段智睿 ，吳轉(zhuǎn)娣，姚 麗，覃 偉，吳才文，曾千春

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201；2.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 甘蔗研究所，云南 開遠(yuǎn) 661600)

甘蔗是主要的糖料和能源作物，蔗糖產(chǎn)量占世界食糖總產(chǎn)量的76%、占中國食糖總產(chǎn)量的90%以上。然而，多年來甘蔗單一品種種植引發(fā)了病蟲害加劇、品種退化、抗逆性差和產(chǎn)量下降等問題，給蔗糖生產(chǎn)帶來巨大的經(jīng)濟損失[1]。云蔗05-51 以創(chuàng)新種質(zhì)崖城90-56 為母本，新臺糖23 號為父本，于2013 年通過國家鑒定；該品種綜合性狀優(yōu)異，具有良好的適應(yīng)性、豐產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)性，早熟高糖、抗寒抗旱性強，田間表現(xiàn)出苗快且整齊、分蘗力強、中大莖、有效莖多和宿根性強等特點[2]。20 世紀(jì)70 年代中期，中國開始甘蔗離體快繁工廠化生產(chǎn)，相關(guān)技術(shù)已經(jīng)相當(dāng)成熟[3]。吳轉(zhuǎn)娣等[4]以云蔗05-51 莖芽為起始材料，采用MS 基本培養(yǎng)基添加(0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L KT)與增殖培養(yǎng)基添加(6-BA 1.0 mg/L+0.5 mg/L KT)等建立了離體快繁系統(tǒng)。但是以云蔗05-51 心葉作為外植體的組培再生體系及其遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)尚未見報道。

G418 是一種氨基糖苷類抗生素，通過抑制轉(zhuǎn)座子Tn601 和Tn5 的基因干擾核糖體功能，從而阻斷蛋白質(zhì)合成，對原核和真核等細(xì)胞產(chǎn)生毒素[5-7]。新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(nptⅡ)是在植物轉(zhuǎn)基因工程中被廣泛應(yīng)用的標(biāo)記基因，該基因來自大腸桿菌(Escherichia coli)的aphA2基因，編碼的產(chǎn)物氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶 [APH (3′) Ⅱ-酶]對氨基糖苷類抗生素具有抗性，將nptⅡ基因作為選擇標(biāo)記基因與目標(biāo)基因一同導(dǎo)入受體植物，可賦予轉(zhuǎn)基因植株對氨基糖苷類抗生素的抗性，用于植物轉(zhuǎn)基因篩選[8-10]。國內(nèi)有報道甘蔗G418 耐受性的篩選[10-12]，但并沒有開展nptⅡ標(biāo)記基因的遺傳轉(zhuǎn)化。為此，本研究以新臺糖22(ROC22)為對照，先建立云蔗05-51 組培再生體系，明確G418 的篩選質(zhì)量濃度，進一步開展農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化其胚性愈傷組織系統(tǒng)，為有益基因?qū)敫收崞贩N提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

云蔗05-51 (YZ05-51)和新臺糖22 (ROC22)均來自云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所，G418 由德國生物科技(BioFroxx)公司生產(chǎn)，農(nóng)桿菌EHA 105 以及質(zhì)粒pRPBSCK-35SBt 由中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所朱禎研究員提供，試驗在云南開遠(yuǎn)云南省甘蔗遺傳改良重點實驗室完成。

1.2 愈傷組織誘導(dǎo)與繼代培養(yǎng)

選擇田間生長4～6 個月、健壯狀態(tài)一致的甘蔗主分蘗，砍取蔗莖頂端50 cm 長(保留4～5 節(jié))，裝入塑料袋帶回實驗室備用。剝?nèi)ネ鈱映墒烊~片，用75%酒精噴灑表面，超凈工作臺中剝?nèi)ネ鈱尤~鞘，在無菌濾紙上將生長點以上約5～7 cm心葉卷橫切成厚度為1 mm 的切段，接種于愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，每皿接種20 個切段，每處理接種15 皿，重復(fù)3 次，(25±1) ℃暗培養(yǎng)。云蔗05-51愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為：MS+2,4-D (0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 和3.5 mg/L)+蔗糖(30.0 g/L)+卡拉膠(8.0 g/L)+活性炭(0.2 g/L)，pH 為5.8。每14 d 繼代培養(yǎng)1 次，第56 天統(tǒng)計愈傷組織情況，以分析2,4-D 誘導(dǎo)云蔗05-51 愈傷組織的最佳質(zhì)量濃度。

愈傷誘導(dǎo)率=產(chǎn)生愈傷組織的外植體數(shù)/外植體總數(shù)×100%。

1.3 不定芽分化

挑選干燥、結(jié)構(gòu)松散、顏色淡黃和生長旺盛的直徑約0.5 cm 的愈傷組織塊接種到分化培養(yǎng)基上，每瓶接種10 塊，每處理15 瓶，重復(fù)3 次，光照培養(yǎng)12 h/d，光強2 300 lx，溫度(27±1) ℃。云蔗05-51 分化培養(yǎng)基配方為：MS+6-BA (0.5 和1.0 mg/L)+KT (0.1、0.3 和0.5 mg/L)+蔗糖(30.0 g/L)+卡拉膠(8.0 g/L)，pH 為5.8。每14 d 繼代1 次，第56 天統(tǒng)計愈傷組織分化情況，以分析6-BA和KT 分化云蔗05-51 愈傷組織塊不定芽的最佳配比。

分化率=分化出不定芽愈傷組織塊數(shù)/愈傷組織總塊數(shù)×100%；

死亡率=愈傷組織死亡塊數(shù)/愈傷組織總塊數(shù)×100%。

1.4 愈傷組織增殖階段G418 耐受性篩選

方法參考文獻(xiàn)[10]并略有改動。挑選干燥、結(jié)構(gòu)松散和顏色淡黃的直徑約0.5 cm 的愈傷組織塊接種到含抗生素G418 (0、20、30 和40 mg/L)的愈傷組織增殖培養(yǎng)基中，每皿接種20 塊，每個處理15 皿，重復(fù)3 次，暗培養(yǎng)，溫度(25±1) ℃。以ROC22 為對照，每15 d 繼代1 次，第60 天統(tǒng)計愈傷組織成活與抑制情況，以篩選確定云蔗05-51 胚性愈傷組織增殖階段合適的G418 質(zhì)量濃度。

成活率=愈傷組織成活塊數(shù)/愈傷組織總塊數(shù)×100%；

抑制率=愈傷受抑制塊數(shù)/愈傷組織總塊數(shù)×100%。

1.5 不定芽分化階段G418 耐受性篩選

方法參考文獻(xiàn)[10]并略有改動。挑選干燥、結(jié)構(gòu)松散和顏色淡黃的直徑約0.5 cm 的愈傷組織塊接種到含抗生素G418 (0、10、20、30、40 和50 mg/L) 的分化培養(yǎng)基中，每瓶接種10 塊，每個處理接種15 瓶，重復(fù)3 次，光照培養(yǎng)12 h/d，光強2 300 lx，溫度(27±1) ℃。以ROC22 為對照。每15 d 繼代1 次，第60 天統(tǒng)計分化情況，以篩選確定云蔗05-51 胚性愈傷組織不定芽分化階段合適的G418 質(zhì)量濃度。

分化率=分化出不定芽的愈傷組織塊數(shù)/愈傷組織總塊數(shù)×100%；

抑制率=愈傷受抑制塊數(shù)/愈傷組織總塊數(shù)×100%。

1.6 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化與抗性植株分化

方法參考文獻(xiàn)[13]并略有改動。將含nptⅡ基因的工程菌EHA105 (農(nóng)桿菌)培養(yǎng)至對數(shù)生長期后，加入100 μmol/L 乙酰丁香酮激活Vir基因，并調(diào)節(jié)工程菌OD660值到約0.6 用于浸染。與此同時，選取生長旺盛的胚性愈傷組織，于超凈工作臺無菌濾紙上風(fēng)干至表面呈收縮狀，浸入到前述工程菌液中。在低壓環(huán)境下保持2～4 min，靜置5 min，重復(fù)2～3 次[14]。濾去菌液，在無菌濾紙上吸干殘液并吹干至表面無水膜。轉(zhuǎn)移到MR[13]固體培養(yǎng)基上，(25±1) ℃暗培養(yǎng)2～4 d 后，轉(zhuǎn)移到含G418 愈傷篩選培養(yǎng)基上，(25±1) ℃暗培養(yǎng)。每15 d 繼代1 次，直至篩選出G418 抗性愈傷組織。將抗性愈組織轉(zhuǎn)移到含G418 分化篩選培養(yǎng)基上，12 h/d 光照培養(yǎng)，光強2 300 lx，溫度(27±1) ℃。每15 d 繼代1 次，直至獲得抗性芽。將抗性芽轉(zhuǎn)移到無激素的1/2MS 固體培養(yǎng)基上，生根，煉苗移栽。以ROC22 為對照，處理方法相同。

1.7 抗性苗分子檢測

選擇生長旺盛、濃綠、高4～7 cm 的抗性植株，編號，剪取葉片組織約20 mg，試劑盒提取DNA，PCR 檢測nptⅡ基因，目標(biāo)片段約700 bp。引物序列F1：5′-GAGGCTATCGGCTATGACTG-3′；R1：5′-ATCGGGAGCGGCGATACCGTA-3′。PCR 反應(yīng)體系10.0 μL (模板2.0 μL，F(xiàn)1 和R1 各1.0 μL，EasyTaq酶5.0 μL，ddH2O 1.0 μL)。擴增程序為：94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸 1 min，38 個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。1.5% 瓊脂糖85 V 電泳檢測PCR 產(chǎn)物，溴化乙啶染色后用凝膠成像系統(tǒng)掃描。

NPTII ImmunoStrip?Test (Agdia，CatSTX 73000)在蛋白水平的檢測方法參照試劑條使用說明但有改動。稱取待檢測甘蔗植株心葉20 mg，橫剪成1～2 cm 長，置于1.5 mL Eppendorf 管中，加400 μL PEB 緩沖液，用塑料棒擠壓搗碎葉片直至溶液呈淺綠色。臺式離心機10 000 r/min 離心2 min，取上清液300 μL 至1.5 mL 管中，將檢測試劑條標(biāo)有“sample”的一端插入上清液中，靜置15 min 并保持下端接觸上清液，陽性植株會出現(xiàn)2 條帶。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件進行方差分析(ANOVA)，采用Duncan’s 法檢驗處理間平均值的顯著差異(P＜0.05)，數(shù)據(jù)表示為“mean±SE”。

2 結(jié)果與分析

2.1 愈傷組織誘導(dǎo)

由表1 可知：2,4-D 質(zhì)量濃度為3.0 mg/L 時愈傷組織的誘導(dǎo)率最高，為97.61%，愈傷組織塊直徑在1.5 cm 以上，生長狀態(tài)最佳，結(jié)構(gòu)松散。因此，云蔗05-51 愈傷組織誘導(dǎo)的2,4-D 最佳質(zhì)量濃度為3.0 mg/L。

表1 2,4-D 對云蔗05-51 愈傷組織誘導(dǎo)的作用Tab.1 Effect of 2,4-D on the callus induction of YZ05-51

2.2 不定芽分化培養(yǎng)

由表2 可知：6-BA 和KT 質(zhì)量濃度分別為1.0和0.1 mg/L 時愈傷組織塊上的不定芽分化率最高，為98.30%，死亡率為0.03%，組織塊上有大量不定芽，不定芽高度超過1.5 cm，且愈傷組織結(jié)構(gòu)仍較松散。因此，云蔗05-51 愈傷分化不定芽的6-BA 和KT 最佳用量分別為1.0 和0.1 mg/L。

表2 6-BA 和KT 不同質(zhì)量濃度配比對云蔗05-51 愈傷組織塊分化不定芽的作用Tab.2 Effect of 6-BA and KT combination on the buds generation of YZ05-51 from callus

2.3 G418 對甘蔗愈傷組織生長的影響

由圖1 可知：當(dāng)G418 質(zhì)量濃度為30 mg/L 時，ROC22 愈傷組織的生長完全受到抑制；當(dāng)G418質(zhì)量濃度為40 mg/L 時，YZ05-51 愈傷組織生長的成活率接近0。相同培養(yǎng)環(huán)境下，云蔗05-51愈傷成活率要高于ROC22，抑制率低于ROC22，說明在愈傷組織階段ROC22 對G418 較YZ05-51 更敏感。

圖1 不同G418 質(zhì)量濃度下云蔗05-51 和ROC22 愈傷組織誘導(dǎo)的成活率和抑制率Fig.1 The survival rates and inhibition rates of callus induction of YZ05-51 and ROC22 at different mass concentrations of G418

2.4 G418 對甘蔗愈傷組織塊不定芽分化的影響

由圖2 可知：當(dāng)G418 質(zhì)量濃度為20 mg/L 時，ROC22 愈傷組織塊上不定芽的分化率接近0；當(dāng)G418 質(zhì)量濃度為30 mg/L 時，YZ05-51 愈傷組織塊上不定芽的分化率接近0。相同培養(yǎng)環(huán)境下，云蔗05-51 不定芽分化率要高于ROC22，抑制率低于ROC22，說明在不定芽分化階段ROC22 對G418 較YZ05-51 更敏感。

圖2 不同G418 質(zhì)量濃度下云蔗05-51 和ROC22 愈傷組織塊不定芽分化的分化率和抑制率Fig.2 The differentiation rates and inhibition rates of YZ05-51 and ROC22 buds generation from callus at different mass concentrations of G418

2.5 抗性苗分子檢測

由圖3 可知：PCR 檢測的15 株抗性植株(9 株為YZ05-51，6 株為ROC22) 中，11 株擴增出與預(yù)期大小700 bp 相符的片段，陽性植株率達(dá)73.3%，說明G418 篩選效果較好，且nptⅡ基因已整合到抗性植株基因組中。NPTⅡ蛋白檢測結(jié)果(圖4) 顯示：受檢測的4 株抗性植株中的3 株出現(xiàn)2 條帶，表明nptⅡ基因蛋白水平正常表達(dá)。

3 討論

圖3 篩選標(biāo)記基因nptII 的PCR 檢測Fig.3 PCR detection of marker gene nptII

圖4 抗性植株NPTII 蛋白檢測Fig.4 NPTII ImmunoStrip? test of the G418 resistant plants

本試驗中G418 達(dá)到抑制YZ05-51 愈傷組織增殖和不定芽分化的質(zhì)量濃度分別為40 和30 mg/L，完全抑制ROC22 愈傷組織增殖和不定芽分化的質(zhì)量濃度分別為30 和20 mg/L，與林美娟等[12]研究得出的同品種甘蔗在不同組培階段對G418 的耐受性不同以及不同品種在相同組培階段對G418 耐受性存在明顯差異的結(jié)論相符。在G418對ROC22 影響的試驗中，劉家儀等[11]研究表明：ROC22 愈傷組織增殖和分化階段完全受到抑制的G418 用量分別為20 和30 mg/L，與本研究結(jié)果相反，也與林美娟等[12]的總體趨勢結(jié)論相反。

農(nóng)桿菌介導(dǎo)已成功轉(zhuǎn)化水稻[15]、玉米[16]和甘蔗[17]等禾本科植物，采用的篩選標(biāo)記基因分別為bar(水稻和玉米)和pmi基因，其相應(yīng)的篩選試劑分別為除草劑和甘露糖。nptⅡ標(biāo)記基因被廣泛應(yīng)用于植物轉(zhuǎn)基因研究，氨基糖苷類抗生素作為其常用的篩選劑，在番茄[18]和梨[19]的應(yīng)用中已有成功報道。本研究采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法結(jié)合G418篩選，成功地將nptⅡ基因?qū)朐普?5-51，抗性植株nptⅡ基因PCR 檢測陽性率為73.3%；NPTⅡImmunoStrip 檢測表明：nptⅡ在蛋白水平正常表達(dá)，為有益基因?qū)朐普?5-51 和其他甘蔗品種奠定了基礎(chǔ)。