馬小林,黃政,方存明,胡學(xué)俊,劉冰,伍超,龔天奎,丁文龍

急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)是威脅人類生命健康的常見病和多發(fā)病。隨著急診介入技術(shù)的逐漸推廣，急性心肌梗死患者的預(yù)后得到了極大改善。然而，仍有相當(dāng)數(shù)量的急性心肌梗死患者不能得到及時(shí)有效地再灌注治療。心肌梗死后大量心肌細(xì)胞的丟失導(dǎo)致急性心力衰竭、心源性休克、惡性心律失常、猝死等嚴(yán)重并發(fā)癥發(fā)生。心肌梗死后心室重構(gòu)亦可導(dǎo)致心功能減退和慢性心力衰竭發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，炎性反應(yīng)的過度激活可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡、壞死，促進(jìn)心室重構(gòu)和心力衰竭發(fā)生[1-2]。因此，抑制免疫炎性反應(yīng)對(duì)改善心肌梗死患者心功能和預(yù)后具有重要意義。研究證實(shí)芪藶強(qiáng)心膠囊能有效抑制心室重構(gòu)、緩解心力衰竭癥狀并改善心力衰竭預(yù)后[3-4]。抑制免疫炎性反應(yīng)可能是芪藶強(qiáng)心膠囊治療心力衰竭的機(jī)制之一?，F(xiàn)觀察芪藶強(qiáng)心膠囊對(duì)心肌梗死大鼠心肌Toll樣受體-4(TLR4)/核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)信號(hào)通路的影響及其對(duì)缺血心肌的保護(hù)作用機(jī)制，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 (1)動(dòng)物：SPF級(jí)雄性SD大鼠32只，體質(zhì)量(230±20)g，購(gòu)自皖南醫(yī)學(xué)院。大鼠在室溫(22±2)℃、濕度50%～60%、12 h光照/12 h黑暗節(jié)律的環(huán)境下飼養(yǎng)。(2)試藥試劑：芪藶強(qiáng)心膠囊(石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn))；卡托普利(常州制藥廠生產(chǎn));青霉素(石藥控股集團(tuán)有限公司生產(chǎn)) ； 大鼠TLR4、NF-κB p65、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)、β-actin抗體購(gòu)自北京博奧森生物科技有限公司，HE染色、TUNEL染色試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物公司。(3)儀器設(shè)備：小動(dòng)物呼吸機(jī)(上海奧爾科特生物科技有限公司，型號(hào)ALC-V8S)，心電圖儀(上海光電醫(yī)用電子儀器有限公司，型號(hào)ECG2250)，顯微鏡[奧林巴斯(中國(guó))有限公司，型號(hào)IX73]，離心機(jī)[艾本德(上海)國(guó)際貿(mào)易有限公司，型號(hào)5804R]，掃膜儀(美國(guó)Licor公司，型號(hào)Odyssey CLx)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 2019年4—6月于宣城市人民醫(yī)院病理科進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 將SD大鼠32只隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、MI組、MI+芪藶強(qiáng)心組、MI+卡托普利組，每組8只。大鼠以1%戊巴比妥40 mg/kg腹腔注射麻醉，氣管插管成功后連接小動(dòng)物呼吸機(jī)，設(shè)置吸呼比1∶2，潮氣量0.7～0.8 ml，呼吸頻率80次/min。于大鼠左胸第3～4肋間開胸，暴露心臟，在左心耳與肺動(dòng)脈之間下約1 mm處結(jié)扎冠狀動(dòng)脈。當(dāng)結(jié)扎部位以下心肌變灰白，心電圖肢體導(dǎo)聯(lián)出現(xiàn)ST段弓背向上抬高時(shí)提示冠狀動(dòng)脈結(jié)扎成功。迅速縫合切口、關(guān)胸。術(shù)后3 d予青霉素20萬(wàn)U/d腹腔注射預(yù)防感染。假手術(shù)組大鼠手術(shù)過程同上，但只穿線不結(jié)扎冠狀動(dòng)脈。將芪藶強(qiáng)心膠囊藥粉以生理鹽水配制成0.1 g/ml濃度溶液。參考林銳波等[5]研究方法，MI+芪藶強(qiáng)心組以芪藶強(qiáng)心膠囊溶液1.2 g·kg-1·d-1，MI+卡托普利組以卡托普利25 mg·kg-1·d-1。假手術(shù)組、MI組以生理鹽水10 ml·kg-1·d-1，均每日1次灌胃2周。

1.3 觀測(cè)指標(biāo)與方法

1.3.1 心肌病理學(xué)檢測(cè)：大鼠給藥2周后采用頸椎脫臼法處死，開胸取心肌梗死區(qū)心肌組織，PBS溶液清洗后以4%多聚甲醛4℃固定24 h，常規(guī)石蠟包埋、切片。采用HE染色觀察各組心肌形態(tài)、結(jié)構(gòu)變化及炎細(xì)胞浸潤(rùn)情況，TUNEL染色檢測(cè)各組心肌細(xì)胞凋亡情況。所有操作方法均嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.2 Western-blot檢測(cè)TLR4、NF-κB、TNF-α、IL-1β蛋白表達(dá)：取大鼠心肌組織40 mg加入RIPA裂解液充分勻漿、裂解。裂解液4℃下，離心后吸取上清，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度；取等量蛋白上樣，SDS-PAGE電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，加入一抗溶液(濃度1∶1 000)中4℃搖勻過夜，再加入二抗溶液室溫孵育2 h；經(jīng)洗滌、顯影、灰度掃描后，用 Odyssey 3.0軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行灰度值測(cè)定，以目的條帶與β-actin的灰度比值表示TLR4、NF-κB、TNF-α、IL-1β蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠心肌結(jié)構(gòu)變化比較 假手術(shù)組心肌纖維排列整齊，細(xì)胞核大小、形態(tài)一致，心肌間隙正常，無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。MI組心肌纖維排列紊亂，可見心肌纖維斷裂，核深染，心肌間隙明顯增寬，或伴炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。與MI組比較，MI+芪藶強(qiáng)心組及MI+卡托普利組心肌纖維排列較為整齊，心肌纖維破壞減輕，心肌間隙減小，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少，見圖1。

2.2 各組大鼠心肌TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)比較 Western-blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，MI組大鼠心肌TLR4、NF-κB p65蛋白表達(dá)顯著增多(t=14.951、12.710，P均=0.000)；與MI組比較，MI+芪藶強(qiáng)心組、MI+卡托普利組大鼠心肌TLR4(t=7.536、7.704，P均=0.002)、NF-κB p65(t/P=6.103/0.004、5.398/ 0.006)蛋白表達(dá)顯著減少；MI+芪藶強(qiáng)心組、MI+卡托普利組TLR4、NF-κB p65蛋白表達(dá)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，見圖2。

2.3 各組大鼠心肌炎性因子表達(dá)比較 與假手術(shù)組比較，MI組大鼠心肌TNF-α、IL-1β表達(dá)量顯著增多(t=19.272、15.140，P均=0.000)；與MI組比較，MI+芪藶強(qiáng)心組、MI+卡托普利組大鼠心肌TNF-α(t=6.660、6.710，P均=0.003)、IL-1β表達(dá)量顯著減少(t/P=6.655/0.003、5.323/0.006)；MI+芪藶強(qiáng)心組、MI+卡托普利組TNF-α、IL-1β表達(dá)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，見圖2。

2.4 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡比較 正常心肌細(xì)胞核TUNEL染色呈淡藍(lán)色，細(xì)胞核大小、形態(tài)較為一致。

注：A.假手術(shù)組；B.MI組；C.MI+芪藶強(qiáng)心組；D.MI+卡托普利組

凋亡心肌細(xì)胞核TUNEL染色呈棕色或棕褐色,細(xì)胞核大小不一，核內(nèi)染色質(zhì)皺縮呈藍(lán)色顆粒狀位于核膜下，見圖3；假手術(shù)組心肌組織中可見極少量凋亡細(xì)胞(4.37±0.49)%，MI組心肌細(xì)胞凋亡率(48.97±2.35)%，較假手術(shù)組顯著升高(t=18.548，P=0.000)；與MI組比較，MI+芪藶強(qiáng)心組心肌細(xì)胞凋亡率(32.03±1.94) %顯著降低(t=5.548，P=0.005)；MI+芪藶強(qiáng)心組與MI+卡托普利組心肌細(xì)胞凋亡率(33.57±1.71)%比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3 討 論

心肌細(xì)胞凋亡、壞死及免疫炎性反應(yīng)的過度激活是心肌梗死后心力衰竭的重要發(fā)病機(jī)制。因此，保護(hù)缺血心肌、抑制炎性反應(yīng)對(duì)心肌梗死后心力衰竭的防治具有重要意義。芪藶強(qiáng)心膠囊是根據(jù)中醫(yī)絡(luò)病理論研制的中藥復(fù)方制劑，具有益氣溫陽(yáng)、活血通絡(luò)、利水消腫之功效，對(duì)心肌梗死后心力衰竭具有較好療效，但其具體藥理機(jī)制仍有待闡明。本研究從免疫炎性反應(yīng)角度探討芪藶強(qiáng)心膠囊對(duì)心肌梗死后心肌的保護(hù)作用及機(jī)制。研究結(jié)果提示，芪藶強(qiáng)心膠囊可能通過TLR4/NF-κB信號(hào)通路減輕心肌梗死大鼠心肌免疫炎性反應(yīng)和結(jié)構(gòu)損傷。

心肌梗死后心肌缺血、缺氧導(dǎo)致心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)、功能損傷。受損細(xì)胞釋放的損傷相關(guān)分子模式可與Toll樣受體、補(bǔ)體等模式識(shí)別受體結(jié)合，啟動(dòng)天然免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)炎性因子釋放和炎性反應(yīng)[6]。TNF-α、IL-1β等炎性因子在梗死區(qū)心肌表達(dá)增多，可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡、壞死，促進(jìn)心肌纖維化和心室重構(gòu)[7-8]。有研究表明，TNF-α、IL-1、IL-6、IL-10等炎性因子表達(dá)水平與心肌梗死患者的心功能、危險(xiǎn)分層及預(yù)后密切相關(guān)[9]。芪藶強(qiáng)心膠囊能夠降低慢性心力衰竭患者血清炎性因子表達(dá)，改善心臟功能[10]。然而，芪藶強(qiáng)心膠囊對(duì)梗死心肌局部炎性因子的表達(dá)是否具有調(diào)節(jié)作用，目前鮮有研究報(bào)道。本研究中，MI+芪藶強(qiáng)心組心肌TNF-α、IL-1β表達(dá)較MI組顯著減少，心肌細(xì)胞凋亡及心肌結(jié)構(gòu)損傷明顯減輕，提示芪藶強(qiáng)心膠囊可能通過抑制心肌免疫炎性反應(yīng)參與對(duì)缺血心肌的保護(hù)。

注：A.假手術(shù)組；B.MI組；C.MI+芪藶強(qiáng)心組；D.MI+卡托普利組

注：A.假手術(shù)組；B.MI組；C.MI+芪藶強(qiáng)心組；D.MI+卡托普利組

目前，芪藶強(qiáng)心膠囊抑制梗死心肌免疫炎性反應(yīng)的具體機(jī)制仍不十分明確。Han等[11]研究發(fā)現(xiàn)，芪藶強(qiáng)心膠囊能夠抑制TGF-β1/Smad3及NF-κB信號(hào)通路，減少心肌梗死大鼠心肌TNF-α、IL-6表達(dá)，減輕心肌纖維化和心室重構(gòu)。Fu等[12]研究發(fā)現(xiàn)，芪藶強(qiáng)心膠囊較貝那普利更顯著改善心肌梗死大鼠心力衰竭標(biāo)志物水平，并增加心肌保護(hù)性蛋白血管生成素樣4表達(dá)，降低炎性反應(yīng)相關(guān)的脂蛋白和溶血磷脂酸水平，通過調(diào)節(jié)心肌免疫炎性反應(yīng)過程改善心臟功能。另外，芪藶強(qiáng)心膠囊的多個(gè)組方成分如人參、丹參、葶藶子、黃芪等均被證實(shí)可通過多種機(jī)制調(diào)節(jié)心肌炎性因子表達(dá)[13-15]。因此推測(cè)，芪藶強(qiáng)心膠囊抑制心肌免疫炎性反應(yīng)的機(jī)制可能與其對(duì)復(fù)雜炎性反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)的多方面調(diào)控有關(guān)。

TLR4/NF-κB是經(jīng)典的炎性反應(yīng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，其激活后可促進(jìn)下游炎性因子如TNF-α、IL-1β、IL-6等表達(dá)，從而誘導(dǎo)免疫炎性反應(yīng)和靶細(xì)胞凋亡、壞死[16]。TLR4在心肌組織中高表達(dá)，TLR4及其相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路已被許多研究證實(shí)參與心肌梗死后心力衰竭的發(fā)病和進(jìn)展[17-18]。芪藶強(qiáng)心膠囊能否作用于TLR4/NF-κB信號(hào)通路并減輕其介導(dǎo)的心臟免疫炎性反應(yīng)和心肌損傷，目前尚無(wú)報(bào)道。在本研究中，MI組大鼠心肌TLR4、NF-κB表達(dá)顯著增多，而MI+芪藶強(qiáng)心組TLR4、NF-κB表達(dá)較MI組顯著減少，提示芪藶強(qiáng)心膠囊可能通過抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路減輕心臟免疫炎性反應(yīng)和心肌細(xì)胞凋亡，從而對(duì)缺血心肌發(fā)揮保護(hù)作用。

ACEI/ARB類藥物是預(yù)防心肌梗死后心室重構(gòu)和心力衰竭的常用藥物。除抑制腎素—血管緊張素—醛固酮系統(tǒng)外，ACEI/ARB類藥物還具有抗炎、抗氧化、血管內(nèi)皮保護(hù)、延緩動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展、調(diào)節(jié)血管纖維蛋白溶解平衡、抗血小板凝集等多重心血管保護(hù)作用。本研究比較了芪藶強(qiáng)心膠囊與卡托普利在調(diào)節(jié)心肌梗死大鼠心肌炎性反應(yīng)和損傷中的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MI+芪藶強(qiáng)心組與MI+卡托普利組在TLR4、NF-κB、TNF-α、IL-1β表達(dá)方面無(wú)顯著差異，提示芪藶強(qiáng)心膠囊對(duì)梗死心肌免疫炎性反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用可能不劣于卡托普利，但仍有待臨床研究證實(shí)。

綜上所述，芪藶強(qiáng)心膠囊通過抑制免疫炎性反應(yīng)，減輕心肌梗死大鼠心肌細(xì)胞凋亡和心肌結(jié)構(gòu)損傷；芪藶強(qiáng)心膠囊的抗炎、抗凋亡作用可能與其抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路有關(guān)。

利益沖突：所有作者聲明無(wú)利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

馬小林：課題設(shè)計(jì)，統(tǒng)計(jì)分析，論文撰寫；黃政：課題設(shè)計(jì)，參與撰寫；方存明：選擇課題，論文修改、審核；胡學(xué)俊、劉冰、伍超、龔天奎、丁文龍：研究實(shí)施，數(shù)據(jù)獲取