張玉笑 ，馬陽歷，郭衍銀*，陳勇，劉莎莎，員麗蘋，張新華，高霞，李彤

（1.山東理工大學(xué)農(nóng)業(yè)工程與食品科學(xué)學(xué)院，山東淄博 255049；2.山東省農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣總站，山東濟南 250100；3.山東七河生物科技股份有限公司，山東淄博 255100）

香菇（Lentinus edodes）是世界上第二大栽培食用菌，味道鮮美，營養(yǎng)豐富，含有多種生物活性物質(zhì)，如多糖、維生素、麥角甾醇、葉酸、礦物質(zhì)、膳食纖維等，具有藥食同源的特點，被譽為“菇中之王”[1-3]。但新鮮香菇含水量極高，代謝旺盛，又無表皮保護組織，采后常出現(xiàn)褐變、腐爛、軟化、開傘和異味等不良現(xiàn)象，常溫下僅能貯藏1～2 d[4]。

低溫貯藏結(jié)合氣調(diào)保鮮是一種極為有效的食用菌保鮮方法，通過控制貯藏環(huán)境的溫度、氣體成分及比例來維持產(chǎn)品品質(zhì)，延長其貯藏期[5]。研究發(fā)現(xiàn)，低O2、高CO2能抑制呼吸速率及代謝活動，維持產(chǎn)品品質(zhì)[6-7]。但由于香菇的呼吸速率遠(yuǎn)高于其他果蔬[8]，環(huán)境中的O2很容易在短時間內(nèi)被消耗完，生成的高濃度CO2則會使香菇出現(xiàn)CO2傷害、異味等現(xiàn)象[9]；同時低O2環(huán)境容易引發(fā)香菇采后微生物腐爛[10]。而高氧、高二氧化碳自發(fā)氣調(diào)（AMAP）的提出則巧妙地解決了這一問題，通過高O2與高CO2的聯(lián)合作用，高O2緩解了CO2傷害和無氧呼吸產(chǎn)生的異味[11]，該技術(shù)在西蘭花[12]、生姜[13]保鮮方面取得了很好的效果，也有研究表明80%O2+20%CO2處理能顯著抑制細(xì)菌、霉菌的生長[14-15]。本試驗通過向密閉容器內(nèi)充入不同濃度配比的O2/CO2，研究了O2/CO2AMAP 對香菇采后的保鮮效果，以便尋找適宜的O2/CO2比例，為O2/CO2AMAP在香菇保鮮中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

香菇自山東省淄博市淄川區(qū)七河生物科技有限公司購買，上午（氣溫平均在10～12 ℃）采摘后在1 h 內(nèi)冷鏈運送至山東理工大學(xué)，置于（4±1）℃、相對濕度90%的冷庫預(yù)冷24 h 后，選取菌蓋直徑5～6 cm、顏色黃褐、無機械傷、無病蟲害、菌褶完整且均一的香菇進行試驗。

茚三酮、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉，上海展云化工試劑有限公司；考馬斯亮藍、偏磷酸、甲醇、福林酚，天津致遠(yuǎn)化學(xué)藥劑有限公司；碳酸鈉、沒食子酸、鄰苯二酚，天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；硫代巴比妥酸、氯化鈉、磷酸、三氯乙酸、95%乙醇、無水乙醇，國藥集團化學(xué)試劑有限公司。所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1750 紫外可見分光光度計，島津國際貿(mào)易有限公司；MR-07825-00 O2/CO2測定儀，美國FBI Dansensor公司；DDS-307A 電導(dǎo)率儀，上海精科雷磁儀器；DHG-9070A 型電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；TA-XT Plus 型質(zhì)構(gòu)儀，英國stablemicrosystems 公司；HL-2136 色差儀，上海瑞戈實業(yè)有限公司；pHS-3C pH 計，合肥恒龍儀器儀表有限公司；GL-20G-2 臺式高速冷凍離心機，上海安亭儀器制造廠；LC-3000N 超聲波細(xì)胞破碎儀，上海聯(lián)鯨電子科技有限公司。

1.3 試驗設(shè)計

將挑選后的香菇分成5 組裝入氣調(diào)箱（302.9 mm×243.8 mm×243.8 mm），每箱裝入3.8 kg 左右香菇、15 袋干燥劑（6 g/袋）和4 袋乙烯脫除劑（10 g/袋），并分別置換充入70% O2+30% CO2（處理1）、80% O2+20% CO2（處理2）、90%O2+10%CO2（處理3）、100%（處理4）和空氣（CK），充入氣體體積約為香菇體積的3 倍。每組設(shè)置3個平行，共15 個氣調(diào)箱，于（4±1）℃下貯藏18 d，每3 d取樣一次，測定相關(guān)指標(biāo)。當(dāng)香菇出現(xiàn)嚴(yán)重褐變、軟化或異味后，即判定為失去商品價值，終止貯藏[16]。

1.4 指標(biāo)測定

1.4.1 O2、CO2濃度、呼吸速率

使用O2/CO2測定儀測定氣調(diào)箱內(nèi)頂空氣體。用O2/CO2測定儀測取樣前氣調(diào)箱3 h 內(nèi)CO2含量的變化，單位為mg/(kg·h)。

1.4.2 失重率

失重率為香菇氣調(diào)處理前后質(zhì)量的比值，以%表示。

1.4.3 白度（L*）

參照Xu 等[17]的方法。隨機取6 個香菇，用色差計測定香菇菌蓋邊緣3 個等距點的L*值。

1.4.4 相對電導(dǎo)率

參照Li 等[18]的方法。用直徑6mm的打孔器隨機取2 g香菇菌蓋，加25mL蒸餾水，用電導(dǎo)率儀測其電導(dǎo)率（P0）；25℃保溫1 h 后測其電導(dǎo)率（P1）；沸水浴30 min，再冷卻至25 ℃后測其電導(dǎo)率（P2）。相對電導(dǎo)率計算公式見式（1）。

1.4.5 丙二醛（MDA）

參照Hu 等[19]的方法，取1 g 香菇菌蓋，5 mL TCA 研磨，5 000 r/min 離心15 min 后，吸取2 mL 上清液，置于10 mL 離心管中，再加入2 mL TBA 和2 mL 蒸餾水，沸水浴15 min 顯色，自然冷卻于5 000 r/min 離心10 min，并在600、532、450 nm 波長下測定其吸光度。

1.4.6 總酚

參照Li 等[18]的方法。取2 g 香菇菌蓋，10 mL 95%甲醇冰浴研磨后，20 ℃下超聲波破壁1 h，10 000 r/min 低溫離心25min 后，提取上清液；然后向濾渣中再次加入10 mL 95%甲醇，重復(fù)上述步驟，將兩次上清液混合。取0.4 mL上清液，加入2 mL福林酚試劑（現(xiàn)配現(xiàn)用），避光反應(yīng)5 min后，再加入1.6 mL 7.5%碳酸鈉溶液，暗處放置1 h 后在765 nm 波長下測定其吸光度?？偡雍坑脹]食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線定量表示為干物質(zhì)質(zhì)量（mg GAE/g）。

1.4.7 多酚氧化酶（PPO）

參照WANG等[20]的方法。取1g香菇菌蓋，5mL0.1mol/L、pH7.0 磷酸鹽緩沖液冰浴研磨，12000r/min 低溫離心20min后提取上清液備用。反應(yīng)液制備：1.95 mL0.1 moL/L、pH7.0磷酸鹽緩沖液+0.5 mL、0.7 moL/L 鄰苯二酚。向反應(yīng)液中加入50 μL 上清液，搖勻后立刻用紫外-可見分光光度計在410 nm 波長下測定其3 min 內(nèi)的吸光值變化。1 個酶活單位（U）定義為每分鐘內(nèi)使吸光值改變0.001 所需要的酶量。

1.4.8 乙醇和乙醛

參照徐呈祥等[21]的方法，采用靜態(tài)頂空氣相色譜法進行測定。設(shè)備參數(shù)：色譜柱為DM-FFAP（30 m×0.53 mm×1.5 μm）；升溫程序：40 ℃維持2 min，以2 ℃/min 的速度加熱至50 ℃后，以3 ℃/min 的速度升溫至100 ℃并維持2 min；以He 為載氣；流速為1.5 mL/min，進樣量為1 mL；分流比為10:1；進樣口與檢測器溫度分別為180 ℃和220 ℃。

1.4.9 感官評價

本研究從消費者角度選擇了衡量香菇感官品質(zhì)的指標(biāo)，包括菌褶均勻度、菌蓋均勻度、硬度、菌蓋是否有暗斑以及染菌率。香菇從氣調(diào)箱中取出后，在室溫下轉(zhuǎn)移至密封、無異味的塑料小桶，并在1 h 內(nèi)由經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)的10人感官評價小組對除染菌率以外的其他指標(biāo)進行評分，評分標(biāo)準(zhǔn)見表1。評估后，將香菇在25 ℃下敞口放置3 d后，統(tǒng)計出現(xiàn)采后微生物病害的香菇數(shù)量，將其與總量的比值記為染菌率。

表1 香菇感官品質(zhì)評分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory scores standard of shiitake mushrooms

1.5 數(shù)據(jù)處理

所得數(shù)據(jù)用SPSS 19.0 軟件進行LSD 顯著性分析及相關(guān)性分析（P＜0.05），并用Excel 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 O2/CO2 AMAP 對氣調(diào)箱內(nèi)CO2、O2 濃度和香菇呼吸速率的影響

由圖1A、B 所示，各處理的CO2濃度在貯藏前期迅速升高，之后進入平衡期，而O2濃度的變化趨勢與其相反。處理1 貯藏6 d 后達到平衡期，此時CO2濃度達75.3%，顯著高于其他處理（P＜0.05）；處理2、3、4 貯藏9 d后達到平衡期（70%～75%CO2和25%～30%O2）；CK 處理O2含量迅速降低，第3 d 時僅有1.8%，表明此時氣調(diào)箱內(nèi)的O2已經(jīng)基本被香菇通過有氧呼吸轉(zhuǎn)化成CO2。

如圖1C 所示，各處理香菇的呼吸速率在初期急劇下降，處理1 在貯藏12 d 達到呼吸高峰，呼吸速率為19.8 mg/(kg·h)，而處理2、3、4 在15 d 才達到呼吸高峰，呼吸速率分別為18.6、13.2、14.4 mg/(kg·h)，這表明適宜比例的O2/CO2氣體對香菇呼吸速率有一定的抑制效果，能夠推遲呼吸高峰的出現(xiàn)。CK 則沒有出現(xiàn)呼吸高峰，這可能與其產(chǎn)生的高CO2和過低O2有關(guān)。

2.2 O2/CO2 AMAP 對香菇失重率的影響

失重率隨貯藏時間的延長呈增加趨勢（圖2）。處理3和處理4 在12 d 后失重率增速減緩，18 d 時分別為1.84%和1.87%，均低于CK 和處理1 在15 d 的失重率2.26%和2.34%，說明適宜比例的O2/CO2AMAP 能顯著抑制香菇質(zhì)量的降低（P＜0.05）。這可能與貯藏環(huán)境中高CO2導(dǎo)致的低呼吸強度以及高相對濕度引起的低水分散失有關(guān)。另外，CK 處理在15 d 后，由于香菇已經(jīng)出現(xiàn)嚴(yán)重褐變和異味，失去商品價值，故終止取樣。

2.3 O2/CO2 AMAP 對香菇白度（L*值）的影響

香菇的褐變通常被認(rèn)為是失水、微生物活動和以PPO 為主的氧化作用的結(jié)果[22]。隨著貯藏時間的延長，各處理的L*值逐漸降低（圖3）。其中，CK 和處理1 的L*值下降速度最快，與處理2、3、4 之間均差異顯著（P＜0.05）。貯藏15 d 時，CK、處理1、處理2、處理3 和處理4 白度的平均值分別為38.08、37.87、42.33、44.87 和42.99，表明處理3 能夠較好地維持香菇的L*值。

2.4 O2/CO2 AMAP 對相對電導(dǎo)率和MDA 含量的影響

相對電導(dǎo)率的大小反映了細(xì)胞膜的完整程度，膜透性的增加會使PPO 等氧化酶與酚類物質(zhì)接觸，進而導(dǎo)致褐變的發(fā)生。如圖4A（見下頁）所示，各處理的相對電導(dǎo)率隨貯藏時間的延長呈上升趨勢。處理3 的相對電導(dǎo)率最低，其次為處理4，處理1 最高，CK 與處理2 差異不顯著（P＞0.05）。這可能是因為高CO2對細(xì)胞膜造成的損傷，使得CK、處理1 和處理2 相對電導(dǎo)率較高，而對于其他處理，適宜比例的高O2在一定程度上緩解了CO2傷害。各處理香菇L*值的降低趨勢也證實了這一點。

MDA 是膜脂過氧化反應(yīng)的產(chǎn)物，其含量的積累會對細(xì)胞膜造成損傷，加速細(xì)胞老化。在整個貯藏期內(nèi)，各氣調(diào)處理的MDA 基本呈增加趨勢（圖4B）。CK 處理的MDA 含量顯著高于其他處理（P＜0.05）；處理3 和處理4的MDA 含量一直維持在較低水平。

2.5 O2/CO2 AMAP 對總酚含量和PPO 活性的影響

酚類物質(zhì)是香菇中天然的抗氧化成分，其含量與香菇褐變密切相關(guān)[23]。如圖5A 所示，總酚含量在第3 d 稍有下降，然后迅速上升。第3 d 總酚含量的降低可能是高O2的存在促進酚類物質(zhì)氧化所致。3 d 后，CK、處理1、處理2、處理3 和處理4 的總酚含量分別增加了30.8%、93.4%、108.2%、142.9%和123.9%，這可能是高CO2脅迫產(chǎn)生的活性氧作為信號因子激活了香菇體內(nèi)的初級代謝和次級代謝，促進了酚類物質(zhì)的合成所致[24]。

PPO 是引起香菇褐變的關(guān)鍵酶[23]。在整個貯藏期間，各處理PPO 活性在初期迅速降低，9 d 后趨于穩(wěn)定（圖5B）。其中CK處理的PPO活性一直處于最高水平，處理3、4在貯藏后期顯著低于其他處理（P＜0.05）。18d 時，處理3、4 的PPO活性僅為入貯時的13.3%和16.7%。

2.6 O2/CO2 AMAP 對香菇乙醇和乙醛含量的影響

在整個貯藏期內(nèi)，各處理的乙醇含量呈先升高后降低的趨勢（圖6A）。CK、處理2 和處理4 在9 d 達到峰值，分別為652、504、456 mg/kg；而處理1 和處理3 在12 d 達到峰值，分別為763、286 mg/kg，處理1 的峰值顯著高于其他處理（P＜0.05）。另外，處理3、4 在6 d 前乙醇含量增加緩慢，說明香菇在貯藏初期的無氧呼吸并不嚴(yán)重；但CK處理在3d 時乙醇含量比入貯時增加306.7%，這與氣調(diào)箱內(nèi)O2耗盡導(dǎo)致香菇出現(xiàn)無氧呼吸的結(jié)論一致（圖1A）。

各處理乙醛含量隨貯藏時間的延長呈增加趨勢（圖6B）。其中，CK 和處理1 的增速最快，15 d 時達到233、184 mg/kg；處理2、處理3 和處理4 的增速較慢，15 d 時含量分別為110、93、103 mg/kg。與乙醇含量變化趨勢類似，處理3 和處理4 在9 d 前乙醛含量增加緩慢。9～15 d內(nèi)，各處理的乙醛含量迅速增加，而乙醇含量達到峰值后開始下降，這可能是因乙醇經(jīng)乙醇脫氫酶（ADH）反向催化生成乙醛所致[25]。

2.7 O2/CO2 AMAP 對香菇感官品質(zhì)的影響

如表2（見下頁）所示，香菇的菌褶均勻性、菌蓋均勻性、暗斑、硬度和染菌率均隨貯藏時間的延長出現(xiàn)顯著性差異（P＜0.05），驗證了這些指標(biāo)用來評價香菇感官品質(zhì)的有效性。CK 和處理1 貯藏6 d 后，其硬度迅速下降，暗斑增加，12 d 時菌蓋均勻度分別為4.98 分和5.15 分，而處理2、處理3 和處理4 直至貯藏末期都沒有劣變至這個強度。處理2 對均勻度的維持效果較好，但是對延緩硬度降低及暗斑出現(xiàn)的能力較弱；處理3 對感官品質(zhì)退化的抑制效果最好，但與處理4 并無顯著性差異（P＞0.05）。CK、處理1 和處理2 在12 d 內(nèi)抑菌效果逐漸增強，但隨后染菌率升高（多為白色霉菌），這可能是因為后期香菇品質(zhì)劣變，細(xì)胞膜等結(jié)構(gòu)出現(xiàn)嚴(yán)重?fù)p傷，使霉菌等致病菌迅速大量繁殖，從而出現(xiàn)霉菌病害。而處理3 和處理4 的抑菌效果與其它處理均有顯著性差異（P＜0.05），說明合適比例的O2/CO2AMAP 在處理期間與后續(xù)貯藏過程中均有很好的抑菌效果。

3 討論

自發(fā)氣調(diào)由于是一個密閉環(huán)境，不存在內(nèi)外氣體的交換[26]，因此氣調(diào)箱內(nèi)充入初始?xì)怏w的成分和比例與香菇呼吸消耗O2生成CO2過程密切相關(guān)。本研究中，處理2、3、4 在貯藏9 d 后氣調(diào)箱內(nèi)氣體成分達到70%～75%CO2、25%～30%O2的平衡狀態(tài)，可能正是這種平衡的形成和維持較好地控制了香菇的代謝活動及后熟衰老的出現(xiàn)，使其品質(zhì)顯著優(yōu)于CK 和處理1。此時的CO2濃度比CK 處理高30%左右，但其相對電導(dǎo)率和MDA 含量反而低于CK，進一步說明了高O2在一定程度上可以緩解CO2對細(xì)胞膜帶來的傷害[12]。

Benito-Román 等[27]和Li 等[28]的研究表明，高壓CO2可能通過改變PPO 的三級結(jié)構(gòu)或干擾PPO 的疏水活性位點使其失活。高壓的目的主要是使CO2轉(zhuǎn)化成超流體狀態(tài)，以增加其在水溶液中的溶解度。本研究中，CO2濃度在貯藏中期達到80%左右，香菇直接暴露在高CO2環(huán)境中，使PPO 活性在貯藏期間持續(xù)降低，至貯藏后期近乎失活。與上述結(jié)論一致，這也使得香菇內(nèi)生成的酚類物質(zhì)不會因PPO 氧化而損失[29]，進而有效抑制香菇褐變[30]。蘑菇抗氧化能力大小主要取決于酚類物質(zhì)的含量，抗氧化能力的增強提高了香菇對活性氧、自由基等的清除能力，進而降低了細(xì)胞膜受到的氧化損傷，延緩了MDA 和相對電導(dǎo)率的升高，維護了細(xì)胞膜的完整性[31]。此外，氣調(diào)環(huán)境的高濕度和強抑菌能力，避免了因失水和微生物侵染而導(dǎo)致的褐變出現(xiàn)[32]。因此適宜初始比例的O2/CO2AMAP能很好地維持香菇的L*值。

香菇含水量一般在85%～95%，天然的高水分含量為微生物提供了理想的環(huán)境，且香菇栽培多依賴堆肥，受到微生物侵染的可能性極高，大量微生物的存在使香菇出現(xiàn)褐變、斑點和腐爛等現(xiàn)象[33-34]。適宜的AMAP 氣調(diào)是對香菇細(xì)胞膜完整性的保護，提高了香菇的抑菌能力。劉莎莎等[14]和Hoogerwerf 等[15]的研究表明，合適比例的O2/CO2AMAP 可通過活性氧傷害抑制體外致病菌活性，且效果隨CO2濃度的增加而增強。由于果蔬呼吸產(chǎn)生的高CO2，本試驗結(jié)果進一步證實了O2/CO2AMAP 在活體內(nèi)對致病菌同樣具有抑制能力。

表2 O2/CO2 AMAP 對香菇感官品質(zhì)的影響（分）Table 2 Effects of O2/CO2 AMAP on sensory quality of mushrooms during storage(score)

適宜比例的AMAP 可能通過抑制無氧呼吸途徑中關(guān)鍵酶的活性降低乙醇、乙醛的產(chǎn)生，既緩解了高CO2帶來的異味等不良影響，又減少了乙醇、乙醛對細(xì)胞膜產(chǎn)生的損傷，維護了細(xì)胞膜的完整性，這正是處理3 和處理4 能夠在整個貯藏期間維持香菇硬度的原因。同時，Tian 等[35]研究表明，高O2的條件下適量乙醇在ADH 反向催化生成乙醛有益于香菇品質(zhì)的維持，這同樣可能是高O2緩解CO2傷害的一個重要途徑。

4 結(jié)論

綜上所述，適宜比例的O2/CO2AMAP 可以抑制香菇的呼吸，增加總酚含量，抑制PPO 的活性，以及MDA 和相對電導(dǎo)率的增加，維持細(xì)胞膜的完整性，從而延緩了褐變和軟化，并顯著降低了采后病害的發(fā)生；而不適宜的O2/CO2AMAP 比例，如處理1，反而加速了香菇軟化、褐變、異味和后熟的出現(xiàn)，縮短了香菇的貯藏期。本試驗條件下，處理3（90%O2＋10%CO2）具有最好的保鮮效果和抑菌能力。