陳元堃，曾 奧，何樹苗，賀思晴，李春梅，盧 群

（廣東藥科大學(xué) 生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，廣東 廣州 510002）

肝細胞癌是肝臟中最常見的原發(fā)性惡性腫瘤，是導(dǎo)致肝硬化患者死亡的主要原因之一，其病死率在所有的惡性腫瘤中排名第三[1]。據(jù)報道，每年約有84萬人患肝細胞癌，其中約78萬人死亡。發(fā)展中國家肝細胞癌的患病率極高，且呈現(xiàn)患病男性多于女性的趨勢[2]。當(dāng)前肝細胞癌主要以手術(shù)切除為主要的治療方案，但這僅僅是早期患者的選擇，肝細胞癌晚期患者錯過了手術(shù)的最佳時期，只能采用化療、介入等手段進行治療，且預(yù)后也并不樂觀[3]。近年來，科研人員對腫瘤的研究已逐步進入分子水平，在分子水平上對肝細胞癌的發(fā)生及發(fā)展進行了深入的研究，為肝細胞癌的診斷、治療和預(yù)防提供了新的思路。目前肝細胞癌的多種治療手段仍有缺陷及局限性，故綜合治療開始受到更多臨床醫(yī)生的重視。

在肝細胞癌的治療中，中藥治療具有獨特的優(yōu)勢和療效，是中西醫(yī)結(jié)合治療中極其重要的一部分[4，5]。雙蓮方是由半枝蓮、半邊蓮及夏枯草三味中藥組合而成的新方劑，在臨床上廣泛運用于肝細胞癌的治療[6]。據(jù)報道，組成雙蓮方的三味中藥對腫瘤細胞均有抑制作用[7，8]。在過去的幾年里，生物信息學(xué)和微陣列技術(shù)被廣泛應(yīng)用于挖掘多種疾病的多種靶點，幫助研究者識別差異表達的基因和可能的信號通路。目前，對于雙蓮方中具體有效成分治療肝細胞癌的潛在作用機制未見系統(tǒng)性報道，故本研究結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及生物信息學(xué)分析雙蓮方中的主要活性成分，預(yù)測其作用靶點，探索雙蓮方治療肝細胞癌的分子機制，為傳統(tǒng)中醫(yī)藥治療肝細胞癌提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 獲取微陣列數(shù)據(jù)

本研究以“hepatocellular carcinoma”為關(guān)鍵詞，從GEO 數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中搜索得到GSE121248數(shù)據(jù)集，數(shù)據(jù)集共有107個樣本（包括37個鄰近組織的正常樣本和70個肝細胞癌樣本）。根據(jù)網(wǎng)站中的平臺注釋文件，將其探針轉(zhuǎn)化為相對應(yīng)的基因符號（Gene symbol）。

1.2 篩選差異表達基因

利用Bioconductor中的limma包對收集到的芯片進行差異基因分析及校正，篩選條件設(shè)定為P＜0.01，差異倍數(shù)（FC）＞2。若一個基因出現(xiàn)多行，則對其取均值。利用R語言將其中表達上調(diào)及下調(diào)的基因逐個篩選出來。

1.3 雙蓮方主要成分的獲取及篩選

通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫及在線分析平臺TCMSP（http://tcmspw.com/tcmsp.php）收集半枝蓮、半邊蓮、夏枯草的主要活性成分。以生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18 作為篩選條件來篩選候選的活性成分。

1.4 潛在靶點的預(yù)測及篩選交集基因

利用Perl腳本篩選出候選活性成分的作用靶點，剔除沒有對應(yīng)活性成分的靶點。通過R腳本將前文獲得的疾病差異表達基因與藥物作用靶點取交集。將獲得的交集部分以及中藥、候選活性成分整合為“network”“node”文件，將其導(dǎo)入Cytoscape_v3.7.2中構(gòu)建藥物-活性成分-作用靶點的網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

利用Cytoscape_v3.7.2的插件BisoGenet構(gòu)建前文獲得的交集靶點的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI網(wǎng)絡(luò)），用插件CytoNCA分析PPI網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點的重點網(wǎng)絡(luò)特征，依據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓撲的理念選出此網(wǎng)絡(luò)中的重要節(jié)點。篩選條件為：度中心性（DC）大于全部DC節(jié)點中位數(shù)的2倍，介度中心性（BC）、接近中心性（CC）均大于節(jié)點對應(yīng)值中位數(shù)。

1.6 KEGG和GO富集分析

將交集靶點導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫中，于基因列表中輸入交集靶點的集合，基因標(biāo)示符檢選官方基因符號，背景欄選擇物種為人，最后選功能富集工具進行GO、KEGG通路的富集分析，并應(yīng)用Cytoscape_v3.7.2進行可視化。

2 結(jié)果與分析

2.1 肝細胞癌差異基因的挖掘

通過R語言分析肝細胞癌組織與鄰近正常組織后共得到580個差異表達基因，其中有167個上調(diào)基因，有413個下調(diào)基因，用上調(diào)及下調(diào)最顯著的各20個差異基因繪制聚類熱圖，見圖1。

圖1 肝細胞癌差異基因的聚類熱圖（紅色表示上調(diào)差異基因，綠色表示下調(diào)差異基因，C表示鄰近正常樣本，T表示癌癥樣本）Figure 1 Clustering heat map of differential gene in HCC (red:up-regulated gene.blue:down-regulated gene.C:adjacent normal sample.T:tumor sample)

2.2 收集及篩選雙蓮方中候選化學(xué)成分

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索收集到94個半枝蓮的化學(xué)成分、71個半邊蓮的化學(xué)成分和60個夏枯草的化學(xué)成分。對得到的各中藥化學(xué)成分依據(jù)OB ≥30%、DL ≥0.18的條件進行篩選，并剔除沒有靶點的化學(xué)成分，共得到50個有效的活性成分，其中半邊蓮有17個，半枝蓮有29個，夏枯草有11個。其中槲皮素（quercetin）、木犀草素（luteolin）同時存在于半邊蓮、半枝蓮、夏枯草中，山柰酚（kaempferol）存在于半邊蓮與夏枯草中，而β-谷甾醇（beta-sitosterol）、豆甾醇（stigmasterol）存在于半枝蓮與夏枯草中，具體成分見圖2。

圖2 雙蓮方藥物-活性成分網(wǎng)絡(luò)圖Figure 2 Drug-active ingredient network of Shuanglianfang

2.3 收集靶點

利用TCMSP數(shù)據(jù)庫收集得到半枝蓮、半邊蓮、夏枯草中50個化學(xué)成分的對應(yīng)靶點共1 385個，其中半邊蓮有417個，半枝蓮有591個，夏枯草有377個。研究發(fā)現(xiàn)，存在多個藥物共同擁有多個靶點、一個活性成分對應(yīng)多個靶點和多個活性成分對應(yīng)一個靶點的情況。將雙蓮方活性成分作用靶點與肝細胞癌差異基因匹配之后，共得到28個雙蓮方治療肝細胞癌的潛在靶點，見表1。

表1 雙蓮方治療肝細胞癌的潛在靶點Table 1 Potential targets of Shuanglianfang in the treatment of HCC

2.4 藥物-活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析

利用Cytoscape構(gòu)建藥物-活性成分-作用靶點網(wǎng)絡(luò)，見圖3。網(wǎng)絡(luò)中有63個節(jié)點及83條邊，節(jié)點為活性成分及靶點基因，邊為它們之間的相互關(guān)系。從圖3可以發(fā)現(xiàn)，三種藥物中的活性成分對多個靶點有作用，存在一個活性成分對多個靶點起作用和多個活性成分對一個靶點有作用的情況，體現(xiàn)了雙蓮方多成分、多靶點相互協(xié)同治療肝細胞癌的特點。

2.5 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

通過Cytoscape_v3.7.2 的插件BisoGenet 構(gòu)建交集靶點調(diào)控的蛋白質(zhì)之間的相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)（數(shù)據(jù)源于DIP、BIND、HPRD、MINT、INTACT、BIOGRID 數(shù)據(jù)庫），見圖4。網(wǎng)絡(luò)中共有1 439 個蛋白和27 515 條相互關(guān)系通道。以這1 439 個蛋白做進一步的CytoNCA 分析，篩選的參數(shù)包括DC、BC、CC、NC、LAC。通過網(wǎng)絡(luò)拓撲分析篩選出14個關(guān)鍵節(jié)點和91個關(guān)系，篩選過程見圖4（A）。將其導(dǎo)入STRING構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，見圖4（B）。圖4（C）中，檢索基因調(diào)控的蛋白質(zhì)為紅色，有相互作用的蛋白質(zhì)為藍色。結(jié)果提示雙蓮方可能通過影響這些關(guān)鍵節(jié)點起到治療肝細胞癌的作用。

圖3 雙蓮方藥物-活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)Figure 3 Drug-active ingredient-target network

圖4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)Figure 4 Protein interaction network

圖4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（續(xù)）Figure 4 Protein interaction network（continued）

2.6 GO富集分析

通過DAVID 對交集靶點進行GO 富集分析，得到314個富集結(jié)果，其中生物過程（BP）有286個，主要涉及激素代謝過程、細胞對無機物的反應(yīng)過程、類固醇分解代謝過程等方面；細胞成分（CC）有5個，主要涉及蛋白激酶復(fù)合物、絲/蘇氨酸蛋白激酶復(fù)合物、細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶全酶復(fù)合物等；分子功能（MF）有23個，主要涉及細胞因子活性、趨化因子活性、趨化因子受體結(jié)合等。CC的前五項富集結(jié)果及BP、MF的前10項富集結(jié)果見圖5。

圖5 GO富集結(jié)果Figure 5 GO enrichment results

2.7 KEGG富集分析

通過DAVID對交集靶點進行KEGG富集分析，得到13條富集結(jié)果，其中與肝細胞癌有關(guān)的通路主要有腫瘤壞死因子信號通路（TNF signaling pathway）、P53信號通路（p53 signaling pathway）、Toll 樣受體信號通路（Toll-like receptor signaling pathway）、細胞周期信號通路（cell cycle）等（表2），說明雙蓮方可能通過以上通路治療肝細胞癌。將獲得的結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape_v3.7.2繪制作用靶點-信號通路網(wǎng)絡(luò)圖（圖6）。

表2 KEGG富集結(jié)果Table 2 KEGG enrichment results

圖6 靶點-信號通路網(wǎng)絡(luò)圖Figure 6 Target-signal pathway network

3 討論

導(dǎo)致肝細胞癌的病因有很多，如生活習(xí)慣、遺傳及理化因素等[9]，這些因素可能會對肝細胞中某些特定靶點起作用，進而影響相關(guān)的信號傳導(dǎo)通路，使基因表達異常[10，11]。因為有多種信號分子參與，涉及到多條復(fù)雜的信號通路，科研人員難以對肝細胞癌細胞中信號的輸出情況作出準(zhǔn)確的認識及判斷，針對于單個分子靶點的研究策略有很大的局限性[12]。因此，本研究結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及生物信息學(xué)的方法篩選雙蓮方治療肝細胞癌的活性成分，得到其中的作用靶點后繪制藥物-活性成分-靶點的網(wǎng)絡(luò)圖，分析GO、KEGG 富集結(jié)果，確定了雙蓮方在分子層面的靶點，預(yù)測出藥物治療肝細胞癌的有效成分及作用機制。

本研究根據(jù)顯著性差異表達情況應(yīng)用生物信息學(xué)的方法篩選出580個差異表達的基因，這些基因的表達改變與肝細胞癌的發(fā)生和發(fā)展有重要關(guān)系。從TCMSP中獲取數(shù)據(jù)并篩選后得到雙蓮方的50個化學(xué)成分及1 385個作用靶點，其中雙蓮方中涉及靶點較多的化合物主要為槲皮素（quercetin）、木犀草素（luteolin）、山奈酚（kaempferol）等黃酮類化合物，說明這些化合物是雙蓮方中的主要活性物質(zhì)。黃酮類化合物可通過調(diào)節(jié)增殖、分化、凋亡、炎癥、血管生成、轉(zhuǎn)移等途徑中的各種酶和受體來減弱及抑制腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[13]。槲皮素是一種明星抗癌化合物，可通過抑制Caspase/Cyto-c、AP-2β/hTERT、NF-κB/COX-2途徑及阻斷Akt/ERK1/2信號通路起到治療肝細胞癌的作用，近年來相關(guān)研究較多[14-16]。木犀草素可作用于P53蛋白，使Bax表達增高，Bcl-2表達降低，促使Casepase3激活及PARP裂解，最終導(dǎo)致肝細胞癌細胞凋亡[17，18]。山奈酚對腫瘤的耐藥性具有逆轉(zhuǎn)作用，可通過影響Wnt/β-catenin通路使肝細胞癌細胞分化受阻[19]。

本研究通過活性成分-靶點及靶點-信號通路分析發(fā)現(xiàn)，在篩選出的28個潛在靶點中，PTGS2、CDK1、Cfos等能夠影響細胞周期、機體代謝、機體免疫、信號傳導(dǎo)、腫瘤的新生血管生成等，與肝細胞癌的發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)，可作為雙蓮方治療肝細胞癌的關(guān)鍵潛在靶點。PTGS2為前列腺素合成反應(yīng)的限速酶，又稱為環(huán)氧合酶-2（COX-2），在心血管疾病、癌癥等多種疾病中發(fā)揮重要作用[20，21]。COX-2參與肝細胞癌早期發(fā)生，COX-2低表達時與低分化的肝細胞癌組織相關(guān)，其過表達時與高分化的肝細胞癌組織相關(guān)，COX-2可促使VEGF表達增高、血管生成及PGE2的生成，激活抗凋亡通路Akt/PKB及誘導(dǎo)Bcl-2表達從而抑制凋亡，COX-2表達下調(diào)可能是治療肝細胞癌的手段之一，阿司匹林、塞來昔布等多種COX-2抑制劑表現(xiàn)出優(yōu)異的肝細胞癌治療效果[22-24]。CDK 是一種對細胞周期及增殖有重要作用的激酶，多種腫瘤中均有過表達的CDK1/cyclinB，近幾年成為抗腫瘤的重要靶點，抑制其表達對防治腫瘤有重要意義[25]。C-fos形成AP-1后可激活下游的通路，促進多種腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲等，其表達增高與肝細胞癌的發(fā)生與發(fā)展有重要關(guān)系[26]。

本研究通過建立蛋白互作網(wǎng)絡(luò)和拓撲分析得到14個關(guān)鍵的蛋白節(jié)點和91條相互關(guān)系，提示雙蓮方是通過作用于這些關(guān)鍵蛋白從而影響相關(guān)通路以發(fā)揮作用。在進行GO和KEGG 的富集后發(fā)現(xiàn)半枝蓮、半邊蓮、夏枯草中的活性分子與肝細胞癌細胞的多種代謝過程、刺激反應(yīng)及生物調(diào)節(jié)有關(guān)，可通過調(diào)節(jié)P53信號通路、TNF信號通路、Toll樣受體信號通路等影響肝細胞癌細胞的增殖、遷移及分化等過程。P53是機體內(nèi)一種重要的抑癌基因，正常狀態(tài)下不僅能維持細胞的正常生長還可抑制細胞的惡性增殖，當(dāng)P53突變或失活時可啟動腫瘤的發(fā)生。Li等研究發(fā)現(xiàn)高表達的SNHG1可通過與DNMT1結(jié)合靶向抑制P53的表達從而促進肝細胞癌細胞的增殖及侵襲，表明P53信號通路的激活可能對治療肝細胞癌有重要意義[27]。Zanoaga等發(fā)現(xiàn)駱駝蓬堿可通過影響P53/P21信號通路抑制肝細胞癌細胞活力，增加其死亡[28]。TNF-α是參與多種腫瘤發(fā)生的重要因子，其生成與惡性腫瘤的低生存率有關(guān)，Chang等發(fā)現(xiàn)黃芪酸可通過抑制TNF信號通路使NF-κB活性減弱，從而抑制腫瘤細胞的過度增長及促其凋亡[29]。Toll樣受體在多種腫瘤中表現(xiàn)為高表達，研究發(fā)現(xiàn)下調(diào)其表達可有效抑制肝細胞癌細胞的增殖與侵襲[30]。不同的信號通路在肝細胞癌發(fā)生的各個階段發(fā)揮不同的作用，各個通路之間又相互交聯(lián)，形成了復(fù)雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)。雙蓮方的多種活性組分可能通過對失衡的通路進行協(xié)同調(diào)控，從而發(fā)揮防治肝細胞癌的作用。