劉 勤，張 強，吳方雄，閆 蓉，李 蓉，王 佳，牛春燕,3

1 廈門大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，福建 廈門 361102； 2 西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 消化內(nèi)科，西安 710077；3 南京市溧水區(qū)人民醫(yī)院，東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院溧水分院 消化內(nèi)科，南京 211200

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)正在成為世界最常見的慢性肝病，全球患病率已達25%[1]。NAFLD的發(fā)病機制涉及胰島素抵抗(insulin resistance,IR)、脂毒性、炎癥反應(yīng)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)、遺傳因素、腸道微生態(tài)改變等多個方面[2]。近年研究發(fā)現(xiàn)，具有脂毒性特征的鞘脂類介質(zhì)如神經(jīng)酰胺(ceramide, CE)、酸性鞘磷脂酶(acid sphingomyelinase, ASM)等參與介導(dǎo)脂代謝紊亂及炎癥發(fā)生等多種生物學(xué)過程，且ASM/CE通路在肝臟疾病的病理生理機制中發(fā)揮重要作用，這一通路可被包括TNFα在內(nèi)的多種生物因素激活[3]。三環(huán)類抗抑郁藥阿米替林(amitriptyline)是ASM的功能性抑制劑，可促使ASM降解失活，進而抑制CE的產(chǎn)生及其進一步的毒性生物學(xué)效應(yīng)。以往僅在動物實驗研究發(fā)現(xiàn)阿米替林對脂質(zhì)代謝的改善作用，但體外研究在國內(nèi)外尚未見報道。本研究通過建立NAFLD細胞模型，擬從ASM/CE通路方向探討阿米替林在改善NAFLD肝臟脂質(zhì)代謝中的作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 HepG2細胞株(procell，CL-0103)和L02細胞株(武漢巴菲爾生物技術(shù)有限公司)。

1.1.2 主要藥品與試劑 油酸(sigma，O1383)，棕櫚酸(sigma，P5585)，油紅O染色液(sigma，O0625)，阿米替林(阿拉丁，A129730，以下簡稱Ami)，人TNFα(PeproTech，96-300-01A)，Acid sphingomyelinase抗體(affinity，DF13384)，HRP標(biāo)記羊抗兔二抗(武漢博士德生物工程有限公司)，TG測定試劑盒、TC測定試劑盒、ALT測定試劑盒、AST測定試劑盒(長春匯力生物技術(shù)有限公司)，游離脂肪酸(FFA)測定試劑盒(南京建成科技有限公司)，人神經(jīng)酰胺ELISA試劑盒(江萊生物，JL19781)，人ASM ELISA測定試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技有限公司)。

1.1.3 儀器與設(shè)備 倒置熒光顯微鏡(Olympus)，冷凍離心機(Eppendorf)，CO2恒溫培養(yǎng)箱(SANYO)，全自動生化分析儀(Rayto)，酶標(biāo)儀(Thermo)，垂直電泳槽、電轉(zhuǎn)儀(北京六一儀器廠)，PCR儀(東勝創(chuàng)新生物科技有限公司)，實時熒光定量PCR儀(ABI)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及分組 HepG2和L02細胞在培養(yǎng)基為RPMI 1640+10%FBS+1%青鏈霉素溶液，37 ℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)。正常對照組進行常規(guī)培養(yǎng)；NAFLD模型組加入含1 mmol/L FFA(油酸∶棕櫚酸=2∶1)培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h；Ami組加入100 μmol/L Ami，TNFα組加入20 ng/ml人重組TNFα，Ami+TNFα組同時加入100 μmol/L Ami與20 ng/ml人重組TNFα；Ami組、TNFα組、Ami+TNFα組均于造模前預(yù)處理1 h，造模過程中不換液。

1.2.2 MTT比色法測定細胞活力 取處于對數(shù)生長期，生長狀態(tài)良好的L02和HepG2細胞，調(diào)整細胞密度到8×104/ml，接入96孔板，同時設(shè)空白孔，37 ℃培養(yǎng)過夜。待細胞貼壁后，按照分組進行換液處理(每組3個復(fù)孔)，37 ℃培養(yǎng)24 h后每孔加入10 μl MTT，37 ℃培養(yǎng)4 h。吸出培養(yǎng)基，加入150 μl DMSO震蕩10 min，酶標(biāo)儀測定568 nm下各孔吸光度值。

1.2.3 油紅O染色 分別取對數(shù)生長期的各組細胞，以5×104/孔的密度接種于放玻片的 24 孔板上，細胞培養(yǎng)至密度達到60%～70%時，放入孵箱培養(yǎng)48 h后，取出培養(yǎng)板，PBS洗3次，用4%多聚甲醛固定15 min，蒸餾水洗，60%異丙醇浸洗，油紅O染液染10 min；60%異丙醇分色至背景無色，蒸餾水洗；Mayer蘇木素復(fù)染數(shù)分鐘，自來水洗1～3 min；用水性封片劑封片，顯微鏡下觀察細胞內(nèi)的脂滴。

1.2.4 Western Blot檢測ASM的蛋白表達 細胞按分組處理24 h后，提取各組細胞總蛋白，通過BCA法檢測蛋白濃度。蛋白經(jīng)凝膠電泳法分離后，再轉(zhuǎn)至PVDF膜上，在5%脫脂奶粉于室溫封閉2 h，按1∶1000稀釋抗體ASM與抗體GAPDH，使PVDF膜浸泡于一抗孵育液中，4 ℃孵育過夜。次日 TBST漂洗3次，按1∶50 000稀釋相應(yīng)的HRP標(biāo)記二抗，使PVDF膜浸泡于二抗孵育液中，37 ℃搖床孵育2 h。洗膜后ECL法壓片顯影。

1.2.5 實時熒光定量PCR檢測ASM表達水平 Trizol法分別提取各組細胞總 RNA，用紫外分光光度計檢測RNA的純度和濃度，并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用實時熒光定量PCR檢測ASM mRNA表達。以GAPDH為內(nèi)參基因，最終數(shù)據(jù)以2-△△Ct進行分析。引物由擎科生物科技有限公司設(shè)計合成，引物序列：ASM上游引物為5′- CCGGCCCTTTTGATATGGTG-3′，下游引物為5′- GGGGAGGGAAGCTATTGACA-3′，擴增產(chǎn)物大小為189 bp；GAPDH上游引物為5′- TCAAGAAGGTGGTGAAGCAGG -3′，下游引物為5′- TCAAAGGTGGAGGAGTGGGT -3′，擴增產(chǎn)物大小為115 bp。

1.2.6 ELISA法測定細胞ASM、CE總水平 收集各組細胞培養(yǎng)液，1000 r/min離心20 min，取上清保存于-20 ℃?zhèn)溆?。根?jù) ELISA 試劑盒說明書進行操作，檢測細胞ASM、CE總水平。

1.2.7 生化指標(biāo)的測定 TG、TC、ALT、AST由全自動生化分析儀檢測，F(xiàn)FA含量按照FFA測定試劑盒說明書進行測定。

2 結(jié)果

2.1 NAFLD細胞模型的建立 HepG2和L02細胞的增殖率隨FFA濃度的增加而降低。與空白組比較，F(xiàn)FA濃度為2 mmol/L時，兩種細胞的吸光度值及增殖率下降明顯(表1)。選擇FFA濃度為1 mmol/L進行后續(xù)實驗，誘導(dǎo)細胞脂肪變，油紅O染色結(jié)果顯示，正常對照組HepG2和L02細胞生長形態(tài)呈梭形或卵圓形，胞質(zhì)無明顯紅染或淡染，NAFLD模型組細胞胞質(zhì)廣泛染色，橘紅色脂滴聚集明顯增多(圖1)；與正常對照組比較，NAFLD模型組細胞內(nèi)TG、TC、FFA水平明顯增加(P值均<0.05)(表2)，表明 NAFLD細胞模型建立成功。

2.2 不同濃度Ami對NAFLD細胞模型脂質(zhì)蓄積的影響

正常對照組，NAFLD模型組，Ami 25 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L干預(yù)組的HepG2和L02細胞均生長良好，吸光度值和細胞增殖率組間比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P值均>0.05)(表3)。油紅O染色結(jié)果可見，與NAFLD模型組相比，Ami干預(yù)的各組細胞內(nèi)橘紅色脂滴聚集減少，且脂滴隨Ami濃度的增加而減少，這一變化在HepG2細胞中更為明顯(圖2)。進一步定量檢測結(jié)果顯示，與正常對照組比較，NAFLD模型組細胞內(nèi)TG、TC、FFA水平明顯升高；Ami干預(yù)組細胞內(nèi)TG、TC、FFA水平隨Ami濃度的升高而降低，與NAFLD模型組比較，Ami 50 μmol/L與Ami 100 μmol/L組細胞內(nèi)TG、TC、FFA水平下降明顯(P<0.05)(表4、5)。綜上，Ami可抑制NAFLD細胞模型的脂質(zhì)蓄積，且在一定濃度范圍內(nèi)，抑制作用隨濃度的增加而增強。故選擇濃度為100 μmol/L(抑制作用最佳)的Ami進行進一步研究。

表1 不同濃度FFA干預(yù)細胞的OD值和細胞增殖率

圖1 油紅O染色結(jié)果(×200)

表2 正常對照組和NAFLD模型組細胞內(nèi)TG、TC、FFA含量比較

表3 不同濃度阿米替林干預(yù)脂肪變細胞的OD值和增殖率

圖2 不同濃度Ami干預(yù)HepG2和L02細胞的油紅O染色結(jié)果(×200)

表4 各組HepG2細胞內(nèi)TG、TC、FFA水平比較

表5 各組L02細胞內(nèi)TG、TC、FFA水平比較

2.3 TNFα及Ami對ASM/CE通路的影響 為了驗證TNFα對ASM的激活作用以及Ami對ASM的抑制作用，對ASM的蛋白及mRNA表達進行檢測。與正常對照組比較，NAFLD模型組ASM的蛋白及mRNA表達量明顯升高(P<0.05)；與NAFLD模型組相比，Ami組明顯降低了ASM蛋白及mRNA表達，而TNFα明顯增加了細胞中ASM的蛋白及mRNA表達(P值均<0.05)；與TNFα組比較，Ami+TNFα組ASM的蛋白及mRNA表達量降低明顯(P值均<0.05)(圖3，表6)。ELISA檢測細胞內(nèi)總CE、ASM的水平，與正常對照組比較，NAFLD模型組OD值明顯升高(P值均<0.05)；與NAFLD模型組相比，Ami組OD值明顯降低，TNFα組OD值明顯升高(P值均<0.05)；與TNFα組比較，Ami+TNFα組OD值降低明顯(P值均<0.05)(表7)，提示Ami可抑制TNFα所致的ASM及CE的表達改變。

圖3 各組細胞ASM蛋白的表達水平

表6 各組細胞ASM的mRNA相對表達量

表7 各組細胞的ELISA檢測結(jié)果(OD值)

2.4 ASM/CE通路對生化代謝的影響 在明確Ami及TNFα對ASM/CE通路的作用后，進一步研究抑制或激活該通路對生化代謝的影響。與正常對照組比較，NAFLD模型組細胞內(nèi)TG、TC、FFA及細胞上清中ALT、AST水平明顯上升(P值均<0.05)；與NAFLD模型組比較，Ami組TG、TC、FFA、ALT、AST水平明顯下降(P值均<0.05)，TNFα組中兩細胞系的TG、FFA、ALT、AST水平均上升；與TNFα組比較，Ami+TNFα組TG、TC、FFA、ALT、AST水平明顯下降(P值均<0.05)(表8、9)。

表8 各組HepG2細胞的生化指標(biāo)比較

表9 各組L02細胞的生化指標(biāo)比較

3 討論

近年研究發(fā)現(xiàn)CE及ASM在NAFLD的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用。CE屬于鞘脂類脂質(zhì)家族，是構(gòu)成生物膜的重要組分，也是鞘磷脂信號通路的第二信使，可引起脂毒性，介導(dǎo)IR、炎癥反應(yīng)、ERS等多種發(fā)病機制，調(diào)節(jié)細胞凋亡、分化、增殖、自噬等多種細胞應(yīng)答[4-5]，且CE被脂毒性學(xué)說的首位提出者Unger[6]描述為脂毒性事件中“最重要的有害途徑”。有研究[7]表明，血漿CE水平與青少年肝脂肪變性密切相關(guān)，且C14∶0 CE可能成為青少年非肥胖型肝脂肪變性的預(yù)測指標(biāo)。合并IR的非酒精性脂肪性肝炎(NASH)患者中CE合成顯著增加，促進肝脂肪變、氧化應(yīng)激與炎癥反應(yīng)[8-9]。CE還參與了NAFLD大鼠模型肝細胞內(nèi)的脂質(zhì)沉積過程[10]。ASM是調(diào)控CE合成、分泌的關(guān)鍵酶，也是CE合成最快、最直接的途徑。酒精性肝炎和NASH的動物模型中ASM明顯激活，可調(diào)節(jié)ERS、自噬和溶酶體膜透化作用，進而引起IR、脂肪變性、纖維化、脂毒性[11-12]，促進肝病的進展，而ASM抑制劑丙米嗪可改善乙醇喂養(yǎng)小鼠的肝脂肪變性[13]，提示ASM/CE通路在 NASH 中是一個調(diào)控多條通路的關(guān)鍵靶點[14]。

ASM可被炎性因子TNFα激活，被Ami抑制。NAFLD時TNFα水平升高，而由此激活的ASM又能增加肝細胞對TNFα的細胞毒性作用的敏感性[15]，如此相互作用可加速肝病進展。Ami是ASM的功能性抑制劑，可干擾ASM與溶酶體膜的結(jié)合，導(dǎo)致ASM蛋白降解失活[16]，進一步抑制CE的生成及后續(xù)的毒性生物學(xué)效應(yīng)。Ami可保護ASM+/+小鼠免于高脂飲食引起的肝臟脂肪變、炎癥、ERS以及早期NASH和纖維化[12]；明顯減輕LDLR-/-小鼠肝脂肪變性、炎癥及IR[17]。

關(guān)于Ami對NAFLD的影響及ASM/CE通路在 NAFLD發(fā)病機制中的探索，目前國際上僅有動物實驗的研究，尚未見細胞實驗的報道。本研究選擇人肝癌細胞HepG2和正常人肝細胞L02兩種細胞系，用FFA誘導(dǎo)建立了NAFLD細胞模型，發(fā)現(xiàn)NAFLD模型組細胞ASM的蛋白、mRNA表達量與CE含量較正常對照組明顯升高，表明NAFLD中存在ASM/CE通路的異?；罨６鳷NFα組細胞中ASM的蛋白、mRNA表達與CE含量較NAFLD模型組明顯升高，表明TNFα誘導(dǎo)的細胞中CE的增加主要源于ASM的激活，驗證了TNFα對ASM/CE通路的激活作用。Ami可顯著降低細胞模型中的脂滴含量，提示Ami可改善NAFLD肝細胞內(nèi)脂質(zhì)沉積。對NAFLD細胞模型進行Ami干預(yù)后，細胞內(nèi)脂質(zhì)含量及酶學(xué)水平均明顯下降，細胞ASM的蛋白、mRNA表達量與CE含量也明顯降低；采用TNFα激活A(yù)SM/CE通路，同時加以Ami干預(yù)，細胞內(nèi)脂質(zhì)含量、酶學(xué)水平，以及ASM的蛋白、mRNA表達量與CE含量較TNFα組也呈現(xiàn)明顯下降。這表明ASM/CE通路促進脂質(zhì)積聚、導(dǎo)致脂肪變，Ami可通過抑制ASM/CE通路改善NAFLD肝細胞的脂質(zhì)沉積及肝功能生化指標(biāo)，與前述已有的動物實驗研究結(jié)果一致。

據(jù)了解，本研究系國內(nèi)外首次關(guān)于Ami對脂質(zhì)代謝影響的體外研究。研究表明在NAFLD病理過程中存在ASM/CE調(diào)控脂質(zhì)代謝關(guān)鍵通路的激活，Ami作為ASM的抑制劑可通過調(diào)控ASM/CE通路改善NAFLD肝細胞的脂質(zhì)沉積，提示ASM/CE通路可以作為 NAFLD的潛在治療靶點，Ami作為靶向治療藥物的可行性，以及ASM、CE作為NAFLD診斷預(yù)測標(biāo)志物的可能性，然而以上結(jié)論還需完善NAFLD模型體內(nèi)實驗進一步驗證。同時，CE下游代謝產(chǎn)物或信號分子的確切變化規(guī)律，以及它們在 NAFLD發(fā)生、發(fā)展中的生物學(xué)作用特征也有待進一步深入研究。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監(jiān)護人以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突，特此聲明。

作者貢獻聲明：劉勤負責(zé)課題設(shè)計與實驗實施，資料收集整理，數(shù)據(jù)分析，撰寫論文；張強參與實驗實施，資料收集整理；李蓉負責(zé)實驗質(zhì)量控制及論文修改；吳方雄、閆蓉、王佳負責(zé)文獻收集與整理；牛春燕進行課題設(shè)計，審核論文，并對論文負責(zé)。