李 涵

（濮陽(yáng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南濮陽(yáng) 457000）

大氣中包括甲烷在內(nèi)的溫室氣體濃度增加會(huì)導(dǎo)致全球變暖，這是近年來(lái)人們關(guān)注的主要問題。近年，畜牧業(yè)中反芻動(dòng)物排放的甲烷引起重視。甲烷是一種比二氧化碳強(qiáng)23倍的溫室氣體，反芻動(dòng)物腸道發(fā)酵產(chǎn)生的甲烷主要是由于兼性厭氧條件對(duì)細(xì)菌、原生動(dòng)物和真菌的生長(zhǎng)有利（孫福昱等，2018）。瘤胃內(nèi)的甲烷排放被認(rèn)為是一個(gè)能量浪費(fèi)過程（Johnson等，1995）。許多化學(xué)食品添加劑已經(jīng)被證明具有減降低瘤胃甲烷排放的潛力，但它們要么對(duì)宿主動(dòng)物有毒，要么對(duì)有益的瘤胃微生物產(chǎn)生副作用。為降低反芻動(dòng)物甲烷排放，選擇具有生物活性的化合物來(lái)降低原生動(dòng)物活性已成為一種研究方法。但在供人類食用的動(dòng)物身上使用化學(xué)物質(zhì)的風(fēng)險(xiǎn)越來(lái)越受到公眾關(guān)注。Kim等（2012）研究表明，植物提取物可以控制瘤胃微生物多樣性，是降低甲烷排放的較好替代選擇，這種方法也是動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)家認(rèn)為最有潛力的策略。本研究旨在評(píng)估松樹和銀杏葉提取物對(duì)瘤胃發(fā)酵、瘤胃產(chǎn)甲烷和產(chǎn)甲烷相關(guān)微生物的體外作用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)原料與體外發(fā)酵 以100 g/300 mL的溶劑，用70%的乙醇制備松樹和銀杏葉提取物。將含70%乙醇的燒瓶塞住，在39℃的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上孵育24 h。從壓碎的葉子中提取松樹和銀杏葉汁液，然后用濾紙過濾，收集濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器將70%乙醇溶劑除去，4℃保存?zhèn)溆?。?頭500 kg重、帶有瘤胃瘺管荷斯坦奶牛瘤胃中收集瘤胃液，瘤胃液經(jīng)四層紗布過濾后分為5組，對(duì)照組不添加植物提取物，T1組添加5%松樹液，T2組添加5%松樹70%乙醇提取物，T3組添加5%銀杏葉液，T4組添加5%銀杏葉70%乙醇提取物。將瘤胃液注入血清瓶，置于39℃的振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。體外試驗(yàn)每組3個(gè)重復(fù)。孵育后分別測(cè)定瘤胃液pH、揮發(fā)性脂肪酸總量、乙酸、丙酸和丁酸含量。參考王榮等（2019）的研究方法測(cè)定瘤胃發(fā)酵氣體生成總量、甲烷和二氧化碳量。

1.2 微生物定量 從培養(yǎng)液中取30 mL樣品，用寬口徑的移液管取1.0 mL的溶液，以確保樣品中含有液體和消化液，用核酸提取試劑盒提取RNA。參考Ohene-Adjei等（2008）的方法設(shè)計(jì)纖毛蟲、產(chǎn)甲烷菌和產(chǎn)琥鉑酸絲狀桿菌的引物，并進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析，測(cè)定結(jié)果以對(duì)照組進(jìn)行歸一化，處理組表示為相對(duì)于對(duì)照組的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析 數(shù)據(jù)分析采用SAS統(tǒng)計(jì)分析軟件的一般線性模型，利用Duncan’s法進(jìn)行多重比較，P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物提取物對(duì)瘤胃體外發(fā)酵特征的影響由表1可知，松樹和銀杏葉提取物顯著影響瘤胃體外發(fā)酵總氣體產(chǎn)量、甲烷排放和二氧化碳排放量（P＜0.05），其中松樹和銀杏葉乙醇提取物較對(duì)照組顯著降低了氣體總量和甲烷排放量（P＜0.05），而5%松樹液和5%銀杏葉乙醇提取物較對(duì)照組瘤胃體外發(fā)酵二氧化碳產(chǎn)量顯著降低了31.17%和33.02%（P＜0.05）。

由表2可知，銀杏葉液和銀杏葉乙醇提取物組瘤胃pH較對(duì)照組顯著提高了0.94%和0.79%（P＜0.05），而對(duì)照組揮發(fā)性脂肪酸總量最高，較處理組分別顯著提高10.39%、11.12%、8.58%和9.62%（P＜0.05），處理組間對(duì)揮發(fā)性脂肪酸總量的影響無(wú)顯著差異（P＞0.05）。此外，對(duì)照組乙酸、丙酸和丁酸含量也表現(xiàn)最高，其中乙酸含量較T1、T2和T4組分別顯著提高9.15%、10.30%和9.80%（P＜0.05），丙酸含量較T1和T2組分別顯著提高11.69%和12.62%（P＜0.05），丁酸含量較處理組分別顯著提高12.28%、13.52%、10.36%和10.44%（P＜0.05）。T1組乙酸與丙酸比值最高，分別較對(duì)照組、T3和T4組顯著提高2.55%、1.52% 和 3.08%（P＜ 0.05）。

2.2 植物提取物對(duì)瘤胃體外發(fā)酵微生物相對(duì)表達(dá)量的影響 由表3可知，與對(duì)照組相比，處理組瘤胃體外發(fā)酵中纖毛蟲、產(chǎn)甲烷菌和產(chǎn)琥鉑酸絲狀桿菌的相對(duì)表達(dá)量降低了25%～49%（P＜ 0.05）。

3 討論

體外瘤胃發(fā)酵可能受植物提取物的用量和提取溶劑的影響，如Pfister等（1992）指出，牛飼料中添加15%～30%的松樹葉似乎是瘤胃發(fā)酵毒性作用的閾值。但植物提取物對(duì)牛消化性能的不良影響還有待進(jìn)一步研究。在本研究中，松樹和銀杏葉乙醇提取物較對(duì)照組顯著降低了氣體總量和甲烷排放量。銀杏葉提取物對(duì)pH的影響也顯著，同時(shí)各植物提取物的揮發(fā)性脂肪酸總量均顯著低于對(duì)照組，這表明氫氣產(chǎn)物可能被用作瘤胃產(chǎn)甲烷菌轉(zhuǎn)移甲烷的底物。因此，氫氣對(duì)反芻動(dòng)物的微生物生態(tài)系統(tǒng)具有重要意義。此外，由琥珀酸形成丙酸會(huì)導(dǎo)致氫氣的產(chǎn)甲烷能力降低。腸內(nèi)發(fā)酵產(chǎn)生的氫氣是反芻動(dòng)物甲烷生成的前體，調(diào)控氫氣而非甲烷是控制反芻動(dòng)物甲烷排放的關(guān)鍵。本研究結(jié)果表明，植物提取物特別是銀杏葉乙醇提取物可能影響甲烷生成，降低瘤胃甲烷排放。

表1 植物提取物對(duì)瘤胃體外發(fā)酵氣體生成的影響 mL/g

表2 植物提取物對(duì)瘤胃體外發(fā)酵特性的影響

表3 植物提取物對(duì)瘤胃體外發(fā)酵微生物相對(duì)表達(dá)量的影響

本試驗(yàn)使用的松樹和銀杏葉提取物具有驅(qū)蟲劑、抗菌和抗氧化活性，并已被用作藥物用途（Lee等，2006）。松樹和銀杏葉中的次生化合物（如黃酮類化合物）可能調(diào)控瘤胃發(fā)酵，抑制瘤胃內(nèi)的微生物，尤其是原生動(dòng)物。特別是銀杏葉提取物具有天然的殺蟲作用，可能還具有驅(qū)蟲劑和抗菌作用。Yoo等（2004）在離體試驗(yàn)?zāi)Ｐ椭袑?duì)松樹葉提取物的抗氧化活性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)松樹提取物中總多酚類化合物的含量為1.61%。本研究通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析了體外瘤胃發(fā)酵液中微生物的表達(dá)量。一些瘤胃纖毛蟲和產(chǎn)甲烷菌被認(rèn)為是共生體，本研究結(jié)果表明，補(bǔ)充松樹和銀杏葉提取物可降低纖毛蟲數(shù)量，抑制甲烷生成，進(jìn)而降低瘤胃甲烷排放。Broudiscou等（2000）篩選了植物提取物，對(duì)其產(chǎn)甲烷作用、發(fā)酵模式和原生動(dòng)物數(shù)量進(jìn)行了評(píng)估，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，植物提取物對(duì)產(chǎn)甲烷有輕微的抑制作用。Jo等（1997）在體研究了牧草（紫花苜蓿、金合歡葉和松樹葉）對(duì)韓國(guó)山羊采食量和消化率的影響，體內(nèi)研究結(jié)果表明，松樹葉組的干物質(zhì)攝入量和干物質(zhì)消化率均低于其他飼料，但本試驗(yàn)體外研究結(jié)果未顯示添加植物提取物對(duì)產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌基因表達(dá)有不利影響。

4 結(jié)論

植物提取物（松樹和銀杏葉乙醇提取物）降低了瘤胃體外發(fā)酵甲烷產(chǎn)量，但有必要進(jìn)一步探討植物提取物的劑量和植物提取物是否對(duì)瘤胃具有副作用。