韓欣 丁曉玲 余濤 包蕊 王馨

(青海省婦幼保健院藥劑科,青海 西寧 810007)

肺纖維化( PF) 是指因肺泡損傷、成纖維細(xì)胞增殖、肺泡細(xì)胞外基質(zhì)破壞及過度沉積等多種原因?qū)е碌囊环N肺間質(zhì)性疾病，可使患者產(chǎn)生呼吸困難、干咳、肺功能通氣障礙、呼吸衰竭等癥狀[1-3]。PF發(fā)病率和死亡率逐年升高，嚴(yán)重威脅患者生命健康[4-5]。PF發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，有研究[6]發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞自噬及上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化與PF的發(fā)生發(fā)展程密切相關(guān)。磷脂酰-3激酶(Phosphatidyl-3 kinase，PI3K)/ 蛋白激酶B ( Protein kinase B，Akt)/雷帕霉素靶分子(Rapamycin target molecule，mTOR)信號(hào)通路參與調(diào)控細(xì)胞自噬過程[7]，故調(diào)控PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路表達(dá)，激活肺組織細(xì)胞自噬，可緩解PF進(jìn)程。近來有研究[8-9]發(fā)現(xiàn)，益肺散結(jié)方對(duì)肺癌有較好的療效，且方中黃芪對(duì)PF也有一定的治療效果，故本研究推測(cè)益肺散結(jié)方可能對(duì)PF也有較好的療效，并建立大鼠PF模型，探討益肺散結(jié)方對(duì)大鼠PF過程中PI3K/Akt/mTOR通路和細(xì)胞自噬的影響，以期為中藥方劑益肺散結(jié)方新療效的開發(fā)和臨床合理用藥提供參考。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取清潔級(jí)同遺傳背景的SD大鼠50 只，體重 200～220 g，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(粵) 2018-0002，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)為省科委2000A027。所有大鼠于本院動(dòng)物房中飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件：自然光照，自由飲食、飲水，溫度25 ℃，相對(duì)濕度50%，鼠籠清潔、透氣。本研究經(jīng)本院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意，實(shí)驗(yàn)遵循3R原則。

1.2 主要試劑及儀器 益肺散結(jié)方組成(黃芪30 g、麥冬15 g、沙參15 g、薏苡仁30 g、杏仁10 g、浙貝母10 g、皂角10 g、莪術(shù)15 g、金蕎麥 30 g、白花蛇舌草30 g)常規(guī)煎藥，藥液濃縮至生藥含量為5.0 g/mL；博萊霉素(Bleomycin，BLM)購自美國英杰生命技術(shù)有限公司(貨號(hào)：R250-01)；組織蛋白酶D (cathepsin D,Cat-D)購自美國伯豪生物BD公司(貨號(hào)：DXT-610800)；泛素和LC3結(jié)合蛋白p62(ubiquitin-andLC3-binding protein p62，p62)抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司(貨號(hào)：bs-2951R-2)；自噬相關(guān)蛋白beclin-1抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司(貨號(hào)：bs-1501P)；ɑ-平滑肌動(dòng)蛋白( ɑ-smooth actin，ɑ-SMA)購自北京百奧萊博科技有限公司(貨號(hào)：YI634-LCE)；微管相關(guān)蛋白輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain3，LC3-Ⅱ)/LC3-I 購自北京索萊寶科技有限公司(貨號(hào)：K000467P)；羥脯氨酸elisa試劑盒購自上海聯(lián)邁生物工程有限公司(貨號(hào)：LM-13650-EB)；HE染色試劑盒購自上海生物公司(貨號(hào)：G1120)；馬松(Masson) 染色試劑盒購自愛必信(上海)生物科技有限公司(貨號(hào)：abs9347)；p-PI3K/PI3K抗體(貨號(hào)：FNAB06243，購自武漢菲恩科技生物有限公司)；Akt抗體(貨號(hào)：ab8805，購自美國Abcam)；p-mTOR/mTOR抗體(貨號(hào)：ab2732，購自美國Abcam)；蛋白提取試劑盒、BCA試劑盒(貨號(hào)P0027上海碧云天公司)等。手動(dòng)輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)(型號(hào)RM2125RTS，德國Leica公司)；光學(xué)顯微鏡(型號(hào)SMZ745，日本尼康公司)；酶標(biāo)儀(型號(hào)XElx800，美國Perkin Elmer公司)；蛋白電泳儀、半干轉(zhuǎn)膜儀(型號(hào)1659001、Trans-Blot SD，美國Bio-Rad公司)；凝膠成像儀(型號(hào)：GIS-500，Miulab公司)等。

1.3 方法

1.3.1 大鼠PF模型建立及分組給藥 參照文獻(xiàn)[9]構(gòu)建PF模型，具體操作方法為：隨機(jī)取40只大鼠，用3%戊巴比妥鈉經(jīng)腹腔注射麻醉大鼠后，固定大鼠，并用開口器固定口腔，拉出舌頭后，用壓舌板壓住舌腹，行氣管插管并緩慢注入博萊霉素(溶于0.9%的氯化鈉注射液)5 mg/kg，0.3 mL，然后將大鼠直立，沿身體縱軸旋轉(zhuǎn)3 min即可。將造模成功的大鼠分為PF組、益肺散結(jié)方低(7.5 g/kg)、中(15 g/kg)、高(30 g/kg)劑量組，每組10只；另取10只大鼠，除行插管后緩慢注入0.9%的氯化鈉注射液0.3 mL外，其余操作同模型組，將其作為對(duì)照組。造模結(jié)束后2 h開始給藥，益肺散結(jié)方參照文獻(xiàn)[8]以生理鹽水配置為含生藥量0.75、1.50、3.00 g/mL的混懸液，各處理組大鼠均以10 mL/kg的劑量灌胃給藥，對(duì)照組與PF組灌胃給予生理鹽水，各組連續(xù)給藥21 d，1次/d。

1.3.2 肺組織標(biāo)本采集 給藥期間觀察大鼠呼吸、毛發(fā)、體態(tài)及行為活動(dòng)。于末次給藥24 h后，用3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠后并處死，解剖大鼠，分別摘取大鼠左右兩肺，經(jīng)磷酸緩沖鹽沖洗后，左肺置于10%甲醛中固定以備作病理檢查，右肺迅速置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 肺組織HE染色法檢測(cè)病理組織形態(tài)及炎癥水平 取1.2.2中的左肺，進(jìn)行常規(guī)透明、浸蠟、包埋后、切成厚度為5 μm的切片。將切片進(jìn)行二甲苯脫蠟，梯度酒精水化后，用蘇木精-伊紅染色 5 min，1%鹽酸酒精分化 10 s，蒸餾水漂洗2 min,梯度酒精脫水2 min，二甲苯透明處理，中性光學(xué)樹脂封片后，置于光鏡下觀察分析肺組織結(jié)構(gòu)。隨機(jī)選取5個(gè)視野，參照文獻(xiàn)[10]用單盲法觀察肺泡炎癥并計(jì)分：0分，肺泡透亮、結(jié)構(gòu)清晰、間隔正常；1～2分，肺泡結(jié)構(gòu)稍紊亂、間隔增生增寬，且有少量炎性細(xì)胞浸潤，病變范圍占全肺20%；3～5分，肺泡結(jié)構(gòu)紊亂、間隔明顯增寬，炎性細(xì)胞浸潤較多，病變范圍占全肺20%～50%；6～8分，肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡融合、間隔顯著增寬，炎性細(xì)胞大量浸潤，成纖維細(xì)胞增生，膠原纖維大量沉積，病變范圍占全肺20%～50%。每組5個(gè)樣本分別評(píng)分，取平均值。

1.3.4 肺組織馬松( Masson) 染色法檢測(cè)膠原增殖程度 取1.2.3項(xiàng)下每組切片，用二甲苯脫蠟2次，15 min/次，用高濃度到低濃度酒精脫水，溫水漂洗后按Masson試劑盒說明書操作。置于顯微鏡下觀察，隨機(jī)選取5個(gè)視野，參照文獻(xiàn)[10]用單盲法觀察肺纖維化程度并計(jì)分：0分，肺泡結(jié)構(gòu)清晰、間隔正常，無腫脹；1～2分，肺泡輕微腫脹、有少量纖維化出現(xiàn)；3～4分，肺泡壁增大，出現(xiàn)小面積纖維灶；5～6分，纖維化區(qū)域增大，出現(xiàn)連續(xù)的纖維灶；7～8分：肺泡結(jié)構(gòu)破壞顯著，纖維灶融合，出現(xiàn)連續(xù)大片的纖維灶；9～10分：肺泡空隙消失，肺泡腔充斥大量纖維，肺完全纖維化，每組5個(gè)樣本分別評(píng)分，取平均值。

1.3.5 羥脯氨酸試劑盒測(cè)定膠原蛋白含量 取1.2.2中的右肺，于4 ℃冰箱中解凍后，取100 g勻漿，參照文獻(xiàn)[12]取按堿性水解法裂解組織，離心后取上層清液1 mL，按羥脯氨酸試劑盒說明書進(jìn)行測(cè)定。

1.3.6 Western blot法檢測(cè)肺組織通路蛋白p-PI3K/ PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR及自噬相關(guān)蛋白 beclin-1、p62 、ɑ-SMA、LC3-Ⅱ/ LC3-I蛋白的表達(dá) 取1.2.2中-80 ℃保存的右肺組織，于4 ℃冰箱中解凍后，剪取0.5 g，用組織勻漿器勻漿、離心分離后，取上層清液，用蛋白裂解液裂解離心后提取蛋白，用BCA試劑盒檢測(cè)蛋白總濃度，取50 μg蛋白上樣，進(jìn)行電泳和轉(zhuǎn)膜反應(yīng)，TBST溶液清洗后，加入5%脫脂牛奶室溫下封閉1 h，TBST溶液清洗3次后，加入一抗(p-PI3K、PI3K、p-mTOR、mTOR、p-AKT、AKT、beclin-1、p62、LC3-Ⅱ、LC3-I，β-actin(內(nèi)參)抗體，稀釋倍數(shù)分別為1∶1000，1∶1000，1∶1000，1∶1000，1∶2000，1∶1000，1∶2000，1∶2000，1∶2000，1∶2000，1∶2000，4℃搖床室溫孵育過夜，TBST振洗后加入HRP羊抗兔二抗(稀釋倍數(shù)1∶2000)，37 ℃搖床室溫孵育1 h，TBST清洗3次后，采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色，以凝膠成像儀觀察條帶并拍照，并以Image-J軟件分析各組蛋白相對(duì)表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般行為觀察 對(duì)照組大鼠毛色光潔，呼吸、飲食正常，活動(dòng)良好。PF組大鼠隨時(shí)間延長，呼吸喘促、毛色粗糙、飲食減少、形體消瘦、精神萎靡，鼠爪和鼠尾出現(xiàn)紫紺。益肺散結(jié)方各劑量組呼吸喘促次數(shù)減少、飲食量均明顯好于PF組。

2.2 大鼠肺組織病理損傷程度及炎性評(píng)分檢測(cè) 對(duì)照組大鼠肺組織肺泡結(jié)構(gòu)清晰正常。與對(duì)照組比較，PF組大鼠肺組織可見肺泡融合、間隔顯著增寬，炎性細(xì)胞大量浸潤，且有成纖維細(xì)胞增生堆積擠，炎性評(píng)分增高(P<0.05)；與PF組大鼠比較，益肺散結(jié)方低、中、高劑量組大鼠炎性細(xì)胞浸潤減少，肺泡結(jié)構(gòu)稍紊亂，炎性評(píng)分降低(P<0.05)；益肺散結(jié)方各劑量組隨劑量增加，炎性浸潤及評(píng)分降低(P<0.05)，見圖1、表1。

圖1 HE染色檢測(cè)大鼠肺組織病理損傷(200×)Figure 1 HE staining to detect the pathological damage of rat lung tissue

表1 各組大鼠炎性程度評(píng)分和纖維化程度評(píng)分比較Table 1 Comparison of inflammatory degree score and fibrosis degree score of rats in each group

2.3 大鼠肺組織纖維化程度評(píng)分檢測(cè) 對(duì)照組大鼠肺組織肺泡結(jié)構(gòu)正常。與對(duì)照組比較，PF組大鼠肺組織可見肺泡結(jié)構(gòu)粘連、閉合，有大量膠原組織增殖，且纖維化程度評(píng)分增高(P<0.05)。與PF組大鼠比較，益肺散結(jié)方低、中、高劑量組大鼠，肺泡結(jié)構(gòu)少量殘存，膠原纖維增殖減少，纖維化程度評(píng)分降低(P<0.05)。益肺散結(jié)方各劑量組隨劑量增加、膠原組織增殖減少及纖維化程度評(píng)分降低(P<0.05)，見圖2、表1。

圖2 Masson染色檢測(cè)大鼠肺組織病理損傷(200×)Figure 2 Pathological damage of lung tissue detected by Masson staining

2.4 各組大鼠肺組織纖維蛋白含量的影響 與對(duì)照組相比，PF組大鼠肺組織纖維蛋白含量升高(P<0.05)。與PF組相比，益肺散結(jié)方低、中、高劑量組大鼠肺組織纖維蛋白含量降低(P<0.05)，益肺散結(jié)方各劑量組纖維蛋白含量降低呈劑量依賴性(P<0.05)，見表2。

表2 各組大鼠肺組織纖維蛋白含量結(jié)果表Table 2 Results of fibrin content in lung tissue of rats in each group

2.5 各組大鼠肺組織自噬相關(guān)蛋白 beclin-1、p62、ɑ-SMA、LC3-Ⅱ/ LC3-I表達(dá)的影響 與對(duì)照組相比，PF組大鼠p62 、ɑ-SMA蛋白表達(dá)升高(P<0.05)，beclin-1和LC3-Ⅱ/ LC3-I蛋白表達(dá)下降(P<0.05)；與PF組相比，益肺散結(jié)方低、中、高劑量組大鼠肺組織p62 、ɑ-SMA蛋白表達(dá)降低(P<0.05)，beclin-1和LC3-Ⅱ/LC3-I蛋白表達(dá)升高(P<0.05)；益肺散結(jié)方各劑量組p62 、ɑ-SMA蛋白表達(dá)降低、beclin-1和LC3-Ⅱ/LC3-I蛋白表達(dá)升高呈劑量依賴性(P<0.05)，見圖3、表3。

表3 各組大鼠beclin-1、p62、ɑ-SMA、LC3-Ⅱ/ LC3-I蛋白相對(duì)表達(dá)水平Table 3 Relative expression levels of beclin-1,p62,ɑ-SMA,LC3-Ⅱ / LC3-I protein of rats in each group

2.6 各大鼠肺組織通路蛋白p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR表達(dá)水平 與對(duì)照組相比，PF組大鼠p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR蛋白表達(dá)升高(P<0.05)；與PF組相比，益肺散結(jié)方低、中、高劑量組大鼠肺組織p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR蛋白表達(dá)降低(P<0.05)；益肺散結(jié)方各劑量組蛋白表達(dá)呈劑量依賴性降低(P<0.05)，見圖3、表4。

圖3 各組大鼠肺組織蛋白表達(dá)免疫印跡圖Figure 3 Western blot of protein expression in lung tissue of rats in each group注：A.對(duì)照組；B.PF組；C.劑方低劑量組；D.劑方中劑量組；E.劑方高劑量組。圖A.大鼠肺組織自噬相關(guān)蛋白beclin-1、p62、ɑ-SMA、LC3-Ⅱ/LC3-I蛋白表達(dá)免疫印跡圖；圖B.大鼠肺組織通路蛋白p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR蛋白免疫印跡圖

表4 各組大鼠肺組織通路蛋白p-PI3k/PI3k、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR表達(dá)水平Table 4 The relative expression levels of p-PI3K/PI3K,p-AKT/AKT,p-mTOR/mTOR protein

3 討論

PF確切發(fā)病機(jī)制不明，對(duì)于PF的治療尚無特效藥物[11]。西醫(yī)研究發(fā)現(xiàn)，成纖細(xì)胞增殖及胞外基質(zhì)在肺組織的過度沉積是PF的主要病理表現(xiàn)[10]。中醫(yī)將PF歸屬為肺痹、肺痿、喘證等，且多以益氣養(yǎng)陰、祛痰、止咳等方法治療[12]。中醫(yī)單方、驗(yàn)方、成藥等在緩解PF患者癥狀、延緩患者生存方面具有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[13]。文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)，運(yùn)用益氣養(yǎng)陰、散結(jié)化瘀方法及中藥黃芪提取物在治療PF方面有較好效果[14]，而中醫(yī)驗(yàn)方益肺散結(jié)方具有益氣養(yǎng)陰、化痰止咳功效，方中黃芪又為君藥，故本研究推測(cè)益肺散結(jié)方也可能治療PF，并建立大鼠PF模型對(duì)此進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，PF組大鼠毛發(fā)稀疏，呼吸困難加重，HE及Masson 染色顯示肺組織炎性及膠原增殖程度等病理損傷評(píng)分升高，且羥脯氨酸試劑盒檢測(cè)膠原蛋白含量也明顯升高，提示大鼠PF造模成功。而給予益肺散結(jié)方低、中、高劑量治療后發(fā)現(xiàn)，大鼠呼吸困難現(xiàn)象緩解，肺組織炎性損傷、膠原增殖及含量也均比PF組降低，且益肺散結(jié)方各劑量組上述指標(biāo)降低效果呈劑量依賴性增強(qiáng)，表明益肺散結(jié)方可降低PF大鼠肺組織膠原蛋白含量，緩解肺纖維化進(jìn)程。

細(xì)胞自噬能夠提高肺泡細(xì)胞生存能力，延緩PF進(jìn)程[6]。Beclin1是自噬體形成過程中的重要分子[15]。LC3-II/LC3-I 比值大小可評(píng)估自噬水平的高低[16]。p62 參與泛素蛋白酶系統(tǒng)和自噬蛋白降解過程[17]。自噬缺陷可促進(jìn)ɑ-SMA蛋白表達(dá)[18]。PI3K/Akt/mTOR參與肺纖維化進(jìn)程中的自噬過程[7,10]。徐昌君等[10]發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷可抑制PF模型小鼠肺組織中PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路，提高LC3-II/LC3-I、Beclin1自噬蛋白表達(dá)，降低ɑ-SMA和p62蛋白表達(dá)，增強(qiáng)肺組織細(xì)胞自噬活性，來抑制肺纖維化進(jìn)程；He等[19]發(fā)現(xiàn)抑制PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路表達(dá)，可提高LC3-II/LC3-I、Beclin1自噬蛋白表達(dá)，降低p62蛋白表達(dá)，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的自噬與凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，PF組大鼠p-PI3K/ PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR通路蛋白表達(dá)升高，而自噬蛋白LC3-II/LC3-I和Beclin1表達(dá)降低、ɑ-SMA和p62表達(dá)升高，提示PF模型大鼠肺組織PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路激活，自噬活性下降。而給予益肺散結(jié)方低、中、高劑量治療后發(fā)現(xiàn)，大鼠肺組織p-PI3K/ PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR通路蛋白表達(dá)降低，自噬蛋白LC3-II/LC3-I和Beclin1表達(dá)升高、ɑ-SMA和p62表達(dá)降低，且益肺散結(jié)方各劑量組呈劑量依賴性，表明益肺散結(jié)方可通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路表達(dá)，提高肺組織細(xì)胞自噬活性，緩解肺纖維化進(jìn)程。這與徐昌君等[10]研究結(jié)果一致，體現(xiàn)了益肺散結(jié)方治療PF的優(yōu)越性。

4 結(jié)論與啟示

益肺散結(jié)方可通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路表達(dá)，提高肺組織細(xì)胞自噬活性，緩解肺纖維化進(jìn)程，這可能為其作用機(jī)制之一。益肺散結(jié)方還可能通過其他途徑改善PF進(jìn)程，本研究未設(shè)計(jì)通路抑制劑進(jìn)行驗(yàn)證，有待后續(xù)深入研究。