楊苗苗，宋 昕，紀愛芳，徐瑞華，魏夢霞，韓文莉，雷玲玲，趙學科，孟超龍，胡守佳，程 錕，王盼盼，鐘 侃，胡景峰，王 偉，李欣然，陳 瑤，王立東

(1.鄭州大學第一附屬醫(yī)院河南省食管癌重點開放實驗室、省部共建食管癌防治國家重點實驗室，河南 鄭州 450052；2.長治醫(yī)學院附屬和平醫(yī)院醫(yī)學實驗中心，山西 長治 046000)

食管癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，中晚期患者5 a生存率僅10%左右,但早期患者的5 a生存率可達90%[1]。早期患者缺乏特異癥狀，首次就診時約90%已達到中晚期。因此，闡明食管癌變多階段演進的分子機制，篩選和建立用于大范圍人群早期發(fā)現(xiàn)和高危人群預警的指標和方法，是提高食管癌早期發(fā)現(xiàn)率，從而降低死亡率的關鍵[2]。食管癌的病理變化過程為：正常食管黏膜→基底細胞增生→炎癥→食管黏膜上皮不典型增生(分為輕、中和重度)→早期癌→中晚期癌[3]。食管黏膜上皮癌變早期形態(tài)學變化特征為基底細胞增生異常，形態(tài)學上表現(xiàn)為基底細胞過度增生。其突出的臨床特征是雙向發(fā)展不穩(wěn)定性，即其可向癌的方向持續(xù)發(fā)展，也可以停留在某一階段多年不變，甚至可以退回到正常狀態(tài)[4]。很顯然，甄別惡性進展分子變化特征和分子分型是識別食管癌高危人群的重要指標。本研究正是利用這些食管癌變早期分子指標進行優(yōu)化組合，建立癌前病變惡性進展分子模型，并進一步在食管癌高發(fā)區(qū)進行推廣應用，為食管癌早期發(fā)現(xiàn)和液體活檢技術優(yōu)化組合提供證據(jù)。

本課題組既往研究中采用串聯(lián)質(zhì)譜分析標記的高通量蛋白質(zhì)組相對定量方法對食管癌癌前病變和食管癌活檢組織進行高通量檢測，篩選能夠鑒別食管癌及不同癌前病變的候選蛋白。采用平行反應檢測靶向蛋白質(zhì)組學對選出的10種差異蛋白進行定量內(nèi)部驗證，采用免疫組化方法和酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)在食管癌和癌前病變組織中進行外部驗證。本研究在此基礎上，結(jié)合流行病學調(diào)查數(shù)據(jù)，以進展(進展為重度不典型增生、原位癌或食管癌)為終點結(jié)局，結(jié)合食管癌癌前病變進展的危險因素，首次建立食管癌癌前病變風險預測模型，即采用黏蛋白1(mucin 1，MUC1)、P15和ATP7B等3種自身抗體聯(lián)合預測食管癌癌前病變惡性進展狀態(tài)。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集來自省部共建食管癌防治國家重點實驗室的200例食管癌患者血清，患者均經(jīng)內(nèi)鏡和組織病理檢測確診且未接受任何放、化療等腫瘤治療的初診患者，200例正常對照人群血清來自省部共建食管癌防治國家重點實驗室合作醫(yī)院體檢中心的健康體檢人群，無任何腫瘤相關的證據(jù)。200例食管癌患者中，男108例，女92例，年齡(60.35±8.40)歲。正常對照人群中，男99例，女101例，年齡(59.16±9.88)歲。食管癌患者和正常對照人群性別、年齡等基線資料比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。

2011年1月至2019年12月間，在食管癌高發(fā)區(qū)山西省長治市選取40～69歲無癥狀人群，進行流行病學調(diào)查，流行病學調(diào)查前由當?shù)卮甯刹亢袜l(xiāng)村醫(yī)生幫助發(fā)放和講解知情同意書，對同意接受檢查者詳細采集個人信息并進行體檢，填寫基本信息調(diào)查表，包括性別、年齡、吸煙史、飲酒史、腫瘤的家族史。所有被檢者均排除急性感染、過敏、自身免疫性疾病等影響血清免疫學指標表達的疾病。

2011年1月至2019年12月間，在食管癌高發(fā)區(qū)山西省長治市、陽泉市、晉城市等地區(qū)篩選40～69歲食管癌無癥狀人群18 208例，采集個人信息，并利用液體活檢技術進行MUC1、P15和ATP7B等3種自身抗體聯(lián)合檢測，對任一抗體陽性患者進一步行內(nèi)鏡活檢病理檢查。

1.2 研究方法

1.2.1 自身抗體ELISA檢測 1)血清樣本孵育：將待檢測的血清樣本用樣品稀釋液按1500的比例進行稀釋，然后將稀釋后的血清樣本加入已包被抗原的96孔酶標板的反應孔中，加樣量為100 μL/孔，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱孵育1 h，然后棄去反應孔中液體，用洗滌液洗滌5次，每次洗滌3 min；2)酶標二抗孵育：將辣根過氧化物酶標記的RecA蛋白用二抗稀釋液按140 000的比例進行稀釋，然后將稀釋后的辣根過氧化物酶標記的RecA蛋白加入96孔酶標板的反應孔中，加樣量為100 μL/孔，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱孵育50 min，然后棄去點樣孔中液體，用洗滌液洗滌3次，每次3 min；3)顯色及終止反應：將顯色液A和顯色液B按照11等體積混合均勻，然后將混合后的顯色液迅速加入96孔酶標板的反應孔中，加樣量為100 μL/孔，置于37 ℃避光反應15 min，然后向每個反應孔中再加入50 μL終止液終止反應，于20 min內(nèi)用酶標儀器在450 nm(檢測波長)和595 nm(參比波長)處讀取OD值，并用空白對照孔調(diào)零；4)結(jié)果判定：以陰性對照孔所測OD值平均數(shù)加2個標準差的值為截斷值，反應孔中OD值≥截斷值為陽性，<截斷值為陰性。

1.2.2 內(nèi)鏡檢查及碘染色 常規(guī)行內(nèi)鏡檢查，仔細觀察食管、賁門黏膜，并分別做碘染色和美藍染色，記錄邊界清晰的不著色區(qū)域距離門齒的距離、大小、時鐘方位和狀態(tài)，并根據(jù)病灶大小對不著色區(qū)域進行多點活檢，所有活檢組織均迅速置于質(zhì)量分數(shù)10%～13%甲醛緩沖液內(nèi)固定。組織學閱片由2位受過專業(yè)培訓的現(xiàn)場病理醫(yī)生雙盲診斷，診斷不一致的標本由鄭州大學第一附屬醫(yī)院病理科醫(yī)生確診。

1.2.3 標本處理 抽取空腹靜脈血5 mL至離心管中，室溫中靜置30 min，2 000 r/min離心10 min，吸取上層血清分裝，每管100 μL，-80 ℃冰箱儲存。

2 結(jié)果

2.1 食管癌癌前病變惡性進展過程中自身抗體表達檢測的實驗室研究結(jié)果聯(lián)合檢測MUC1、P15和ATP7B等3種自身抗體對食管癌的檢測敏感性達到了85.0%，其特異性相較于單一檢測或兩兩聯(lián)合檢測有所降低，但仍能達到74.50%，提示聯(lián)合檢測MUC1、P15和ATP7B等3種自身抗體進行食管癌診斷，可以在保證診斷特異性的前提下大幅度提高診斷的敏感性。隨著聯(lián)合檢測自身抗體的增加，約登指數(shù)逐漸增大并趨向于1，提示聯(lián)合檢測3種自身抗體用于診斷和篩查食管癌的方法具有較好的診斷價值。聯(lián)合檢測MUC1、P15和ATP7B等3種自身抗體對食管癌診斷的敏感性分別為單獨檢測MUC1、P15和ATP7B的2.30倍、2.54倍和3.54倍。見表1。

表1 不同自身抗體優(yōu)化組合對食管癌診斷的價值 n(%)

2.2 食管癌癌前病變惡性進展過程中自身抗體表達檢測的臨床應用在食管癌高發(fā)區(qū)(山西省長治市)選取40～69歲無癥狀人群868例，其中男437例、女431例，年齡(55.04±8.39)歲。有吸煙史331例，占38.13%；有飲酒史198例，占22.81%。有腫瘤家族史374例，占43.09%。聯(lián)合檢測MUC1、P15和ATP7B的液體活檢技術篩選出高危人群87例(10.02%，87/868)。內(nèi)鏡活檢病理結(jié)果明確篩查癌前病變患者69例(7.95%，69/868)，其中輕度不典型增生33例(47.83%,33/69)、中度不典型增生8例(11.59%,8/69)和重度不典型增生28例(40.58%,28/69)，上消化道腫瘤18例(2.07%，18/868)，其中食管癌17例(94.44%，17/18)、賁門癌1例(5.56%，1/18)。見表2。

對比液體活檢技術和內(nèi)鏡活檢病理結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MUC1、P15和ATP7B等3種自身抗體聯(lián)合檢測陽性率在癌前病變(輕、中、重度不典型增生)和食管癌患者中均明顯高于正常對照人群，差異均有統(tǒng)計學意義(χ2=41.207，P<0.001；χ2=28.711，P<0.001；χ2=102.357，P<0.001；χ2=67.769,P<0.001)。見表2。

表2 自身抗體聯(lián)合檢測和內(nèi)鏡活檢病理結(jié)果比較分析情況 n(%)

為了觀察MUC1、P15和ATP7B等3種自身抗體聯(lián)合檢測對癌前病變惡性進展預測價值，以該組患者入組開始，進行5 a隨訪，然后再次進行內(nèi)鏡活檢病理。定義惡性進展終點事件為進展為重度不典型增生、原位癌或食管癌。使用單因素Logistic回歸分析評估性別、年齡、吸煙史、飲酒史、腫瘤家族史、入組內(nèi)鏡活檢病理和自身抗體對惡性轉(zhuǎn)歸風險的影響，發(fā)現(xiàn)原始病理診斷中，中度不典型增生進展風險最高，為輕度不典型增生的21.538倍。自身抗體陽性癌前病變患者惡性進展風險是陰性癌前病變患者的21.895倍。即MUC1、P15和ATP7B等3種自身抗體任一指標陽性時，惡性病變累積惡性進展率為29.63%(8/27)，提示MUC1、P15和ATP7B等3種自身抗體聯(lián)合檢測對食管癌癌前病變惡性進展具有明確預測意義。見表3。

表3 食管癌高發(fā)區(qū)內(nèi)鏡活檢病理檢出的癌前病變惡性進展情況

2.3 食管癌高發(fā)區(qū)大規(guī)模人群應用使用MUC1、P15和ATP7B等3種自身抗體聯(lián)合檢測液體活檢技術在食管癌高發(fā)區(qū)山西省長治市、陽泉市、晉城市進行大規(guī)模現(xiàn)場人群推廣應用，共篩選18 208例35歲以上無癥狀人群進行液體活檢，任一指標陽性即定義為高危人群，共篩選出3 642例高危人群，并對高危人群進一步行內(nèi)鏡病理活檢篩查，結(jié)果示正常對照人群1 672例、不典型增生1 442例、早期食管癌463例、中晚期食管癌24例、其他上消化道腫瘤41例，其早期癌檢出率2.54%(463/3 642)。

3 討論

食管癌的發(fā)生、發(fā)展是一個多因素、多階段、復雜的病理過程，具體發(fā)病機制仍不十分清楚。王立東等[5-6]首次報道一系列食管癌發(fā)病易感基因(如PLCE1、RFT2等)以及發(fā)病高危因素(如核黃素、維生素缺乏等)重要成果，提出食管癌發(fā)生的環(huán)境-遺傳-基因交互作用機制，為食管癌多階段演進分子機制探討提供了思路和啟發(fā)。本研究基于前期食管癌蛋白質(zhì)組學工作基礎[7-12]，分析了食管癌癌前病變惡性進展過程中分子指標變化及其在篩查中的應用，報道了一組適用于食管癌高發(fā)區(qū)大規(guī)模人群篩查應用的自身抗體(MUC1、P15和ATP7B)。自身抗體是機體針對腫瘤組織分泌出的蛋白產(chǎn)生的免疫應答產(chǎn)物，不僅可明確預測癌前病變惡性進展風險，而且可以應用于高危人群篩查，結(jié)合液體活檢和內(nèi)鏡活檢病理，大幅度節(jié)約篩查成本。

本研究基于主動隨訪的終點結(jié)局為進展，進展為重度不典型增生、原位癌或食管癌，而未討論保持或逆轉(zhuǎn)。主要原因是癌前病變組織較小，內(nèi)鏡活檢病理檢查時可能已經(jīng)阻斷了可能的癌前病變進展情況，與癌前病變的自然發(fā)生、發(fā)展的保持不變或逆轉(zhuǎn)為正常的影響因素不能明確區(qū)分，因此，本研究僅討論惡性進展為重度不典型增生、原位癌或食管癌的狀態(tài)。

盡管已報道P53基因在食管癌組織中的表達，但是P53在多種腫瘤組織中均可表達，不具有自身抗體檢測的特異性[13]，同時自身抗體或微小RNA均被報道與食管癌的預后相關，是今后臨床研究、個體化診療的方向[14]。本研究主要討論食管癌癌前病變惡性進展分子機制以及自身抗體在癌前病變患者血清中的表達。在食管癌患者血清自身抗體檢測時發(fā)現(xiàn)，單獨檢測MUC1、P15或ATP7B時，陽性率較正常對照人群明顯升高。優(yōu)化組合MUC1、P15和ATP7B自身抗體聯(lián)合檢測時，陽性率較正常對照人群也有明顯升高，且篩查效率提高了數(shù)倍，因此，可用于高發(fā)區(qū)食管癌篩查。在食管癌高發(fā)區(qū)小范圍臨床應用中，結(jié)合5 a隨訪發(fā)現(xiàn)，3種自身抗體任一指標陽性時，食管癌癌前病變惡性進展風險是陰性患者惡性進展風險的21.895倍，具有獨立預測價值。

與國家衛(wèi)健委的上消化道腫瘤早診早治項目技術[15]相比，使用液體活檢技術結(jié)合內(nèi)鏡活檢病理在食管癌高發(fā)區(qū)進行大規(guī)模人群篩查，早期癌發(fā)現(xiàn)率相近，但是內(nèi)鏡篩查比例明顯下降，降低了篩查成本，縮小了癌前病變惡性進展監(jiān)測高風險人群，進一步實現(xiàn)了食管癌的精準診療，降低了食管癌的發(fā)病率和死亡率。

綜上所述，使用多種自身抗體聯(lián)合檢測，優(yōu)化組合，結(jié)合內(nèi)鏡活檢病理篩查是食管癌高發(fā)區(qū)無癥狀人群早期發(fā)現(xiàn)和高危人群預警的重要手段。