王曉娟，黃利春，張樹振

(1.上?？萍拣^，上海自然博物館自然史研究中心，上海 200127；2.科爾沁右翼前旗農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，內(nèi)蒙古 科爾沁右翼前旗 137713；3.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 草業(yè)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052)

作為蝶形花植物的典型代表，豆科牧草大多為雌雄同花但異花授粉，結(jié)實(shí)依賴傳粉昆蟲。圍繞豆科牧草實(shí)際種子產(chǎn)量遠(yuǎn)低于潛在種子產(chǎn)量這一問題，前人提出昆蟲傳粉是制約其種子產(chǎn)量的重要因素[1]。傳粉是一個(gè)復(fù)雜的過程，可概括為花粉釋放—轉(zhuǎn)運(yùn)—降落3 個(gè)動(dòng)態(tài)過程?；ǚ坩尫啪哂幸欢ǖ臅r(shí)空效應(yīng)，花藥開裂是花粉釋放的前提，昆蟲作用是花粉釋放的必要條件，花粉運(yùn)輸必須借助傳粉昆蟲，而花粉的沉降同樣離不開傳粉者的參與。因此，花粉來源及其活力可能影響種子形成，間接制約種子的產(chǎn)量[2]。由于雌配子體依次被包埋在胚珠、子房中，因此，被子植物在進(jìn)化過程中形成了一種特殊的運(yùn)送雄配子的方式—花粉管伸長(zhǎng)和引導(dǎo)，即包含有2 個(gè)精細(xì)胞和1 個(gè)營(yíng)養(yǎng)核的花粉管從雌蕊柱頭定向延伸，將攜帶的2 個(gè)精子送達(dá)胚珠從而實(shí)現(xiàn)雙受精[3]。通常，花粉到達(dá)柱頭后經(jīng)過分泌物水合，繼而萌發(fā)生長(zhǎng)，在引導(dǎo)組織的引導(dǎo)下，最終到達(dá)胚囊與胚珠結(jié)合，完成雙受精。研究發(fā)現(xiàn)：一些常見豆科牧草胚珠敗育嚴(yán)重，如紫花苜蓿(Medicago sativa)實(shí)際種子產(chǎn)量?jī)H為潛在種子產(chǎn)量的4%，自然授粉條件下每小花平均胚珠數(shù)達(dá)13 個(gè)，結(jié)籽數(shù)卻僅為2～3 個(gè)[4-5]。BOS 等[6]認(rèn)為實(shí)際種子產(chǎn)量低于潛在種子產(chǎn)量是豆科牧草為了適應(yīng)生存而逐漸形成的繁殖策略。

前人研究發(fā)現(xiàn)：大部分植物花的胚珠數(shù)都要多于其種子數(shù)[7]。針對(duì)這種現(xiàn)象存在2 種不同假說：一是廣泛選擇也稱選擇性敗育假說，通過開花樣式增加對(duì)傳粉者的吸引，通過選擇高質(zhì)量的后代提高雌性適合度；二是雄性功能假說，通過高質(zhì)量的花粉傳播提高雄性適合度，這樣可以補(bǔ)充因植食作用、天氣或其他外界因素對(duì)花的破壞，保證資源和花粉的可利用性[8]。也有學(xué)者提出了花粉限制機(jī)制和資源限制機(jī)制2 種假說，前者強(qiáng)調(diào)因沒有足夠數(shù)量的花粉傳遞到柱頭上而引起結(jié)實(shí)率低下，后者則指出沒有足夠多的營(yíng)養(yǎng)資源供果實(shí)和種子發(fā)育成熟導(dǎo)致種子敗育[9]。依據(jù)上述假說，植物形成多的花是一種“賭注策略”，其目的是在沒有花粉限制和資源限制的條件下產(chǎn)生更多的后代[6]。

盡管以上觀點(diǎn)側(cè)重點(diǎn)不同，但是依然能發(fā)現(xiàn)二者之間的共同點(diǎn)：都強(qiáng)調(diào)了花粉因素，在傳粉過程中花粉量不足可能制約種子產(chǎn)量，胚珠敗育可能間接反映了花粉量不足。然而，對(duì)于大部分植物而言，導(dǎo)致果實(shí)與花(花器官)比率低下的原因還知之甚少，對(duì)豆科牧草多胚珠和低結(jié)實(shí)率現(xiàn)象還少有關(guān)注，有關(guān)授粉后的花粉管引導(dǎo)和受精后胚胎發(fā)育的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)缺乏。目前，關(guān)于這一問題的討論仍然是植物繁殖生物學(xué)研究的熱點(diǎn)。DUAN 等[10]研究揭示了擬南芥(Arabidopsis thaliana)中受體激酶(FERONIA) 具有確保精子遞送和阻止多重受精的作用，F(xiàn)ERONIA 通過一系列功能上相互聯(lián)系的控制過程，阻止多個(gè)花粉管進(jìn)入雌配子體。另有研究關(guān)注棗(Ziziphus jujuba)和長(zhǎng)瓣短柱茶(Camellia grijsii)的花粉管引導(dǎo)，探討其結(jié)實(shí)障礙問題[11-12]。前期本課題組在開展苜?；ǚ酆团咧檫z傳變異[5]、傳粉昆蟲訪花行為及其環(huán)境互作[13-14]、花部適應(yīng)機(jī)制和傳粉系統(tǒng)[15]、花粉管極性引導(dǎo)[16]以及雌、雄配子體發(fā)育和胚胎發(fā)生[17-18]等繁殖生物學(xué)研究過程中，發(fā)現(xiàn)常見豆科牧草種子生產(chǎn)依靠傳粉昆蟲，但胚珠敗育嚴(yán)重影響了每莢種子數(shù)，實(shí)際種子產(chǎn)量遠(yuǎn)低于理論種子產(chǎn)量這一問題。

鑒于此，本研究圍繞3 種常見豆科牧草紫花苜蓿(Medicago sativa)、多變小冠花(Coronilla varia)和百脈根(Lotus cornioulatous)的胚珠敗育現(xiàn)象，通過異花授粉后不同時(shí)期3 種豆科牧草花粉管生長(zhǎng)、引導(dǎo)和胚珠受精的顯微觀察，探究其胚珠敗育發(fā)生的限制因素。

1 材料與方法

1.1 供試材料和研究地點(diǎn)

供試材料為多年生紫花苜蓿(M.sativa)、多變小冠花(C.varia)和百脈根(L.cornioulatous)，栽種于甘肅武威河西實(shí)驗(yàn)站(E102°84′，N37°67′，海拔1 593 m)，該地區(qū)年均日照總時(shí)間1 664～2 532 h，年平均降水量154.6 mm，年均氣溫8 ℃。其中，紫花苜蓿為總狀花序，小冠花和百脈根為傘形花序，3 種豆科牧草都有無限開花習(xí)性，花期較長(zhǎng)。紫花苜蓿開花期為5 月中下旬至7 月下旬，長(zhǎng)達(dá)70 d 左右，6 月上旬至下旬為盛花期，單個(gè)小花完全開放可以持續(xù)7 d 左右。多變小冠花花期5 月中下旬至7 月下旬，花期長(zhǎng)達(dá)50～60 d，6 月上旬至下旬為盛花期，單個(gè)小花的花期為10 d 左右。百脈根花期6 月初至7 月下旬，長(zhǎng)達(dá)50 d 左右，6 月中旬至7 月上旬為盛花期，單個(gè)小花的花期為15 d 左右(圖1)。

1.2 苜蓿、小冠花和百脈根的人工和自然授粉雜交處理

每種牧草在試驗(yàn)地隨機(jī)標(biāo)記5 株，于盛花期分別進(jìn)行人工自交授粉、人工異交授粉和自然授粉，每株每個(gè)處理選擇10 個(gè)花序，每個(gè)花序處理7～10 朵小花。人工授粉在晴天9：30—11：30和15：00—16：00 進(jìn)行。其中，異交授粉保證父本的花粉離母株在2～5 m，且花粉量充足，一般選擇3～5 朵小花授予母本的柱頭上。授粉前對(duì)父本的花粉進(jìn)行檢驗(yàn)，保證花粉平均活力≥80%。

1.3 苜蓿、小冠花和百脈根柱頭的可授性和角質(zhì)層檢測(cè)

根據(jù)3 種豆科牧草的開花特性，將其小花花期分為3 個(gè)階段：花冠緊閉、花冠展開(花藥未裂) 和花冠展開(花藥開裂)。3 種豆科牧草每株隨機(jī)選取5 朵小花，采用聯(lián)苯胺—過氧化氫法對(duì)其柱頭可授性進(jìn)行檢驗(yàn)，反應(yīng)液配方為聯(lián)苯胺(1%)∶過氧化氫(3%)∶水=4∶11∶22 (體積比)[19]。把小花的雌蕊解剖出來，放到載玻片上，滴加反應(yīng)液后移到解剖鏡下觀察，如果立刻出現(xiàn)大量氣泡說明柱頭具有可授性，反之則沒有可授性。3 種豆科牧草每個(gè)單株隨機(jī)選取5 朵小花，將雌蕊解剖出來，放到載玻片上，用0.02%中性紅染色，在解剖鏡下觀察，出現(xiàn)紅色則說明存在角質(zhì)層，反之則無角質(zhì)層[20]。

圖1 紫花苜蓿(a)、多變小冠花(b)和百脈根(c)的花Fig.1 Florets of M.sativa (a),C.varia (b) and L.cornioulatous (c)

1.4 苜蓿、小冠花和百脈根花粉管引導(dǎo)的熒光顯微觀察

在標(biāo)記的植株上進(jìn)行人工異花授粉，每個(gè)豆科牧草處理5 個(gè)花序，每個(gè)花序約8 朵小花。分別選取2、4、8、12、24 和48 h 后的小花，卡諾固定液固定24 h，觀察前可轉(zhuǎn)移保存在70%的酒精中。小心解剖出雌蕊，將雌蕊置于8 mol/L 的NaOH 溶液中透明5 h，蒸餾水沖洗2 次，再轉(zhuǎn)移到含有0.1% 苯胺藍(lán)的0.1 mol/L K3PO4溶液中，于5 ℃的黑暗環(huán)境中過夜染色，去除雌蕊，置于滴有50% 甘油和50% 0.5 mol/L 碳酸鹽緩沖液(抗熒光淬滅)，蓋片，用手指均勻擠壓，置于熒光顯微鏡(OLYMPUS BX51，Japan)下觀察照相。每個(gè)小花觀察4 個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)胚珠的受精率，有花粉管進(jìn)入胚珠則視為胚珠受精，沒有花粉管到達(dá)的胚珠則視為未受精。

1.5 苜蓿、小冠花和百脈根胚珠敗育位置及其敗育率統(tǒng)計(jì)

在莢果成熟時(shí)分別對(duì)3 種牧草莢內(nèi)種子的敗育位置進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，每種植物統(tǒng)計(jì)100 個(gè)莢，敗育位置分為上部、中部和下部3 個(gè)部位，連接莢果的部位是下部，莢果頂端是上部，中間部分統(tǒng)稱中部。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

苜蓿、小冠花和百脈根胚珠受精率和胚珠敗育率用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示；3 種豆科牧草異花授粉后不同時(shí)間胚珠受精率和胚珠敗育率采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，利用最小顯著差數(shù)法(LSD)，當(dāng)P＜0.05 時(shí)，表明存在顯著差異；當(dāng)P＜0.01時(shí)，存在極顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 3 種豆科牧草的柱頭可授性和柱頭角質(zhì)層

分別選取3 種豆科牧草3 個(gè)不同開放階段的小花：花冠緊閉、花冠展開(花藥未裂) 和花冠展開(花藥開裂)，柱頭可授性試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：3 種豆科牧草在小花開放的各個(gè)階段，柱頭對(duì)聯(lián)苯胺—過氧化氫都有積極的反應(yīng)，即使是在第1 階段小花還沒有開放，花瓣緊閉時(shí)，柱頭也會(huì)有零星氣泡產(chǎn)生，不過量少而且速度極慢。到小花開放的第2 階段，即花藥裂開但花瓣內(nèi)的雌雄合蕊還沒有釋放出來時(shí)，除小冠花外，另外2 種牧草的柱頭反應(yīng)強(qiáng)烈。到第3 階段小花完全開放時(shí)，3 種牧草的柱頭對(duì)聯(lián)苯胺—過氧化氫反應(yīng)都很強(qiáng)烈，柱頭瞬間會(huì)產(chǎn)生大量的氣泡，而且氣泡很大。以上結(jié)果表明：花冠展開(花藥開裂)階段是3 種豆科牧草柱頭授粉的最佳時(shí)間，同種豆科牧草的異花授粉花粉和柱頭之間存在親和性和柱頭可授性(表1)。

表1 3 種豆科牧草的柱頭可授性比較Tab.1 Comparisons of stigma receptivity in three leguminous forages

中性紅染色主要是檢測(cè)柱頭角質(zhì)層的破裂程度以表征柱頭的可授性，柱頭著色則說明其角質(zhì)層破壞，只有角質(zhì)層破壞后柱頭分泌物才能溢出并黏附花粉[21]。對(duì)紫花苜蓿、多變小冠花和百脈根的柱頭角質(zhì)層進(jìn)行中性紅染色檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)不作任何處理的小花98%的柱頭不能顯色，用毛筆刷過的柱頭有72%的柱頭可以被染成紅色，而自然授粉的則有88%的柱頭可以被染色，說明3 種豆科牧草的柱頭均存在機(jī)械屏障也就是柱頭角質(zhì)層(表1)。

2.2 授粉后3 種豆科牧草花粉管生長(zhǎng)和引導(dǎo)顯微觀察

由圖2 可見：苜蓿在授粉2 h 后少量花粉在柱頭上萌發(fā)(圖2a)，但是還不能穿過花柱基部(圖2b)；4 h 后花粉萌發(fā)的數(shù)量明顯增多(圖2c)，并且可見少量花粉管穿過花柱基部(圖2d)，但是尚未到達(dá)花柱基部的胚珠位置(圖2e)；授粉8 h后柱頭上可見大量花粉萌發(fā)(圖2f)，穿過花柱的花粉管數(shù)量也在不斷增加(圖2g)，而且有少數(shù)花粉管到達(dá)胚珠附近(圖2h)；授粉12 h 后，到達(dá)胚珠位置的花粉管增多(圖2i)；授粉4 h 后，可以觀察到花粉管向胚珠珠孔位置的生長(zhǎng)和引導(dǎo)(圖2j～k)；授粉48 h 后可見花粉管成功引導(dǎo)進(jìn)入胚囊，雙受精發(fā)生，胚胎發(fā)育啟動(dòng)(圖2l)。

圖2 苜蓿異花授粉后2～48 h 花粉管的生長(zhǎng)和引導(dǎo)Fig.2 Growth and guidance of pollen tubes in M.sativa 2-48 h after cross pollination

圖3 顯示：小冠花在授粉2 h 后，柱頭上的花粉尚未萌發(fā)(圖3a)，花柱道未見花粉管生長(zhǎng)(圖3b)；在授粉4 h 后，花柱基部可見花粉管生長(zhǎng)(圖3c)，并有花粉管已經(jīng)到達(dá)胚珠位置(圖3d)，此時(shí)胚囊的受精率可達(dá)88.97%；在授粉8 h 后，可以觀察到柱頭上大量花粉萌發(fā)(圖3e)，隨后花粉管生長(zhǎng)穿過花柱基部到達(dá)胚珠(圖3f)，以及花粉管向胚珠珠孔端的生長(zhǎng)和引導(dǎo)(圖3g)，此時(shí)，胚囊的受精率達(dá)到96.43%，此后，胚囊受精率基本不變(表2)；授粉12～24 h，可以觀察到每個(gè)胚珠都有花粉管的引導(dǎo)生長(zhǎng)和進(jìn)入珠孔端(圖3h～i)；授粉48 h 后可以明顯看到胚胎的發(fā)育(圖3j～l)。

圖4 顯示：百脈根在授粉2 h 后柱頭上的花粉還沒有萌發(fā)(圖4a)，花柱道和胚珠未見花粉管的分布(圖4b)；在授粉4 h 后，可以觀察到百脈根柱頭上花粉的萌發(fā)，并且可見少量花粉管向花柱道和胚珠方向的生長(zhǎng)(圖4c～d)，此時(shí)胚囊的受精率可達(dá)89.81%；在授粉8 h 后，可見花粉管向花柱基部的生長(zhǎng)(圖4e)和花粉管在胚珠位置的分布(圖4f)，該階段胚囊的受精率達(dá)95.38%，此后，胚囊受精率保持不變(表2)。與小冠花類似，授粉12～24 h，觀察到大量花粉管向胚珠方向生長(zhǎng)(圖4g)，花粉管向珠孔端的運(yùn)動(dòng)(圖4h)，以及花粉管向胚珠珠孔處的引導(dǎo)(圖4i～k)；授粉48 h 后，花粉管進(jìn)入胚囊，并且每個(gè)胚珠都可以觀察到花粉管的進(jìn)入(圖4l)。

3 種豆科牧草不同的授粉時(shí)間后花粉管陸續(xù)進(jìn)入胚囊，苜蓿在授粉24 h 后花粉管的數(shù)量盡管和授粉48 和96 h 后沒有顯著差異，但是數(shù)量還在不斷增加，在授粉96 h 后胚囊的受精率達(dá)76.40%，而小冠花和百脈根在授粉4 h 后胚囊的受精率分別達(dá)到88.97%和89.81%，授粉24 h 后幾乎接近100%受精?？傮w來看3 種牧草的受精率都比較高，苜蓿相對(duì)小冠花和百脈根而言，受精率較低，但也可以滿足＞70%的胚囊受精，然而本結(jié)果并不與苜蓿種子成熟時(shí)較低的結(jié)實(shí)率相符。

2.3 3 種豆科牧草胚珠敗育位置和敗育率的比較

圖3 小冠花異花授粉后2～48 h 花粉管的生長(zhǎng)和引導(dǎo)Fig.3 Growth and guidance of pollen tubes in C.varia 2-48 h after cross pollination

3 種豆科牧草莢果成熟后對(duì)莢內(nèi)種子的敗育位置統(tǒng)計(jì)結(jié)果(表3)發(fā)現(xiàn)：苜蓿莢果上部敗育率最高為94%，莢果中部和下部分別為88%和81%，3 個(gè)位置的敗育率沒有顯著差異。小冠花莢果上部的敗育率最高為82%，莢果中部和下部的敗育率分別為74%和78%，3 個(gè)位置的敗育率也沒有顯著差異；百脈根莢果中部的敗育率最高為86%，莢果上部和莢果下部的敗育率分別為76%和82%，3 個(gè)位置的敗育率同樣沒有顯著差異。以上結(jié)果表明：3 種牧草種子在莢內(nèi)沒有特定的敗育位置，種子在莢內(nèi)的敗育位置具有隨機(jī)性。

3 討論

苜蓿、小冠花和百脈根作為重要的豆科牧草，其種子產(chǎn)量普遍低下，實(shí)際種子產(chǎn)量顯著低于潛在種子產(chǎn)量，已有學(xué)者從傳粉昆蟲[1,22]、種子產(chǎn)量性狀[23]等方面進(jìn)行了探析，旨在解析異花授粉豆科牧草種子生產(chǎn)要素，促進(jìn)產(chǎn)量提升。豆科牧草普遍存在的胚珠敗育現(xiàn)象，與其授粉后花粉萌發(fā)、花粉管引導(dǎo)和胚珠受精過程緊密相關(guān)。豆科牧草屬典型的濕(潤(rùn))型柱頭，成熟柱頭表面呈現(xiàn)“蜂窩狀”結(jié)構(gòu)，并且柱頭表面具有一層角質(zhì)層，在柱頭成熟過程中角質(zhì)層降解，使位于角質(zhì)層下方的分泌物泌出到柱頭上，以利于黏附和識(shí)別花粉[18,21,24]。柱頭角質(zhì)層主要有2 個(gè)功能，一是可以阻擋自身的花粉，從而起到限制自花授粉的作用；二是角質(zhì)層是一層機(jī)械組織，可以保護(hù)柱頭，使柱頭免受或減少外來的不良侵害。當(dāng)柱頭的角質(zhì)層被破壞后花粉才會(huì)萌發(fā)生長(zhǎng)，而傳粉昆蟲往往就是扮演這種“破壞者”的主要角色。本研究對(duì)苜蓿、小冠花和百脈根柱頭檢測(cè)結(jié)果顯示：柱頭在花瓣還沒有完全開放時(shí)就具有一定的可授性，但可授性較低，當(dāng)花藥完全開裂時(shí)，柱頭的可授性最強(qiáng)；其中，苜蓿和百脈根的柱頭在花藥還沒有開裂時(shí)即具有可授性，當(dāng)花藥完全開裂時(shí)，3 種牧草的柱頭可授性最佳(表1)。DAFNI等[25]認(rèn)為花藥完全開裂時(shí)正是傳粉昆蟲活動(dòng)的高峰期，柱頭上的角質(zhì)層被破壞的概率最高，這樣可以使傳粉昆蟲攜帶的花粉較容易突破角質(zhì)層萌發(fā)。另外，植物花粉的萌發(fā)及花粉管生長(zhǎng)與授粉當(dāng)天的氣候條件也存在密切的關(guān)系。柱頭表皮由角質(zhì)層覆蓋，水和大分子物質(zhì)可通過，但對(duì)花粉管穿透形成障礙。3 種豆科牧草花粉萌發(fā)和生長(zhǎng)顯微觀察結(jié)果表明：來自異花授粉的花粉與柱頭的水合反應(yīng)、花粉管萌發(fā)可以很快發(fā)生，時(shí)間在1～2 h (圖2～4)。這一方面與花粉在花藥開裂時(shí)干化的程度有關(guān)；另一方面，恰當(dāng)?shù)幕ǚ郯l(fā)育時(shí)期是接受花粉能力的關(guān)鍵時(shí)期，不成熟的柱頭或衰老、退化的柱頭都不能提供正常的授粉過程。

圖4 百脈根的異花授粉后2～48 h 花粉管生長(zhǎng)和引導(dǎo)Fig.4 Growth and guidance of pollen tubes in L.cornioulatous 2-48 h after cross pollination

表2 3 種豆科牧草不同授粉時(shí)間胚珠受精率Tab.2 Ovule fertilization rate after cross pollination in three leguminous forages %

表3 3 種豆科牧草胚珠敗育位置及其敗育率Tab.3 Position of ovule abortion and ovule abortion rate in three leguminous forages %

一旦成熟的花粉落在柱頭上，經(jīng)過花粉與柱頭的水合反應(yīng)，花粉在柱頭萌發(fā)，并穿過柱頭乳突細(xì)胞間隙，花粉管伸向位于花柱和子房的引導(dǎo)組織。已有研究證明花粉管早期生長(zhǎng)不受胚珠的影響，說明該階段生長(zhǎng)和引導(dǎo)是由孢子體控制的[26]。本研究觀察發(fā)現(xiàn)：3 種豆科牧草花粉管生長(zhǎng)的速度明顯不同，盡管小冠花和百脈根花柱比苜蓿長(zhǎng)，但是花粉管生長(zhǎng)速度要比苜蓿快。苜蓿花粉管突破引導(dǎo)組織需要8 h，而小冠花和百脈根只需要4 h (圖2～4)。在已有研究的其他植物中，矮慈姑(Sagittaria pygmaea)人工授粉0.5 h 后花粉萌發(fā)，花粉管在授粉2 h 后部分到達(dá)子房，4 h內(nèi)進(jìn)入胚珠，花粉管生長(zhǎng)速率為1.0 mm/h[27]；陸地棉(Gossypium hirsutum)花粉萌發(fā)在授粉后1～4 h、12 h 后大量的花粉管伸長(zhǎng)到花柱基部，花粉管的平均生長(zhǎng)速度為0.29 cm/h[28]；辣椒(Capsicum annuum)從授粉到開始受精大約需要12 h，花粉管生長(zhǎng)速度為0.8 mm/h，子房?jī)?nèi)胚珠全部完成受精需要26 h 以上[29]；軟條紅梅花柱內(nèi)異花授粉花粉管生長(zhǎng)速度明顯比自花授粉的快，前者花粉管能夠到達(dá)花柱基部，平均速度為0.83 mm/h，而自花授粉的花粉管在花柱中部被抑制而停止生長(zhǎng)[30]。

花柱是連接柱頭和子房的柱狀結(jié)構(gòu)，是花粉管進(jìn)入子房的通道?；ǚ勖劝l(fā)后花粉管的早期生長(zhǎng)包括2 個(gè)主要過程，一是克服柱頭表面的影響，二是找到引導(dǎo)組織。已有研究發(fā)現(xiàn)：花粉進(jìn)入柱頭后，在花柱中的生長(zhǎng)除了傳輸通道中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的供應(yīng)外，還受到從花柱到胚珠梯度分布化學(xué)信號(hào)及其他信號(hào)物質(zhì)的指引[31]。玉米中一種被稱為花粉過敏原組I (β-expansins)的蛋白質(zhì)能夠促進(jìn)花粉管侵入柱頭組織[32]。另有研究發(fā)現(xiàn)：百合柱頭中有誘導(dǎo)花粉管向藥性的小堿性蛋白質(zhì)(chemocyanin)，能有效地引導(dǎo)攜帶精細(xì)胞的花粉管進(jìn)入胚珠，該蛋白只在百合中有功能，而百合柱頭中另一種蛋白SCA (由百合引導(dǎo)組織表皮分泌的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，lipid transfer protein)可明顯促進(jìn)小堿性蛋白質(zhì)對(duì)花粉管的引導(dǎo)[33]。從圖2～4可以看出：苜蓿、小冠花和百脈根花柱的中央均有數(shù)條縱行的花柱道，自柱頭通向子房，屬空心型花柱類型。3 種豆科牧草的花柱溝道表面為高度腺性的花柱道細(xì)胞，所產(chǎn)生的黏性分泌物釋放到花柱道的表面，傳粉后花粉粒萌發(fā)所形成的花粉管沿著花柱道并吸收、利用花柱道表面的分泌物營(yíng)養(yǎng)自身而進(jìn)一步生長(zhǎng)、穿行。由此可見，不同植物的花粉管生長(zhǎng)速度不同，甚至同一牧草的不同品種(基因型)之間也有一定的差別[34]。

花粉管在花柱中的生長(zhǎng)會(huì)受到來自胚珠的信號(hào)指引，包括長(zhǎng)距離指引和短距離指引。雙子葉植物花粉管穿過引導(dǎo)組織出現(xiàn)在胎座表層，然后沿著珠柄的表皮向珠孔端生長(zhǎng)進(jìn)入胚珠，最終抵達(dá)被深埋的雌配子體實(shí)現(xiàn)受精[3,35]。玉米和擬南芥等植物作為研究花粉管極性生長(zhǎng)的模式材料，通過細(xì)胞遺傳分析已鑒定發(fā)現(xiàn)了許多控制花粉管極性生長(zhǎng)的相關(guān)基因，雌配子體特異性的蛋白質(zhì)ZmEA1 和LUREs 被確定為花粉管生長(zhǎng)和引導(dǎo)誘物[36-37]。DUAN 等[10]最新研究發(fā)現(xiàn)：擬南芥受體激酶(FERONIA) 具有確保精子遞送和阻止多重受精的作用，引導(dǎo)花粉管成功“繞開”已經(jīng)被“占位”的胚珠，找到尚未“占位”的胚珠。苜蓿、小冠花和百脈根授粉4 h 后的胚囊受精率分別為76.40%、88.97% 和89.81%，表明異花授粉狀態(tài)下，進(jìn)入雌蕊中的花粉管數(shù)量滿足胚珠的受精需要，其結(jié)實(shí)率低下并非由于花粉限制。

豆科牧草具有自交不親和性，自交衰退明顯，提高種子產(chǎn)量主要是通過雜交育種手段來改善。紫花苜蓿、小冠花和百脈根胚珠敗育率極高，分別為87.67%、78.00%和81.33%，且莢內(nèi)胚珠敗育位置也具有隨機(jī)性(表3)。由此可見，胚珠敗育減少了每莢種子數(shù)，大大降低了其種子產(chǎn)量。通常導(dǎo)致植物選擇性敗育的原因主要有資源限制和遺傳因子2 個(gè)方面，這種選擇性敗育常?？梢娪诙箍浦参镏校箍浦参锂a(chǎn)生過多的花和胚珠是其選擇高質(zhì)量后代的一種進(jìn)化機(jī)制[38]。從資源限制角度分析，雌雄同株植物通過雌蕊選擇性敗育，把資源轉(zhuǎn)移到雄性器官的發(fā)育上，形成形態(tài)較大、色澤艷麗的花冠，增強(qiáng)對(duì)傳粉者的吸引，并產(chǎn)生較豐富的花粉粒等，這些報(bào)酬可以增加昆蟲的拜訪頻率，因而在雌雄同株上不存在花粉限制[39]。有研究發(fā)現(xiàn)：苜蓿的胚珠不育性與珠心胼胝質(zhì)的沉積密切相關(guān)，但不育性具有較大的遺傳變異，胼胝質(zhì)沉積的隨機(jī)性決定了種子在莢內(nèi)敗育的隨機(jī)性[40-41]。從遺傳因子方面來看，受精后胚珠敗育是3 種豆科牧草結(jié)實(shí)率低下的主要原因，而胼胝質(zhì)的沉積確實(shí)在一定程度上影響了苜蓿胚珠的育性。

4 結(jié)論

3 種豆科牧草苜蓿、小冠花和百脈根的柱頭在小花還沒有完全開放時(shí)就具有一定的可授性，當(dāng)花藥完全開裂時(shí)，柱頭的可授性最強(qiáng)，為昆蟲授粉最佳時(shí)期。3 種豆科牧草來自異花授粉的花粉與柱頭的水合反應(yīng)、花粉管萌發(fā)時(shí)間在1～2 h，其中，小冠花和百脈根花柱比苜蓿長(zhǎng)，其花粉管生長(zhǎng)速度要比苜蓿快，小冠花和百脈根花粉管突破引導(dǎo)組織僅需要4 h 而苜蓿需要8 h。3 種豆科牧草屬空心型花柱類型，花柱的中央均有數(shù)條縱行的花柱道，花柱溝道表面高度腺性的細(xì)胞產(chǎn)生的粘性分泌物可為花粉管的生長(zhǎng)和穿行提供營(yíng)養(yǎng)。苜蓿、小冠花和百脈根授粉4 h 后的胚囊受精率分別為76.40%、88.97%和89.81%，表明異花授粉狀態(tài)下，進(jìn)入雌蕊中的花粉管數(shù)量滿足胚珠的受精需要，其結(jié)實(shí)率低下并非由于花粉限制。因此，3 種豆科牧草胚珠敗育并非由于受精前的花粉萌發(fā)和花粉管引導(dǎo)限制，而是和受精后的胚胎發(fā)育受阻有關(guān)。