李亞，熊英，黃鵬，普俊學(xué)

炎可寧片為《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》收載品種，為常用中成藥之一，由黃柏、大黃、黃芩、板藍(lán)根、黃連5 味中藥制成，具有清熱瀉火、消炎止痢的功效，臨床用于急性扁桃腺炎、細(xì)菌性肺炎、急性結(jié)膜炎、中耳炎、癤癰瘰癘、急性乳腺炎、腸炎、細(xì)菌性痢疾及急性尿道感染的治療。有關(guān)炎可寧片成分研究的文獻(xiàn)較多，主要為對處方中各藥味單一或多個指標(biāo)成分進行含量測定的方法研究，為了使炎可寧片的質(zhì)量得到進一步的控制，本文簡要綜述了炎可寧片含量測定方法的研究進展，以期為炎可寧片的質(zhì)量控制提供一定幫助。

1 高效液相色譜法

高效液相色譜法是一種高效、高靈敏度、易回收的分析分離技術(shù)，廣泛應(yīng)用于中藥以及中藥制劑中多成分、微量成分的含量測定。本文中關(guān)于炎可寧片含量測定主要涉及的是分配色譜中的液-固色譜，通過配制一定濃度的對照品和供試品溶液，在平行條件下，測得供試品和對照品溶液的響應(yīng)信號（吸收峰面積），采用外標(biāo)法得出待測物的含量。

1.1 鹽酸小檗堿 鹽酸小檗堿又稱黃連素，是一種異喹啉生物堿，主要來源于黃柏、黃連、三顆針，具有抗菌、抗炎、抗腫瘤、降血糖、降血壓等藥理作用［1］。現(xiàn)代藥理研究表示，該成分可抑制生物膜的形成，起到廣譜抗菌作用，同時抑制白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，減少炎性反應(yīng)［2-3］。

制劑生產(chǎn)中，黃柏以水煎提取后醇沉成稠膏入藥，受初膏濃度、溫度、醇料比等條件［4-5］的影響，鹽酸小檗堿易損失。因此鹽酸小檗堿除了能影響炎可寧片的藥效外，還能反映制劑工藝的提取、純化情況，是炎可寧片的質(zhì)量控制指標(biāo)之一。

鹽酸小檗堿多以游離態(tài)存在，為增大其提取率，一般用鹽酸與甲醇的配比溶液對樣品進行超聲提取。張飛［6］在研究炎可寧片中鹽酸小檗堿的提取時，分別采用配比為500 ∶1和100：1 的甲醇-鹽酸溶液對炎可寧片中的鹽酸小檗堿進行提取，前者的提取效率優(yōu)于后者。

周靜安［7］建立了反相離子對色譜法測定鹽酸小檗堿的含量，以庚烷磺酸鈉作為反離子對，Shim-pack VP-ODS（200 mm×4.6 mm，5 μm）為色譜柱，乙腈-磷酸鹽緩沖液為流動相，得出鹽酸小檗堿的線性范圍為16.0～128.0 μg/ml。該方法獲得的鹽酸小檗堿含量真實，但不能完全反映主藥黃柏的質(zhì)量。

田軍等［8］對研細(xì)后的炎可寧樣品以稀乙醇為溶液進行超聲提取，色譜柱為 C18 柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），流動相0.05 mol/L 磷酸二氫鈉（使用磷酸調(diào)節(jié)pH 至3）：乙腈（70 ∶30），檢測波長為210 nm。結(jié)果顯示，對照品與供試品的峰皆在19.1 min 出現(xiàn)，且陰性對照顯示無干擾，專屬性強。

陳進等［9］和袁夢哲等［10］將樣品除去包衣后用鹽酸-甲醇（1 ∶100）溶液超聲處理，并經(jīng)中性氧化鋁柱洗脫分離，兩者皆使用C18 作為固定相，乙腈與磷酸二氫鉀的配比溶液作為流動相。為較大程度地除去干擾，可考慮在之后的鹽酸小檗堿研究中使用堿性氧化鋁進行樣品的前處理［11］。

宋冬梅等［12］和姜范成等［13］皆使用乙腈-0.1%磷酸溶液（50 ∶50）為流動相；前者采用Inertsil ODS-3，檢測波長為345 nm。后者采用Welch Plus-C18 作為色譜柱，測定波長為265 nm。兩者在流動相中加入了十二烷基磺酸鈉，其陰離子形式可與被測組分離子結(jié)合，可提高分離度，優(yōu)化分析效果。實際所得鹽酸小檗堿含量與根據(jù)藥典進行分析所得理論含量不同，僅為其一半，推測可能原因之一是黃柏在經(jīng)水提醇沉的過程中丟失了部分鹽酸小檗堿，二是當(dāng)時2015 版藥典僅對味連有限度要求，因此黃連來源會影響鹽酸小檗堿含量?，F(xiàn)2020 版藥典補充了雅連、云連的限度要求，由此可減少品種變換所造成的含量差異。

1.2 黃芩苷 黃芩苷是黃酮類化合物，具有抗菌、抗氧化、抗病毒和抗癌等藥理作用［14-15］。其通過直接作用于免疫細(xì)胞，抑制炎癥細(xì)胞因子，起到抗炎作用［16］，但其在體內(nèi)的生物利用度偏低［17］，為炎可寧片的質(zhì)量控制指標(biāo)之一。

周靜安［18］通過設(shè)置不同的提取時間、柱溫、流動相中乙腈與磷酸的配比進行試驗，發(fā)現(xiàn)20 min 的提取時間、30 ℃的柱溫、乙腈與0.01%磷酸溶液22 ∶78 的配比，是最佳的測定條件，為之后的黃芩苷測定提供參考。

李鐵純等［19］和伊文敏［20］以Kromasil C18 作為色譜柱，前者以甲醇-水-磷酸（60 ∶40 ∶0.2）為流動相，在280 nm 檢測波長處測定黃芩苷的含量；后者在316 nm 檢測波長、甲醇-冰醋酸-水（50 ∶1 ∶50）作為流動相的條件下進行測定。黃芩苷的測量應(yīng)加入陰性對照，驗證其結(jié)果的真實性。

高長青等［21］以O(shè)DS 柱分離黃芩苷，以甲醇-水-醋酸（40 ∶60 ∶1）為流動相進行含量測定。結(jié)果顯示，黃芩苷在8 min 出峰，且與其他成分峰無重合，黃芩苷在0.25～2.50 μg 時與峰面積呈線性關(guān)系，最低檢測限為3.7 μg/ml。經(jīng)驗證回收率約為99%，所得含量真實。

張軍榮等［22］和鄢長余等［23］以70%乙醇作為溶劑并加熱回流30 min 得供試品溶液。兩者皆在280 nm 波長下采用外標(biāo)法分別在Dikma C18、甲醇-水-磷酸（47 ∶53 ∶0.2）和Welch Plus-C18、流動相甲醇-0.2%磷酸水溶液（47 ∶53）的色譜條件下對黃芩苷進行測量。結(jié)果顯示，通過以上方法測定黃芩苷含量的專屬性強，結(jié)果真實，重復(fù)性好。

1.3 大黃蒽醌類化合物 大黃蒽醌類化合物是大黃的有效成分，多以二蒽醌與苷結(jié)合的形式存在，包括蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚，有抗炎、抗腫瘤、抗纖維化等藥理作用［24］。在大黃蒽醌的提取工藝研究中，一般采用乙醇或甲醇回流提取、稀酸水解，最后三氯甲烷萃取三步驟。該提取方法用于樣品前處理能提高柱效和分離效果。

1.3.1 大黃總蒽醌 尹永芹等［25］在色譜柱 Kromasil C18、流動相甲醇-0.1%的磷酸水溶液、檢測波長254 nm 的色譜條件下采用梯度洗脫的方法對大黃中5種蒽醌成分進行同時定量，能較全面地反映大黃的質(zhì)量、提取純化情況。該作者通過標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定總蒽醌含量，顯示大黃素和大黃酚所占含量比例較高，易檢測，可作為大黃制劑的特征組分。

1.3.2 大黃酚 于遠(yuǎn)洋等［26］在色譜柱Welch Plus-C18、流動相甲醇-0.1%磷酸溶液（85 ∶15）、測定波長254 nm 的色譜條件下對樣品進行測定，色譜圖顯示大黃酚的保留時間約為6 min，峰形對稱，與其他成分無重合，且缺大黃的陰性樣品顯示無干擾。該方法經(jīng)方法學(xué)驗證，適于炎可寧片中大黃酚的測定。

1.3.3 大黃素和大黃酚 劉譯［27］對同一廠家10 個批次的炎可寧片成分進行測定。設(shè)置色譜條件為：色譜柱Dikma C18；流動相甲醇-水-冰醋酸（80 ∶20 ∶1）；檢測波長254 nm，在該色譜條件下，目標(biāo)物與其他組分峰分離度皆大于1.5，同時該10 批次測得含量相對標(biāo)準(zhǔn)差（RSD）皆小于6%，回收率為98%，結(jié)果真實可信。根據(jù)該實驗的研究結(jié)果可得大黃素和大黃酚的含量限度，不低于0.08 mg/片（0.3 g 劑量）。

張大軍等［28］對供試品的制備方法進行考察，以成分含量作為指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)采用三氯甲烷作為提取溶劑，加熱提取，萃取三次以上可使目標(biāo)物提取完全。在色譜柱Shim-pack C18、流動相甲醇-0.1%磷酸（85 ∶15）、檢測波長254 nm 的色譜條件下對樣品進行測定，所得圖譜特征峰明顯，分離度較好。測定結(jié)果顯示每片含大黃素和大黃酚總量均不少于0.4 mg。

林遠(yuǎn)鳳等［29］以Shimadzu C18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）為色譜柱，254 nm 為檢測波長，對不同組分和配比的流動相進行考察，最后確定甲醇-0.1%磷酸溶液（85 ∶15）為流動相。在該條件下所得成分峰形對稱，分離度好。且經(jīng)方法學(xué)考察，大黃素0.586～29.300 μg/ml，大黃酚線性范圍為1.581～79.050 μg/ml，兩者回收率均接近100%。

汪秀月［30］采用天津蘭博C18（200 mm×4.6 mm，5 μm）作為色譜柱，流動相為甲醇-0.1% 磷酸溶液（85 ∶15），并對大黃素和大黃酚進行測量。磷酸的加入抑制了酚羥基的水解，減少了色譜峰的拖尾。結(jié)果顯示在該色譜條件下，樣品濃度和峰面積有相關(guān)性，線性范圍寬，大黃素為106.5～535.5 μg/ml，大黃酚為0.207～1.035 mg/ml。

1.3.4 大黃素和大黃酸 有研究采用Venus1lxbp-C18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）為色譜柱；以乙腈-0.2%磷酸溶液（65 ∶35）為流動相對提取液進行梯度洗脫，增加了待測成分在柱上的保留時間［31］。大黃酸約在3 min 處出峰，大黃素約在6 min 出峰，兩者與其他成分峰分離度均大于1.5%，經(jīng)方法學(xué)考察，該法適用于大黃素和大黃酸的測定，但其與其他方法一樣忽略了大黃中其他重要成分的測定，不利于對大黃藥材進行質(zhì)量控制。

1.4 板藍(lán)根成分 板藍(lán)根為菘藍(lán)的干燥根，具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗內(nèi)毒素、抗腫瘤等藥理作用［32-33］，其成分主要為核苷、有機酸、生物堿等9 類物質(zhì)，由于板藍(lán)根制劑的水煎煮工藝致使其有效成分破壞較大［34］，含量太低，儀器不足以檢測。一般采用含量較大、專屬性強的核苷作為板藍(lán)根制劑的測定項［35-38］。

1.5 綜合類 有效控制炎可寧片的質(zhì)量，多采用高效液相色譜法通過改變色譜條件同時對多種成分進行測定，從色譜柱的型號、流動相的組成與比例、檢測波長λ、待測成分四個方面歸納如表1［39-43］，除表1 報道的文獻(xiàn)外，許學(xué)麗等［44］對三個批次炎可寧片中的鹽酸小檗堿、黃芩苷、黃芩素、蘆薈大黃素、漢黃芩素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚進行含量測定，色譜柱為InertSustain C18，流動相為甲醇-乙腈-0.2%磷酸溶液，檢測波長為254 nm，結(jié)果顯示鹽酸小檗堿與黃芩苷的含量最高，但不同批次含量差異較大，如鹽酸小檗堿，三批次含量RSD 大于1（精密性驗證良好，排除分析誤差），推測可能是樣品原料質(zhì)量不均一引起的含量差異。

表1 炎可寧片中各待測成分HPLC 測定方法比較

2 其他方法

2.1 區(qū)帶毛細(xì)電泳法 區(qū)帶毛細(xì)電泳法［45］在中藥分析中分析廣泛，可在色譜的基礎(chǔ)上，通過電泳對物質(zhì)進一步分離分析。生物堿在緩沖體系內(nèi)大多帶有正電荷，一般采用區(qū)帶毛細(xì)電泳法在一定pH 值下，加入有機修飾劑，通過毛細(xì)管對樣品進行分離，根據(jù)電泳譜圖對樣品進行分析。該方法操作簡便，分析高效、高速，廣泛應(yīng)用于藥品的分離分析檢測。

霍鵬等［46］建立了同時用外標(biāo)法測定炎可寧片中小檗堿、巴馬汀、藥根堿、大黃素、大黃酸含量的區(qū)帶毛細(xì)管電泳法。用甲醇超聲提取樣品兩次后合并提取液得到供試品，并對電泳條件進行考察，在未涂層彈性石英毛細(xì)管中，確定90 mmol/L Tris-10 mmol/LCit（含30%乙腈，pH=8）的緩沖體系、25 kV 的分離電壓、8 s 的進樣時間為較佳測定條件。該方法分辨率高，便于分離帶電離子，但巴馬汀和小檗堿由于結(jié)構(gòu)相似，難以達(dá)到基線分離。

2.2 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC－MS/MS）法 液相色譜（LC）儀器與各種MS 儀器相結(jié)合［47-48］，不僅可以提供藥物的含量與結(jié)構(gòu)信息，也不要求成分完全分離，且不需要揮發(fā)或衍生化，靈敏高效且易操作，具有高效的分離分析能力，還能提供化合物的質(zhì)量信息，在藥學(xué)領(lǐng)域被廣泛使用。張丹等［49］對炎可寧片中五種藥味的指標(biāo)成分黃芩苷、鹽酸小檗堿、鹽酸黃柏堿、腺苷、大黃素的含量進行同時測定。色譜條件：色譜柱 ACQUITY UPLC BEN C18，流動相乙腈-0.1%甲酸；質(zhì)譜條件：電噴霧離子源，正負(fù)離子切換模式掃描，多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）去除干擾信號。該測定方法采用色譜和質(zhì)譜兩種儀器共用分析，通過設(shè)置混合對照和陰性對照，準(zhǔn)確并高效對炎可寧片的各成分進行測定。

3 結(jié)語

經(jīng)方法學(xué)研究考察，各測定方法的線性、重現(xiàn)性以及回收率等均較好，對于炎可寧片的含量測定皆具有可行性。對于炎可寧片成分的含量測定，多采用高效液相色譜法，該方法因靈敏度高、專屬性強、檢測限低，更適用于炎可寧片的質(zhì)量控制與分析。

炎可寧片是由多種藥味組成的中藥復(fù)方，方中的各味藥都是不可取代的，單一成分并不能如實反映其產(chǎn)品的質(zhì)量，因此建議結(jié)合處方方解，以多成分作為炎可寧片質(zhì)量的評估指標(biāo)，以便全面科學(xué)地控制藥品質(zhì)量。