(Hierarchical cluster analysis,HCA)、正交偏最小二乘法判別分析(Orthogonal partial least squares discriminant analysis,OPLS-DA)的分析方法[14]。本研究基于老香黃中各化學(xué)標(biāo)志物的含量結(jié)合上述模式識(shí)別方法區(qū)別不同年份的老香黃，篩選出差異性化學(xué)標(biāo)志物，并進(jìn)一步采用盲樣適用性能力測(cè)試結(jié)果。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

VGT-2227QTD型數(shù)碼超聲波清洗機(jī)(廣東固特超聲股份有限公司)；BSA2245型電子天平(萬(wàn)分之一，德國(guó)賽多利斯公司)；Milli-QB型超純水凈化系統(tǒng)(美國(guó)Millipore公司)；A-30型超高效液相色譜-Q-sight型三重四極桿質(zhì)譜儀(珀金埃爾默儀器有限公司)；SAB 225i型電子天平(十萬(wàn)分之一，英國(guó)ADAM衡器公司)；GL-16G-II 離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)。

從廣東濟(jì)公保健食品有限公司收集不同年份(7個(gè)年份)的老香黃，包括0年(即老香黃半成品,LXH0_1～6)、3年(儲(chǔ)藏3年的老香黃,LXH3_1～6)、5年(LXH5_1～6)、8年(LXH8_1～6)、10年(LXH10_1～6)、15年(LXH15_1～6)、20年(LXH20_1～6)，每個(gè)樣品各6批；同時(shí)收集不同廠家、不同年份測(cè)定用盲樣(Proficiency test，PT)共9批，編號(hào)PT_1～PT_9，所有樣品均保存于香港科技大學(xué)深圳研究院。21種對(duì)照品均由四川省維克奇生物科技有限公司提供，其純度均超過(guò)98%，具體的對(duì)照品信息見表1。

表1 21種對(duì)照品的采購(gòu)信息Table 1 Commercial informations of 21 kinds of reference substances

1.2 溶液的制備

1.2.1 對(duì)照品溶液及其內(nèi)標(biāo)溶液的制備分別精密稱定21種候選化學(xué)標(biāo)志物適量，置于10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度。搖勻，制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的對(duì)照品單標(biāo)溶液，各取適量溶液，混合成23.80 μg/mL的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。另取10 mg山柰酚-3-O-蕓香糖苷置于容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，配制成1 mg/mL的儲(chǔ)備液，最終稀釋成5 μg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備將對(duì)照品混標(biāo)溶液用甲醇稀釋成質(zhì)量濃度分別為0.05、0.09、0.18、0.37、0.74、1.47、2.95、5.95、11.90、23.80 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.3 老香黃供試品溶液的制備準(zhǔn)確稱取不同年份各6批老香黃樣品1.00 g，剪碎，置于50 mL具塞錐形瓶中，精密吸取20 mL超純水，稱定重量，浸泡24 h過(guò)夜，80 ℃超聲 2 h(500 W，40 kHz)，放冷，用超純水補(bǔ)足減失的重量，過(guò)濾并收集續(xù)濾液；所剩殘?jiān)赐瑯臃椒ㄔ偬崛?次，合并濾液，12 000 r/min高速離心，4 ℃保存，待分析。

1.3 樣品的分析條件

1.3.1 色譜條件色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×50 mm,1.7 μm)；柱溫：30 ℃；流動(dòng)相：0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B)；梯度洗脫程序：0～2 min，95%～85% A；2～6 min，85% A；6～10 min，85%～47% A；10～12 min，47%～5% A；12～14 min，5%～95% A；14～17 min，95% A；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣量：1 μL。

1.3.2 質(zhì)譜條件離子源檢測(cè)模式：ESI+-多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)；毛細(xì)管電壓(Electrospray voltage)：5 500 V；干燥氣流速：100 L/min；質(zhì)譜接口溫度(HSID temp)：280 ℃；霧化氣流速：120 L/min；離子源溫度(Source temp)：450 ℃；待測(cè)成分的MRM質(zhì)譜分析參數(shù)見表2。

2 結(jié)果與討論

2.1 化學(xué)標(biāo)志物的選擇

參考佛手中化學(xué)成分研究的相關(guān)文獻(xiàn)[8-10]，篩選出報(bào)道較多或含量較高的21個(gè)化合物作為候選化學(xué)標(biāo)志物，其中包括異莨菪亭、東莨菪內(nèi)酯、6,7-二甲氧基香豆素、5,7-二甲氧基香豆素、水合氧化前胡素、檸檬苦素、諾米林、佛手柑內(nèi)酯、香葉木素、金圣草素、圣草次苷、7-甲氧基香豆素、野漆樹苷、蘆丁、橙皮苷、新橙皮苷、甲基橙皮苷、香葉木苷、黃柏酮、7-羥基香豆素、山柰酚。

表2 待測(cè)化學(xué)標(biāo)志物的質(zhì)譜分析參數(shù)Table 2 MS parameters of chemical markers for test

圖1 各化學(xué)標(biāo)志物的MRM疊加色譜圖Fig.1 MRM overlay chromatograms of chemical markers the peak numbers denoted were the same as those inTable 1; A：blank methanol；B：mix standard(23.80 μg/mL)； C：Lao-Xiang-Huang(LXH0_1)

2.2 方法學(xué)

2.2.1 成分檢定及其專屬性精密吸取 “1.2.1”混合對(duì)照品溶液(23.80 μg/mL)、供試品溶液(LXH0_1)100 μL，加入100 μL內(nèi)標(biāo)，混勻，另取空白甲醇200 μL，按“1.3”條件進(jìn)行分析，各化學(xué)標(biāo)志物的MRM色譜圖見圖1?；旌系?1個(gè)化合物峰及其內(nèi)標(biāo)峰均得到很好的分離，且無(wú)雜峰干擾、峰形良好、基線平穩(wěn)。在供試品溶液中除內(nèi)標(biāo)外，共檢出15個(gè)化學(xué)標(biāo)志物，并作為有關(guān)樣品質(zhì)量的方法學(xué)考察指標(biāo)。

2.2.2 線性關(guān)系、定量下限及檢出限精密吸取“1.2.2”制備的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液各100 μL，加入100 μL內(nèi)標(biāo)，混勻，按“1.3”條件進(jìn)行分析，以對(duì)照品系列工作液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)，對(duì)照品和內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為縱坐標(biāo)(y)，得到21個(gè)化學(xué)標(biāo)志物的標(biāo)準(zhǔn)曲線(見表3)。結(jié)果表明，該方法在0.09～23.80 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.990。以信噪比(S/N)約為10計(jì)算各成分的定量下限(LOQ)，以S/N≈3計(jì)算各成分的檢出限(LOD)，測(cè)得21種化學(xué)標(biāo)志物的定量下限為0.05～0.09 ng，檢出限為0.02～0.05 ng(見表3)。

2.2.3 精密度、重復(fù)性與穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)精密吸取“1.2.1”混合對(duì)照品溶液(23.80 μg/mL)，加入內(nèi)標(biāo)100 μL，按照“1.3”條件進(jìn)行分析，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定各對(duì)照品和內(nèi)標(biāo)峰面積的比值，計(jì)算得21種待測(cè)化學(xué)標(biāo)志物的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.56%～2.1%(見表4)，說(shuō)明儀器的精密度良好。精密稱取老香黃0年(LXH0_1)樣品6份，每份1.00 g，分別按照“1.2.3”制備供試液，加入100 μL內(nèi)標(biāo)，混勻，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算得到15種化學(xué)標(biāo)志物含量的RSD為0.31%～2.4%(見表4)，表明該方法的重復(fù)性良好。取同一老香黃供試品溶液(LXH0_1)，加入100 μL內(nèi)標(biāo)，混勻，分別在0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣分析，測(cè)定15種目標(biāo)峰面積和內(nèi)標(biāo)峰面積的比值RSD為1.1%～2.1%(見表4)，表明供試品溶液在24 h中具有良好的穩(wěn)定性。

表3 21種化學(xué)標(biāo)志物的線性關(guān)系、檢出限及定量下限Table 3 Linear relations，LODs and LOQs of 21 chemical markers for test

2.2.4 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)精密稱取已知含量的老香黃0年(LXH0_1)樣品0.50 g各6份，分別加入近似等量的樣品中可測(cè)到的15種對(duì)照品，按“1.2.3”制備加標(biāo)回收供試品溶液，加入100 μL內(nèi)標(biāo)，混勻，按照“1.3”條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率及RSD(表4)。15種化學(xué)標(biāo)志物的回收率為92.3%～104%，RSD為0.49%～2.5%。結(jié)果表明該方法的準(zhǔn)確度和精密度良好，可以滿足日常樣品的分析要求。

表4 方法的精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性及回收率Table 4 Precision，repeatability，stability and recovery for the method

2.3 不同年份老香黃樣品含量測(cè)定

取“1.2.3”供試品溶液100 μL，加入內(nèi)標(biāo)100 μL混勻，按照“1.3”條件進(jìn)行分析，以相應(yīng)的線性關(guān)系分析不同年份老香黃樣品的15種化學(xué)標(biāo)志物含量(見表5)。結(jié)果表明最初加工好的老香黃(LXH0)各標(biāo)志物含量較高，其中5,7-二甲氧基香豆素、檸檬苦素、諾米林、7-羥基香豆素含量較高，分別為(47.465±1.987)μg/g、(168.562±17.851)μg/g、(216.731±26.217)μg/g和(243.242±31.430)μg/g。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，這些化學(xué)標(biāo)志物含量較高，但隨著老黃香腌制時(shí)間的增加，復(fù)雜的炮制過(guò)程造成了化學(xué)標(biāo)志物的流失，含量不同程度降低，可能是各化學(xué)標(biāo)志物在炮制過(guò)程中轉(zhuǎn)變?yōu)槠渌?jí)代謝產(chǎn)物，也可能是經(jīng)過(guò)多道工藝的炮制，特別是鹽浸和蒸煮等步驟后導(dǎo)致各標(biāo)志物嚴(yán)重流失[8]。此外，對(duì)于未檢出的圣草次苷、野漆樹苷、蘆丁、橙皮苷、新橙皮苷、甲基橙皮苷6種物質(zhì)在佛手原料中均有報(bào)道，但對(duì)比同年期的老香黃成品中未有發(fā)現(xiàn)，可能是加工過(guò)程中流失至含量低于檢出限。

此外，5,7-二甲氧基香豆素是佛手中的主要成分，其含量在佛手果實(shí)不同成熟階段變化很大，因此在樣品個(gè)體中含量也有較大的差異。表5和表6中，5,7-二甲氧基香豆素的不規(guī)律變化應(yīng)與樣品代表性有關(guān)。但整體而言，隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的增加，與其他成分一致，5,7-二甲氧基香豆素含量呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì)。

表5 不同年份老黃香中15種化學(xué)標(biāo)志物的含量(μg/g,n=6)Table 5 Contents of 15 chemical markers in Lao-Xiang-Huang under different preserved years(μg/g,n=6)

2.4 基于化學(xué)標(biāo)志物的PCA降維分析

主成分分析(PCA)是一種降維思維或?qū)⒍鄠€(gè)指標(biāo)轉(zhuǎn)化為n個(gè)指標(biāo)的數(shù)據(jù)處理方法，克服了單一指標(biāo)的局限性，可篩選出不同組間的顯著差異性化學(xué)標(biāo)志物[15]。本研究采用SIMCA14.1軟件對(duì)不同年份的老香黃中15種化學(xué)標(biāo)志物的含量(C1～C15，編號(hào)見表5)進(jìn)行PCA分析和無(wú)監(jiān)督模式下的聚類分析(HCA)，HCA分析采用最短最長(zhǎng)平均距離(Single linkage)，結(jié)果表明前兩個(gè)主成分的累積貢獻(xiàn)率達(dá)79.1%，且特征值均大于1，滿足主成分的選取要求，可以揭示樣品中的大多數(shù)差異信息。進(jìn)一步根據(jù)前兩個(gè)主成分進(jìn)行PCA得分圖、化合物載荷圖以及層次聚類分析圖的制作(見圖2)。PCA結(jié)果表明，老香黃0年和20年有明顯的區(qū)分，其他5個(gè)年份并未得到很好的區(qū)分(圖2A)；載荷圖顯示各成分未獲得良好的得分(值大于0.30，表示載荷顯著[15])(圖2B)。無(wú)監(jiān)督模式下的HCA分析同樣顯示，除了老香黃0年和20年有很好的聚類，其他年份樣品無(wú)法很好的聚類在一起(圖2C)。為了進(jìn)一步研究模式識(shí)別技術(shù)能否將不同年份的老香黃完全區(qū)分，后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步采用OPLS-DA法進(jìn)行分析。

2.5 基于OPLS-DA分析的差異性化學(xué)標(biāo)志物篩選

正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)結(jié)合了正交信號(hào)校正(OSC)和PLS-DA方法，能夠?qū)矩陣信息分解成與Y相關(guān)和不相關(guān)的兩類信息，通過(guò)去除與分類信息無(wú)關(guān)的噪音，提高模型的有效性來(lái)篩選差異變量[16]。本研究將7個(gè)不同年份的老香黃分為7組，分組同“1.1”一致。通過(guò)OPLS-DA分析結(jié)果可知，各組均有良好的區(qū)分(圖3A)，且R2X(cum)=0.943，R2Y(cum)=1，Q2(cum)= 0.855，表明模型的解釋度和預(yù)測(cè)度好。

圖2 不同年份老香黃的PCA分析結(jié)果Fig.2 PCA analysis results of Lao-Xiang-Huang under different preserved years A：PCA plot；B：loading plot；C：HCA dendrogram

圖3 不同年份老香黃的OPLS-DA分析結(jié)果Fig.3 OPLS-DA analysis results of Lao-Xiang-Huang under different preserved years A：OPLS-DA plot;B：VIP value of detected chemical markers；C：dendrogram of HCA clustering

通過(guò)提取OPLS-DA模型中15個(gè)變量的重要值(Variable importance in projection,VIP)(圖3B)，對(duì)15個(gè)化學(xué)標(biāo)志物含量VIP值大小進(jìn)行排序，篩選出VIP值大于1的差異化學(xué)標(biāo)志物。結(jié)果顯示，化學(xué)標(biāo)志物C4(5,7-二甲氧基香豆素)、C12(香葉木苷)、C15(山柰酚)、C13(黃柏酮)、C10(金圣草素)、C6(檸檬苦素)的VIP值均大于1，說(shuō)明以上6種化學(xué)成分對(duì)7個(gè)貯藏年份的老香黃的分類有顯著影響，這些成分是引起變化的主要差異性化學(xué)標(biāo)志物。而其他化學(xué)成分的VIP值均小于1，表明對(duì)不同年份的老香黃的差異性影響不大。

在OPLS-DA有監(jiān)督的判別模式條件下，對(duì)不同年份的老香黃樣品進(jìn)行HCA聚類分析，參數(shù)為最短最長(zhǎng)平均距離(Single linkage)。結(jié)果顯示，不同年份的樣品聚類位置不同，且大多數(shù)同一年份樣品聚為一類，可區(qū)分不同年份的老香黃(圖3C)。雖然老香黃8年樣品有部分差異，但不影響整體的年份聚類，表明在此模式下，不同貯藏年份的老香黃在品質(zhì)上存在一定差異。

綜合分析表5含量結(jié)果和篩選的差異標(biāo)志物，貢獻(xiàn)最大的差異化學(xué)標(biāo)志物5,7-二甲氧基香豆素，0年含量為(47.465±1.987)μg/g，3年含量為(17.069±0.542)μg/g，5年含量為(11.073±1.862)μg/g，8年含量為(41.905±2.240)μg/g，10年含量為(21.079±2.270)μg/g，15年含量為(43.267±2.432)μg/g，20年含量為(51.711±1.439)μg/g。該標(biāo)志物的含量在一定程度上可以體現(xiàn)不同年份的老香黃，進(jìn)而通過(guò)盲樣的適用性測(cè)試結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。

2.6 盲樣的適用性測(cè)試結(jié)果驗(yàn)證

在市場(chǎng)上，收集不同廠家不同年份9批樣品進(jìn)行盲樣的適用性能力檢測(cè)(Proficiency test,PT)，樣品按“1.2.3”進(jìn)行供試品溶液的制備，取100 μL，加入內(nèi)標(biāo)100 μL混勻，按照“1.3”條件進(jìn)行分析，按照相應(yīng)的線性關(guān)系分析樣品中6種差異性化學(xué)標(biāo)志物的含量，結(jié)果見表6。通過(guò)比對(duì)表6和表5中5,7-二甲氧基香豆素含量，判斷盲樣中各批次的年份，驗(yàn)證所建方法的可靠性。檢測(cè)表明PT_1～PT_3檢測(cè)數(shù)值落在老香黃3年(LXH3)，PT_4～PT_6落在老香黃5年(LXH5)，PT_7～PT_9落在老香黃8年(LXH8)，分析結(jié)果與廠家報(bào)告基本一致。進(jìn)一步分析，盲樣中各年份的其他5種成分(香葉木苷、山柰酚、黃柏酮、金圣草素、檸檬苦素)含量在表5各年份老香黃測(cè)定的范圍之內(nèi)，表明所建立的方法可靠，有較高的應(yīng)用價(jià)值。

表6 市場(chǎng)上老香黃盲樣適用性測(cè)試結(jié)果(μg/g,n=3)Table 6 Proficiency test in commercially available of Lao-Xiang-Huang samples(μg/g,n=3)

3 結(jié) 論

本研究提供了21種與老香黃相關(guān)的化學(xué)標(biāo)志物及其內(nèi)標(biāo)山柰酚-3-O-蕓香糖苷的UPLC-MS/MS檢測(cè)方法。在該條件下，各化學(xué)標(biāo)志物的提取峰與內(nèi)標(biāo)峰無(wú)雜峰干擾，峰形良好，基線平穩(wěn)，且該方法的線性良好，靈敏度高，專屬性強(qiáng)，方法學(xué)考察結(jié)果符合日常分析要求。研究發(fā)現(xiàn)：在佛手原料中均有報(bào)道的圣草次苷、野漆樹苷、蘆丁、橙皮苷、新橙皮苷、甲基橙皮苷6種成分未在不同年份的老香黃中檢出，可能是在加工過(guò)程中流失至低于檢出限。進(jìn)一步結(jié)合PCA、HCA、OPLS-DA化學(xué)模式識(shí)別技術(shù)，可以有效判別不同年份的老香黃，找出區(qū)分老香黃年份的6種差異化學(xué)標(biāo)志物，其中貢獻(xiàn)最大的差異化學(xué)標(biāo)志物為5,7-二甲氧基香豆素，通過(guò)該標(biāo)志物的含量在一定程度上可以判斷老香黃的年份。為了驗(yàn)證方法的普適性，經(jīng)過(guò)市場(chǎng)上老香黃盲樣適用性測(cè)試分析表明，5,7-二甲氧基香豆素含量的檢測(cè)值對(duì)應(yīng)的老香黃年份與廠家報(bào)告基本一致。該研究一方面可通過(guò)對(duì)多種差異性成分的分析有效地控制老香黃的質(zhì)量，另一方面可以通過(guò)指標(biāo)性成分含量判斷老香黃的大概年份。