王佳 趙卿

肝癌作為常見癌癥之一,其發(fā)病率和致死率均比較高,調(diào)查研究資料顯示,目前該病發(fā)病率在全球前三位。有報道研究指出,維生素在血液凝固中有著非常重要的作用,特別是對心血疾病、骨骼健康［1］。也有研究表示,維生素K 在腫瘤形成以及生長中具有抑制功效,特別是維生素K2［2］。本文就維生素K2通過降低DBP 活性抑制肝癌的效果進行討論分析?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 根據(jù)研究要求,將人源肝細胞HepG2細胞分為過表達DBP 組(A 組)、空載體質(zhì)粒對照組(B 組)、敲低D-雙功能蛋白組(C 組)、對照小干擾RNA 組(D 組)。其中A 組和C 組分別使用0～100 μmol/L不同濃度的維生素K2進行處理。

1.2 實驗方法 把HepG2 細胞接種至孔板中進行培養(yǎng),溫度為37℃,CO2濃度為5%,當(dāng)細胞生長到70%融合度時予以轉(zhuǎn)染。根據(jù)轉(zhuǎn)染試劑使用要求,將質(zhì)粒、小干擾RNA 分別溶解在沒有血清、抗生素的RPMI1640 培養(yǎng)液中將其混合均勻。將脂質(zhì)體Lipo-fectamine2000TM 溶解在沒有血清與抗生素的RPMI1640 培養(yǎng)液中混合均勻,在室溫放置5 min。把上述轉(zhuǎn)染試劑分別和脂質(zhì)體混合均勻,在室溫放置20 min。而后棄去孔板中原有培養(yǎng)基,且利用新鮮沒有血清和抗生素RPMI1640 的培養(yǎng)基對細胞進行洗滌2次。把各組脂質(zhì)體以及質(zhì)粒混合液滴入到每孔細胞中,放置在37℃環(huán)境中進行培養(yǎng)。6 h 后更換含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基,培養(yǎng)48 h 后用于后面的實驗。

經(jīng)過處理的細胞在蛋白提取、蛋白定量后借助裂解液稀釋成濃度為5 μg/μl 的懸液,而后加上5×上樣緩沖液在95℃條件下煮沸5 min。制作SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),實施蛋白上樣以及凝膠電泳,經(jīng)電泳把蛋白膠轉(zhuǎn)導(dǎo)聚偏二氟乙烯膜(PVDF 膜),利用5%脫脂奶粉實施封閉,而后分別加入兔抗人DBP 以及β-actin 抗體,將其放入4℃冰箱溫育,同時TPBS 洗膜,使用熒光二抗在室內(nèi)靜置孵育大約1 h,再用TBST洗膜2 次,時間10 min,最后借助于Odys-sey 發(fā)光掃描。根據(jù)說明書把CCK-8 試劑和無血清的RPMI1640培養(yǎng)基按照比例1∶4 混合,接著把轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)了48 h的96孔板中培養(yǎng)基去除,在每孔中添加CCK-8混合液,劑量為100 μl,放置在37℃及5%CO2下進行培養(yǎng),時間4 h,而后借助酶標(biāo)儀于450 nm 位置讀取吸光度值。采取Western-blot 進行DBP 表達變化的檢測,通過CCK進行細胞增殖能力的檢測,結(jié)果以相對吸光度值表示。經(jīng)放射免疫進行E2水平的分析測定,根據(jù)E2放射免疫試劑盒說明書,取8 個試管,將其做好標(biāo)記,根據(jù)試劑盒說明書上的要求,分別添加稀釋緩沖液,將其充分混勻,放置扎37℃,在1.5 h 后添加添加分離劑進行充分混勻,在4℃、3600 r/min 條件下離心20 min,去除上清液,以γ 計數(shù)儀對各管放射性活度強度進行測定。取待測定的培養(yǎng)基來代替標(biāo)準(zhǔn)品,添加標(biāo)記物和抗體進行混勻,放置在37℃1.5 h 以后添加分離劑進行混勻,在4℃、3600 r/min 條件下進行離心,時間20 min,去除上清液,測定E2含量。結(jié)果以每毫升樣品含有E2的量(ng/ml)表示。

1.3 觀察指標(biāo) 分析DBP 表達對肝癌HepG2 細胞增殖、E2水平的影響；不同濃度維生素K2對肝癌細胞增殖、E2以及DBP 表達產(chǎn)生的影響。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS20.0 統(tǒng)計學(xué)軟件對研究數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,采用t 檢驗；計數(shù)資料以率(%)表示,采用χ2檢驗。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DBP 表達對肝癌HepG2 細胞增殖、E2水平的影響 A組HepG2細胞增殖明顯高于B組,D組高于C組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。經(jīng)Western 實驗,DBP過表達質(zhì)粒、干擾RNA 對HepG2 細胞進行轉(zhuǎn)染以后,可對DBP 表達進行干預(yù)。通過CCK-8 實驗發(fā)現(xiàn),DBP過表達以及敲低可相應(yīng)的增加或者減少細胞數(shù)量。A 組E2水平低于B 組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。DBP過表達使細胞E2分泌水平下降。見表1。

表1 四組HepG2 細胞增殖、E2 水平比較(±s)

表1 四組HepG2 細胞增殖、E2 水平比較(±s)

注：與B 組比較,aP＜0.05；與C 組比較,bP＜0.05；“-”表示無數(shù)據(jù)

2.2 不同濃度維生素K2對肝癌細胞增殖、E2以及DBP 表達產(chǎn)生的影響 經(jīng)CCK-8 實驗分析發(fā)現(xiàn),和B 組比較,A 組HepG2 細胞增殖明顯加強,在分別使用不同濃度的維生素K2處理2 d 后,細胞增殖表現(xiàn)為依賴性下降。采用小干擾RNA 敲低DBP 的表達后,細胞增殖顯著下降,但是維生素K2的處理對其細胞增殖產(chǎn)生的影響不是很大。采用不同濃度維生素K2對B 組、A 組HepG2 細胞進行處理2 d 后,對培養(yǎng)基的E2水平進行檢測,經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)當(dāng)維生素K2劑量不斷上升時,培養(yǎng)基中E2水平也會相應(yīng)上升。采用濃度100 μmol/L維生素K2對B 組、A 組HepG2 細胞進行處理后,DBP蛋白表達變化不顯著。

3 討論

肝癌一般分為原發(fā)性與繼發(fā)性,其中原發(fā)性肝癌起源于肝臟上皮組織或者間葉組織,原發(fā)性肝癌目前在國內(nèi)屬于高發(fā)疾病,危害非常大；繼發(fā)性肝癌又叫做肉瘤,和原發(fā)性肝癌相比在臨床中比較少見。繼發(fā)性或稱之為轉(zhuǎn)移性肝癌,是指全身多個器官所致惡性腫瘤侵犯到肝臟。通常見于胃、子宮、乳腺、膽道、肺、胰腺、子宮、結(jié)直腸以及卵巢等器官惡性腫瘤的肝轉(zhuǎn)移。原發(fā)性肝癌病因和確切分子機制目前還不清楚,多認(rèn)為該病的發(fā)生是多因素和多步驟的一個復(fù)雜過程,不僅受環(huán)境的影響,同時也受飲食的影響。目前大量實驗研究資料和流行病學(xué)表明,肝硬化、乙型肝炎病毒感染、微量元素、丙型肝炎病毒感染、酒精、黃曲霉素、亞硝胺類物質(zhì)、飲水污染以及性激素等均和肝癌的發(fā)生有關(guān)。繼發(fā)性肝癌可經(jīng)不同途徑(比如淋巴液轉(zhuǎn)移、血液轉(zhuǎn)移或者直接浸潤而形成疾病)。原發(fā)性肝癌早期肝癌癥狀無特性,一般中晚期肝癌癥狀表現(xiàn)比較多,多為肝區(qū)疼痛、上腹部包塊、腹脹、消瘦、納差、進行性肝大、乏力等,部分患者可能出現(xiàn)上消化道出血、低熱、腹瀉以及黃疸等,肝癌破裂以后還可能會出現(xiàn)急腹癥表現(xiàn)等,也有部分患者癥狀表現(xiàn)不是很明顯,可能會出現(xiàn)轉(zhuǎn)移灶癥狀。

肝癌惡性程度相對比較高,不管是發(fā)病率還是病死率均比較高,同時手術(shù)預(yù)后比較差,關(guān)于其發(fā)病機制以及靶向治療方面的內(nèi)容現(xiàn)已得到很多醫(yī)學(xué)研究人員的關(guān)注。維生素K2屬于脂溶性維生素,作為人體中不可或缺的一種重要維生素,通常經(jīng)一些生物合成技術(shù)合成,維生素K2多數(shù)存在于發(fā)酵的食物中,在日常生活中有很多的人都缺乏該維生素。維生素K2作為維生素K 唯一具備生物活性的一種形式,一般用于加速凝血、治療維生素K 缺乏所致出血癥以及維持凝血時間等,該藥對人體的功能多體現(xiàn)于骨質(zhì)疏松的預(yù)防以及治療,不僅具備保健功效,同時還具備藥用功效。和維生素K1相比較,維生素K2所具有的抗骨質(zhì)疏松作用很是明顯,有利于骨礦化,骨鈣素可促進鈣鹽沉積,使骨礦化速率上升,以此維持骨正常鈣化與結(jié)晶形成,直接反映骨形成以及骨重建。維生素K2作為骨特異基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)劑,經(jīng)類固醇與異質(zhì)物受體誘導(dǎo)成為骨細胞標(biāo)記物的表達,提高膠原蛋白蓄積功效,改善骨質(zhì)量。維生素K2對于軟骨、血管鈣化還具備強烈抑制功效,可清除異常鈣斑。有研究報道表示,骨質(zhì)疏松、血管硬化以及骨關(guān)節(jié)炎等相關(guān)疾病都有一個相同致病因子,即缺乏維生素K2。此外,相關(guān)報道表示,維生素K2可抑制多種腫瘤細胞增殖,經(jīng)負調(diào)控和細胞癌變相關(guān)的磷酸酯酶活性、酪氨酸激活性,調(diào)節(jié)和細胞增殖有關(guān)的各種調(diào)控因子,以此抑制細胞周期或者使細胞死亡［4］。DBP 屬于氧化還原代謝酶,可促進雌二醇脫去氫離子喪失活性,故生物體內(nèi)雌二醇量變化可當(dāng)做DBP 活性上升減少的一個重要指標(biāo)。相關(guān)研究報道表示,DBP 于肝癌HepG2 細胞中顯著高表達,可使E2表達水平下降繼而進一步促進肝癌細胞的增殖。另外由于肝癌中DBP 表達和腫瘤標(biāo)志物的表達相關(guān)性比較好,故在肝癌的診斷以及治療中可將DBP 作為新靶點。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)HepG2 細胞內(nèi)維生素K2能夠和DBP 相結(jié)合以此影響其活性,故維生素K2很有可能通過與DBP 的互相作用而使其活性下降,同時E2水平上升,以此發(fā)揮抑制肝癌細胞增殖的功效［5］。以往相關(guān)報道研究指出,人源肝癌組織中DBP 表達處于高水平狀態(tài)時,肝癌HepG2 細胞中DBP 表達上升會使E2水平表達下降,繼而造成癌細胞增殖基因中的cyclinD1 和增殖細胞核抗原(PC-NA)等表達顯著上升,這些最后均會使肝癌細胞增殖［6］。本次研究發(fā)現(xiàn),維生素K2和DBP 之間互相作用使得DBP 活性下降,繼而造成細胞內(nèi)E2水平明顯增加,從而抑制了肝癌細胞增殖。

綜上所述,維生素K2可抑制肝癌細胞增殖,維生素K2通過與DBP 互相作用,使得DBP 活性下降,E2表達水平上升,以此抑制肝癌細胞增殖。