薛舒月，田涵文，石小敏，周康帥，吳明嫦，高貝瑤，吳登鼎，虞道銳

(1.海南醫(yī)學院臨床學院，2.海南醫(yī)學院基礎與生命科學學院，海南 ?？?571199)

痛風(gout)是由于單鈉尿酸鹽(MSU)結晶沉積于關節(jié)、腎臟等部位導致的炎癥性疾病，急性發(fā)作為急性痛風性關節(jié)炎[1]。其發(fā)生會引起沉積關節(jié)部位的劇烈疼痛，嚴重會導致關節(jié)畸形，甚至造成不可逆的關節(jié)殘疾，一直以來，痛風發(fā)病率呈升高趨勢，一直干擾著人們的生活質量[2]，因此，探尋根治本病的有效方法是醫(yī)學工作者們的追求目標。如今，臨床上治療急性痛風性關節(jié)炎仍然以消炎止痛為主，對疾病選擇的藥物有限，且不良反應較多[3]，所以，尋找一種療效顯著、副作用小的藥物是當前研究的一個關鍵方向。近年來，傳統(tǒng)醫(yī)藥在臨床各種疾病的療效彰顯優(yōu)勢，急性痛風性關節(jié)炎的治療在基礎實驗研究顯示，傳統(tǒng)醫(yī)藥不良反應少且具有“多靶點，多通路”的獨特優(yōu)勢[4]。

千斤拔(FlemingiaRoxb.exAit)為豆科植物蔓性千斤拔的根[5]。2015年版《中國藥典》四部中有這樣的描述：法定藥用來源是千斤拔的干燥根[6]，民間主要用于治療手足痹痛，舒筋活血、祛風濕、強筋骨、四肢酸軟，跌打扭傷等疾病[7]?，F代藥理表明，千斤拔在鎮(zhèn)痛、抗炎、抗血栓、調節(jié)免疫和抗疲勞等方面具有較好的療效[8]。有研究提示，千斤拔提取液對小鼠足腫脹和耳部水腫有抑制作用和抗二甲苯誘發(fā)的小鼠耳廓腫脹的炎癥作用[9]。但對急性痛風性關節(jié)炎引起的炎癥發(fā)生與腫痛治療，以及可能參與疾病發(fā)生發(fā)展的分子機制尚不明確，且未見專題報道。本研究通過千斤拔提取物灌胃給予急性痛風性關節(jié)炎模型大鼠，從炎癥表現、關節(jié)組織變化方面，探討其對急性痛風性關節(jié)炎的抗炎作用，從炎癥相關蛋白表達探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑、藥物及儀器

千斤拔提取物由海南醫(yī)學院生藥學教研室提供。尿酸鈉晶體(monosodium urate，MSU)，批號 101498747，購自 Sigma 公司；秋水仙堿片，批號 H53021369，購自西雙版納制藥廠；白介素1β(IL-1β)檢測試劑盒，批號：190307；腫瘤壞死因子α(TNF-α)，批號：190323；白介素6(IL-6)檢測試劑盒，批號：190432；均購自上海酶聯生物科技有限公司。兔抗大鼠NALP3單克隆抗體，批號：3560-1，購自Abcam公司；兔抗大鼠 Caspase-1 單克隆抗體，批號：13907-1，購自Abcam公司；β-肌動蛋白/β-Actin抗體，批號：hz-0061R，購自Abcam公司；生物素化羊抗兔IgG(1∶500)，批號：165069購自Abcam公司；低溫高速離心機，批號：5810(R)，購自eppendof公司；Mini-PROTEAN Tetra 垂直電泳轉印系統(tǒng)，購自Bio-Rad公司；Western Blot自動分析儀，購自proteinsimple公司。

1.2 實驗動物

SD大鼠共60只，均購自長沙天勤生物技術有限公司，室溫中動物分籠飼養(yǎng)，自由飲水攝食。動物合格證號：SCXK(湘)2014-001。本研究采用的動物嚴格參照海南醫(yī)學院倫理委員會的標準，并在確保實驗可行性的同時盡可能減少實驗動物的數量，實驗結束后動物以脫臼安樂死的方法處死，動物尸體委托學校動物中心處理。

1.3 方法

1.3.1動物造模、分組和給藥 將60只SD大鼠稱重、標號后雙盲法隨機分組，千斤拔提取物低、中、高劑量組，陰性對照組，急性痛風性關節(jié)炎模型組，秋水仙堿組。分組后每天按規(guī)定時間段對各組大鼠灌胃給藥，每次給藥量為：秋水仙堿組：0.8 mg/kg；千斤拔提取物低劑量組(100 mg/kg)、中劑量組(150 mg/kg)、高劑量組(200 mg/kg)。其余兩組大鼠分別給予相應的0.9%NaCl溶液，連續(xù)7 d，第5 天給藥1 h后建立急性痛風性關節(jié)炎模型[10]，用5號注射器在每只大鼠的踝關節(jié)外后方和沿著與脛骨成45°夾角的方向插入至踝關節(jié)腔，將MSU混懸液0.2 mL注入至踝關節(jié)腔內，輕揉拉伸關節(jié)，便于藥物擴散到關節(jié)周圍各部位，陰性對照組于同一方法注射0.2mL生理鹽水。造模成功后在第2、6、12、24小時和48小時測量各組大鼠關節(jié)腫脹度及觀察其步態(tài)；末次給藥1 h 后各組采用3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，麻醉后對每只大鼠右后肢踝關節(jié)備皮、酒精消毒，手術刀切開右踝關節(jié)囊，用1 mL注射器抽取生理鹽水反復沖洗關節(jié)腔，收集關節(jié)液于離心管中，于低溫高速離心機以3 000 r/min離心15 min，取上清液置于2 mL EP管中放在-20 ℃存放備用，接著取大鼠踝關節(jié)中的滑膜組織置于5 mLEP管中，置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2各組關節(jié)腫脹度測量 各組大鼠造模后第2、6、12、24、48小時時間點測量關節(jié)腫脹度，每只大鼠右踝關節(jié)上下3 mm的范圍進行剃毛，用記號筆在其踝關節(jié)下1 mm處進行標記。用游標卡尺重復測量腫脹處的直徑3 次并記錄，得出的數據按以下公式計算出大鼠踝關節(jié)腫脹度：踝關節(jié)腫脹度=(造模后各時間點踝關節(jié)直徑-造模前踝關節(jié)直徑)/造模前踝關節(jié)直徑×100%。

1.3.3各組步態(tài)觀察 各組大鼠造模第6、12、24、48小時時間點進行步態(tài)觀察，標準如下：(1)正常步態(tài)為1級；(2)足踩地減輕，輕度跛行為2級；(3)明顯跛行為3級；(4)足完全離地，三足步態(tài)為4級。

1.3.4各組關節(jié)液IL-1β、TNF-α、IL-6水平測定 從—20 ℃的冰箱中取出已取得的大鼠關節(jié)液，采用酶聯免疫吸附(ELISA)法檢測關節(jié)液IL-1β、TNF-α、IL-6水平含量，根據試劑盒說明書具體步驟操作，應用酶標儀檢其波長在450 nm的吸光度值，根據待測樣品的吸光度值計算相應的IL-1β、TNF-α、IL-6水平。

1.3.5各組踝關節(jié)組織NLRP3、Caspase-1蛋白表達 將已取得的踝關節(jié)滑膜組織進行勻漿裂解，以滑膜組織裂解液的比例提取蛋白。采用蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測其NLRP3、Caspase-1蛋白表達，步驟如下：采用BCA法測定蛋白濃度，進行蛋白定量，計算上樣量加入上樣緩沖液，于100 ℃加熱變性5 min。以每孔按50 μg蛋白量上樣，再經SDS-PAGE 分離膠電泳分離，結束后將膠上蛋白轉至PVDF 膜上，37℃恒溫環(huán)境封閉1 h，孵育相關一抗4 ℃過夜(一抗稀釋比例為NALP3，1∶200；Caspase-1，1∶5 000；β-actin，1∶5 000)；二抗室溫孵育2 h；TBST洗3 次/10 min。PVDF膜置于發(fā)光液中顯色，室溫靜置反應1 min后曝光拍照，并記錄分析各目的蛋白與內參條帶的灰度值差異值。

1.4 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 千斤拔提取物對急性痛風性關節(jié)炎大鼠關節(jié)腫脹度的影響

造模2 h后，模型組的關節(jié)腫脹度比陰性對照組增加了68.7%[(9.51±2.78)vs.(30.38±4.27)，F=1.242，t=11.58，(P<0.01)]，其他各給藥組也略升高，但無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；隨著造模時間的增加，在6、12 h 時，整體呈升高趨勢，模型組關節(jié)腫脹度分別升高了74.4%[(10.10±2.42)vs.(39.10±3.07)，F=0.105，t=23.44，P<0.01]和76.4%[(9.63±2.45)vs.(40.86±3.13)，F=0.522，t=21.68，P<0.01]；與模型組比較，各治療組關節(jié)腫脹度不同程度的減輕，千斤拔提取物高劑量組最明顯，分別減輕了62.1%[(14.01±2.05)vs.(39.10±3.07)，F=0.993，t=21.48，P<0.01]與64.2%[(15.51±2.56)vs.(40.86±3.13)，F=0.106，t=18.39，P<0.01]，與秋水仙堿組接近。在24 h和48 h時，各組大鼠的關節(jié)腫脹度整體升高，24 h達到最強，之后48 h后有減輕趨勢，與陰性對照組比較，兩個時間點模型組大鼠的關節(jié)腫脹度分別提升了81.1%[(10.63±1.85)vs.(56.14±4.06)，F=5.260，t=28.62，P<0.01]和79.7%[(10.38±1.69)vs.(51.13±2.10)，F=0.324，t=42.81，P<0.01]；其余各組關節(jié)腫脹度升高(P<0.05)。與模型組比較，各治療組關節(jié)腫脹度顯著減輕，有劑量依賴性。在48 h時，千斤拔提取物高劑量組大鼠的關節(jié)腫脹度明顯比模型組減輕，[(27.12±2.42)vs.(51.13±2.10)，F=0.169，t=21.20，(P<0.01)]，與秋水仙堿同一水平[(27.00±2.00)vs.(51.13±2.10)，F=0.072，t=23.53，P<0.01]。提示，千斤拔提取物可減輕急性痛風性關節(jié)炎大鼠關節(jié)腫脹度，其中千斤拔提取物從2 h開始起效，起效快，且作用持久，效果與秋水仙堿相似，見圖1。

注：與陰性對照組比較，#P<0.05，##P<0.05；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.05。圖1 各組關節(jié)腫脹度變化情況Fig 1 Changes of joint swelling in each group

2.2 千斤拔提取物對急性痛風性關節(jié)炎大鼠步態(tài)觀察

造模6 h后，與陰性對照組比較，急性痛風性關節(jié)炎模型組步態(tài)變化明顯升高[(1.04±0.12)vs.(2.85±0.14)，F=0.024，t=30.19，P<0.05]，其他各給藥組的步態(tài)變化也明顯升高，但略低于模型組；在12、24、48 h時，模型組步態(tài)變化持續(xù)上升，到了48 h有下降趨勢；與急性痛風性關節(jié)炎模型組比較，在12、24 h時，千斤拔提取物各組及秋水仙堿組步態(tài)隨著時間的增加而改善，千斤拔提取物高劑量組和秋水仙堿改善最明顯，兩組基本持平[(1.79±0.12)、(1.74±0.16)vs.(3.21±0.16)，F12h=0.503，t12h=22.02；F24h=0.078，t24h=19.91，P<0.05]。在48 h時，包括模型組在內的各組步態(tài)不同程度的改善，但千斤拔提取物高劑量組最明顯[(1.63±0.15)vs.(3.42±0.18)，F=0.278，t=23.62，P<0.05]，與秋水仙堿組步態(tài)改善程度持平[(1.61±0.14)vs.(3.42±0.18)，F=0.431，t=24.66，P<0.05]。綜上提示，千斤拔提取物從12 h開始改善急性痛風性關節(jié)炎大鼠模型的步態(tài)，與秋水仙堿持平，但千斤拔作為傳統(tǒng)中草藥藥效多靶點、副作用小等方面優(yōu)于秋水仙堿。見圖2。

注：與陰性對照組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05。圖2 各組步態(tài)變化情況Fig 2 Gait changes in each group

2.3 千斤拔提取物對急性痛風性關節(jié)炎大鼠關節(jié)液IL-1β、TNF-α、IL-6水平的影響

造模成功48 h后，與陰性對照組比較，急性痛風性關節(jié)炎模型組均明顯升高關節(jié)液中IL-1β、TNF-α、IL-6水平(FIL-1β=9.710，FTNF-α=0.069，FIL-6=2.079，tIL-1β=43.19，tTNF-α=102.71，tIL-6=95.95，P均<0.01)，提示注入尿酸鈉后，炎癥因子升高，炎癥表現明顯。與急性痛風性關節(jié)炎模型組比較，可以看出陽性藥秋水仙堿組關節(jié)液IL-1β、TNF-α、IL-6含量均明顯降低，略高于陰性對照組(FIL-1β=0.712，FTNF-α=0.416，FIL-6=2.779，tIL-1β=32.22，tTNF-α=112.47，tIL-6=91.19，P均<0.01)；而千斤拔提取物(100、150、200 mg/kg)劑量組大鼠關節(jié)液IL-1β、TNF-α、IL-6水平與急性痛風性關節(jié)炎模型組比較，呈劑量依賴性明顯降低，而千斤拔提取物(200 mg/kg)劑量組大鼠關節(jié)液IL-1β、TNF-α、IL-6的含量均最低，略高于陽性藥秋水仙堿組(FIL-1β=0.920，FTNF-α=0.487，FIL-6=1.569，tIL-1β=29.64，tTNF-α=89.12，tIL-6=85.84，P均<0.01)，提示大鼠關節(jié)液IL-1β、TNF-α、IL-6下降水平跟給藥劑量有關，且千斤拔在一定程度上抗炎效果優(yōu)于秋水仙堿，見表1。

表1 千斤拔提取物對各組大鼠滑膜 IL-1β、TNF-α、IL-6 水平的比較Tab 1 Comparison of the levels of IL-1β,TNF-α and IL-6 in the synovium of rats in each

2.4 千斤拔提取物對急性痛風性關節(jié)炎大鼠滑膜組織 NALP3、Caspase-1蛋白表達的影響

成功造模第72小時后，與陰性對照組比較，急性痛風性關節(jié)炎組的滑關節(jié)膜組織中NALP3[(2.91±0.37)vs.(0.32±0.11)]、Caspase-1 [(2.70±0.17)vs.(0.31±0.18)]兩個蛋白表達均明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義[FNALP3=4.321，tNALP3=208.98，PNALP3<0.01；FCaspase-1=1.294，tCaspase-1=300.85，PCaspase-1<0.01]；與急性痛風性關節(jié)炎組比較，陽性對照秋水仙堿組大鼠滑膜組織的 NALP3[(1.23±0.35)vs.(2.91±0.37)]、Caspase-18[(1.09±0.48)vs.(2.70±0.17)]蛋白表達明顯降低(FNALP3=0.011，tNALP3=104.35，PNALP3<0.01)；(FCaspase-1=6.434，tCaspase-1=100.54，PCaspase-1<0.01)；而千斤拔提取物低、中、高劑量給藥組的滑關節(jié)膜組織中兩個蛋白表達均呈劑量依賴性趨勢下降，千斤拔提取物中、高劑量組差異有統(tǒng)計學意義。高劑量組下降幅度接近陽性對照組，見圖3。

注：與陰性對照組比較，#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。A：陰性對照組；B：急性痛風性關節(jié)炎模型組；C：千斤拔提取物(100 mg/kg)組；D：千斤拔提取物(150 mg/kg)組；E：千斤拔提取物(200 mg/kg)組；F：秋水仙堿組圖3 各組踝關節(jié)滑膜組織 NALP3、Caspase-1蛋白表達的影響Fig 3 The influence of NALP3 and Caspase-1 protein expression in ankle joint synovial tissue in each group

3 討論

多年來，急性痛風性關節(jié)炎作為一種遷延性風濕病時刻危害著人類的健康。痛風的發(fā)生由于尿酸鈉結晶在關節(jié)及其周圍組織沉積，之后帶動炎癥級聯反應，如激活巨噬細胞的活性，加速如組胺、1L-1β、TNF-α等炎癥因子的釋放，引發(fā)氧化應激反應，最終使局部血管擴張、增加血管的滲透性，加快釋放、聚集大量的白細胞等非特異性炎癥的連鎖反應[11]。

目前臨床用于治療急性痛風性關節(jié)炎的藥物有限，一般以西藥如秋水仙堿等為主，但使用的藥物在治療的同時都會有一定的不良反應[12,13]。而本研究選用的千斤拔具有鎮(zhèn)痛、抗炎作用，民間用于跌打扭傷的疼痛，臨床療效突出。本實驗結果表明，注射尿酸鈉晶體的模型組大鼠關節(jié)腫脹程度明顯加重，說明激活炎癥級聯反應以及巨噬細胞活性，并使各種趨化因子及炎癥介質的釋放，導致關節(jié)內滲出升高以及滑膜增生和肥厚。而千斤拔提取物幾個濃度能顯著降低急性痛風性關節(jié)炎模型大鼠踝關節(jié)腫脹度以及步態(tài)的變化，該藥理作用可能與鎮(zhèn)痛、抗炎作用相關且藥效呈劑量依賴性。

現研究表明，注射尿酸鹽晶體至關節(jié)腔后可刺激單核巨噬細胞中的IL-1β，而IL-1β作為調節(jié)炎癥的關鍵因素被認為是最經典的炎癥調節(jié)劑[14]。又有研究表明，痛風性關節(jié)炎的患者體內的IL-17含量顯著增加，其與疾病發(fā)生發(fā)展呈正相關，且認為是IL-1β下游促炎因子[15]。而TNF-α在炎癥反應初期就會出現高表達，其可能通過激活細胞因子在炎癥反應中發(fā)揮級聯作用[16]。TNF-α能激活IL-6，而IL-6也影響著TNF-α的活性，兩者形成正反饋的關系，最終加重和持續(xù)炎癥反應的發(fā)生[17]。因此，IL-1β、TNF-α、IL-6 等炎癥因子在痛風性關節(jié)炎中發(fā)揮著重要的作用，在治療該病時，干預以上致炎因子的發(fā)生并且阻斷或抑制其所調控的炎癥過程，對治療痛風性關節(jié)炎有著重要的意義[18]。本實驗顯示，千斤拔提取物通過呈劑量依賴性下調滑膜組織中IL-1β、TNF-α、IL-6的水平，其高劑量組的調控效果與秋水仙堿相近，提示千斤拔提取物能明顯減輕急性痛風性關節(jié)炎大鼠關節(jié)腔內的炎癥反應，且作為傳統(tǒng)中醫(yī)藥如不良反應等方面優(yōu)于秋水仙堿。

NALP3小體是識別內源性危險信號，當注入尿酸鈉晶體時，NALP3的蛋白構象就會發(fā)生變化，并且結合于Caspase-1前體后形成激活狀態(tài)的NALP3炎性體，活化Caspase-1活性，又激活IL-1β的活性，從而激活炎癥信號通路，產生大量如TNF-α、L-6等炎癥因子，從而導致急性痛風性關節(jié)炎的發(fā)作[19,20]。本實驗提示，與正常組比較，模型組踝關節(jié)滑膜組織中NALP3、Caspase-1蛋白的表達均升高，證明NALP3炎性小體的活化參與了急性痛風性關節(jié)炎的發(fā)病過程；本實驗的造模成功，可見大鼠踝關節(jié)炎癥反應明顯。經過藥物干預處理后顯示，千斤拔提取物與秋水仙堿組大鼠的踝關節(jié)滑膜組織中 NALP3、Caspase-1蛋白表達均明顯降低。說明千斤拔通過抑制NALP3炎性小體和Caspase-1的產生作用于急性痛風性關節(jié)炎。略高于秋水仙堿，這可能是由于本實驗的藥物干預時間較短，雖然千斤拔提取物在抑制炎癥因子方面較秋水仙堿略差，但千斤拔提取物對各組大鼠踝關節(jié)滑膜組織中 NALP3、Caspase-1蛋白表達與秋水仙堿組持平，說明千斤拔在抑制NALP3炎性體表達方面能追上秋水仙堿。此外，在實驗過程中觀察各組大鼠的一般情況發(fā)現，與模型組比較，千斤拔提取物各組大鼠一般情況恢復較好，而秋水仙堿組大鼠雖較模型組好但明顯差于千斤拔提取物各組，說明千斤拔在治療急性痛風性關節(jié)炎時能在一定程度上改善大鼠的精神、飲食、皮毛等一般狀態(tài)，較秋水仙堿有一定的優(yōu)勢。

本研究通過千斤拔提取物對急性痛風性關節(jié)炎模型大鼠的干預，發(fā)現其具有一定的的治療效果，其作用機制可能為有效地抑制NLRP3炎性小體的激活與降低Caspase-1的活性、改善急性痛風性關節(jié)炎的炎性反應，為臨床用藥提供了依據。雖然本研究對千斤拔提取物干預急性痛風性關節(jié)炎有一定療效以及初步探討一些作用機制，但探討還不夠深入、全面，仍需往后進一步完善。