郭寅龍

(中國科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所, 上海 200032)

隨著科技進(jìn)步，醫(yī)學(xué)實踐正向精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)邁進(jìn)。大規(guī)模臨床樣本的代謝組學(xué)分析技術(shù)對于精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)目標(biāo)的實現(xiàn)至關(guān)重要，也是精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)研究不可或缺的技術(shù)手段。大規(guī)模疾病代謝組學(xué)的研究對象為復(fù)雜臨床生物樣本中數(shù)以千計的代謝物，其涉及的樣本數(shù)量多,分析周期長，對現(xiàn)有分析技術(shù)提出了極大挑戰(zhàn)。色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法是目前代謝組學(xué)分析的主流方法，但色譜分離速度限制了其在大規(guī)模復(fù)雜臨床生物樣本分析中的應(yīng)用。直接進(jìn)樣質(zhì)譜(direct injection-mass spectrometry, DI-MS)已成為除傳統(tǒng)色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)之外非靶向代謝組學(xué)研究的另一種選擇，其主要優(yōu)勢在于快速獲得豐富的代謝物質(zhì)譜信息，顯著提高分析通量。但是DI-MS面臨著離子抑制效應(yīng)導(dǎo)致代謝物檢測靈敏度降低和缺少色譜維度信息使得定性定量困難等問題。因此，發(fā)展與DI-MS相匹配的高靈敏度質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集技術(shù)和先進(jìn)的數(shù)據(jù)分析方法是解決問題的關(guān)鍵。

針對上述難題，近日，中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所的許國旺課題組[1]提出了一種基于納升電噴霧電離直接進(jìn)樣高分辨質(zhì)譜(nanoelectrospray ionization direct injection-high resolution mass spectrometry, nanoESI DI-HRMS)的非靶向代謝組學(xué)分析方法，為大規(guī)模代謝組學(xué)研究提供了一種新策略。該方法采用拼接式分段掃描模式采集一級質(zhì)譜信息，使用數(shù)據(jù)非依賴(data independent acquisition, DIA)模式采集多個碰撞能下的二級質(zhì)譜信息。方法不僅顯著提高了檢測靈敏度，而且獲得了掃描范圍內(nèi)所有代謝物的質(zhì)譜信息，為后續(xù)回溯性分析提供了可能。該方法結(jié)合代謝物一級質(zhì)譜精確質(zhì)量及同位素分布、二級質(zhì)譜譜圖相似度及母離子和子離子強(qiáng)度相關(guān)性等標(biāo)準(zhǔn)，使代謝物的定性準(zhǔn)確率高于94%。此外，采用一級母離子結(jié)合二級特征碎片離子的方式，對各種代謝物進(jìn)行定量。對沒有干擾的代謝物，采用一級母離子進(jìn)行定量；對于含有同分異構(gòu)體的代謝物，采用特征碎片離子進(jìn)行定量。

方法的創(chuàng)新性主要體現(xiàn)在4個方面：(1) DI-MS提高了分析通量，2～3 min即可完成單個樣本的分析；(2) DIA模式提高了代謝物的二級覆蓋度，支持?jǐn)?shù)據(jù)可回溯性分析; (3) 綜合多維度質(zhì)譜信息的定性策略提高了代謝物注釋的可靠性；(4) 特征碎片離子定量法可實現(xiàn)含同分異構(gòu)體代謝物的定量，方法穩(wěn)定可靠。截至目前，鮮有nanoESI DI-HRMS結(jié)合DIA技術(shù)用于代謝組學(xué)數(shù)據(jù)定性定量研究的報道，該方法在獲取代謝物一級和二級質(zhì)譜信息方面具有獨特優(yōu)勢，將在大規(guī)模人群隊列樣品的高通量代謝組學(xué)研究中發(fā)揮積極作用。

另一方面，傳統(tǒng)的細(xì)胞代謝組學(xué)研究通常需要數(shù)百萬個細(xì)胞以實現(xiàn)代謝組的高覆蓋。減少代謝組學(xué)所需的細(xì)胞數(shù)量有利于拓展研究領(lǐng)域，如對干細(xì)胞、循環(huán)腫瘤細(xì)胞和從組織獲得的數(shù)目稀少的原代細(xì)胞的研究。數(shù)十個細(xì)胞的代謝組學(xué)研究不依賴群體細(xì)胞培養(yǎng)，有利于節(jié)約人力物力，縮短實驗周期，使得細(xì)胞生物學(xué)研究更為便捷。因此，開發(fā)針對數(shù)十個細(xì)胞的代謝組學(xué)分析方法具有重要意義?；诖?，許國旺課題組[2]在上述工作基礎(chǔ)上，建立了一種nanoESI DI-HRMS拼接式質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集新方法，該方法基于毛細(xì)管微探針的細(xì)胞取樣和96孔板脂質(zhì)在線提取，在3 min內(nèi)可從20個哺乳動物細(xì)胞中檢測到19類脂質(zhì)和500多種脂質(zhì)代謝物。

方法優(yōu)越的分析性能主要體現(xiàn)在4個方面：

(1) 毛細(xì)管微探針可以準(zhǔn)確、快速、可重復(fù)地采集數(shù)十個細(xì)胞，適用于數(shù)目受限的稀有細(xì)胞分析；(2) 細(xì)胞直接在96孔板中進(jìn)行脂質(zhì)提取，減少了常規(guī)預(yù)處理方法造成的痕量樣本損失; (3) nanoESI DI-HRMS顯著降低了離子抑制效應(yīng)，提高了分析通量；(4) 拼接式質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集顯著提高了檢測靈敏度，有助于實現(xiàn)數(shù)十個細(xì)胞中脂質(zhì)組的廣泛覆蓋。截至目前，數(shù)十個細(xì)胞代謝組學(xué)分析仍然十分困難，急需好的方法。該工作發(fā)展的方法在細(xì)胞取樣、分析通量、檢測靈敏度方面具有獨特優(yōu)勢，將在循環(huán)腫瘤細(xì)胞等珍稀臨床樣本的代謝組學(xué)分析中發(fā)揮重要作用。

該實驗室上述兩項工作通過采用拼接式數(shù)據(jù)采集模式的nanoESI DI-HRMS，發(fā)展先進(jìn)的數(shù)據(jù)處理算法，實現(xiàn)了從20個細(xì)胞到大規(guī)模人群樣品的快速、高靈敏度的代謝組學(xué)分析。