楊 青，吳 磊

（武漢市第五醫(yī)院骨科，湖北 武漢 430050）

臨床上大劑量或長時間使用激素所致的非創(chuàng)傷性股骨頭壞死最為常見，其發(fā)病率較以往明顯升高且伴有年輕化的趨勢［1-3］。臨床和實驗研究發(fā)現(xiàn)，短時間內(nèi)大量激素沖擊或長期中小劑量使用均能導(dǎo)致糖皮質(zhì)激素性股骨頭壞死（glucocorticoidinduced osteonecrosis of the femoral head，GIONFH）。據(jù)統(tǒng)計，美國每年GIONFH新發(fā)病人數(shù)10000～20000例［4］。研究表明，GIONFH的早期病理改變以骨細(xì)胞及成骨細(xì)胞凋亡為主，繼而出現(xiàn)血管病變，最終導(dǎo)致股骨頭缺血壞死。如能夠有效阻斷或修復(fù)血管病變過程，則可起到預(yù)防和治療GIONFH的作用。生理狀態(tài)下，人體骨髓組織中存在大量內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cells，EPC）［5-7］。EPC動員后可從骨髓組織向外周血遷移，提高血管血液內(nèi)EPC水平，對損傷血管有修復(fù)作用。體內(nèi)EPC或干細(xì)胞的動員、轉(zhuǎn)移到損傷部位，并且修復(fù)組織損傷，是人體組織修復(fù)的重要方式之一［8-10］。當(dāng)然外源性的移植或輸注EPC亦可以發(fā)揮上述作用，紅細(xì)胞生成素（erythropoietin，EPO）因其具有抗血管損傷及對細(xì)胞組織的保護作用亦被廣泛應(yīng)用于多種缺血性疾病的治療［11-13］。故本研究探討經(jīng)EPO基因修飾后EPC（EPO-EPC）移植，對大鼠GIONFH的影響及機制，為臨床治療GIONFH提供實驗依據(jù)，以進一步提高治療效果。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑和主要儀器

清潔級SD大鼠66只，雌雄各半，體質(zhì)量為245～280 g，由武漢大學(xué)動物實驗中心提供〔動物質(zhì)量合格證號：SCXK（鄂）20120024，SYXK（鄂）2014-0083〕。醋酸潑尼松龍注射液（國藥準(zhǔn)字H20023134，浙江仙琚制藥股份有限公司）；5%胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基和25%胰蛋白酶（美國Gibco BRL公司）；TMR-Red調(diào)亡試劑盒和蘇木素伊紅染色試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）；熒光染料 CFSE（CFDA-SE）（美國 Sigma公司）；Lipofectamine TM2000 Trizol（美國Invitrogen公司）：RT-PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京Promega公司）；Taq酶（加拿大BBI公司產(chǎn)品）；dNT（大連TaKaRa公司）；Western印跡化學(xué)發(fā)光試劑（美國Santa cruz公司）；兔抗人EPO、兔抗大鼠活化胱天蛋白酶3、P53正向細(xì)胞凋亡調(diào)控因子（p53 up-regulated modula tor of apoptosis，PUMA）、BCL-XL單克隆抗體和HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體和PVDF膜（均美國Pierce公司）。UVP凝膠圖像掃描儀（美國Bio-Rad公司）；二氧化碳培養(yǎng)箱（英國RS Biotech公司）；熒光顯微鏡（日本Nikon公司）；超凈工作臺（北京亞泰科?。?/p>

1.2 細(xì)胞、細(xì)胞復(fù)蘇培養(yǎng)和CFSE標(biāo)記

EPC（購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院），復(fù)蘇接種于一次性細(xì)胞培養(yǎng)瓶（25 cm2）中，加入DMEM培養(yǎng)液5 mL，放入37℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每隔2 d換液1次。連續(xù)傳代3次后，離心去掉上清，將EPC密度調(diào)整為3×109L-1，進行熒光染色。棄去培養(yǎng)基，用胰酶消化生長10 d的EPC，用培養(yǎng)基吹勻EPC，將CFSE加入細(xì)胞懸液中，通過DMEM培養(yǎng)液調(diào)整其濃度為5 μmol·L-1，隨后將標(biāo)記的細(xì)胞搖勻后轉(zhuǎn)入細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)15 min，將CFSE標(biāo)記的EPC進行熒光顯微鏡觀察。

1.3 EPO基因轉(zhuǎn)染和Western印跡檢測EPC中EPO蛋白表達

選取對數(shù)期的EPC，按細(xì)胞密度3×109L-1接種于6孔板（含DMEM完全培養(yǎng)液），EPO基因轉(zhuǎn)染通過脂質(zhì)體介導(dǎo)法進行，參照Lipofectamin TM 2000說明書實施。3 d后換液，加入篩選培養(yǎng)基（含G418 400 mg·L-1）培養(yǎng)6 d后，再換篩選培養(yǎng)基（含G418 200 mg·L-1）培養(yǎng)2周，可見陽性克隆形成，選單個克隆繼續(xù)擴大培養(yǎng)及傳代后調(diào)整細(xì)胞密度至6×1011L-1。在EPO轉(zhuǎn)染后第2和4周，取生長良好EPO-EPC 6×1011L-1，提取細(xì)胞蛋白。以BCA法測定蛋白質(zhì)濃度，蛋白上樣，SDS-PAGE電泳，電泳后的蛋白樣品轉(zhuǎn)至PVDF膜。轉(zhuǎn)膜后用5%脫脂奶粉4℃封閉4 h，TBST漂洗后與一抗（1∶1500）37℃孵育2 h；TBST洗去一抗，加入HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體（1∶1000）結(jié)合1 h；加入ECL顯影，洗片后采用圖像分析儀處理實驗結(jié)果，Quantity One-1-D軟件分析結(jié)果。

1.4 動物模型制備和分組

SD大鼠66只，im給予醋酸潑尼松龍注射液49 mg·kg-1，連續(xù)注射7 d造模，7 d后隨機抽取6只大鼠觀察股骨頭病理變化確定造模成功。余60只大鼠隨機分為3組（每組20只）。模型組：尾靜脈注射L-DMEM 0.5mL；EPC組：尾靜脈注射EPC懸液6×108L-10.5mL；EPO-EPC組：尾靜脈注射EPO-EPC懸液6×108L-10.5 mL。每天1次，連續(xù)治療7 d。

1.5 RT-PCR檢測股骨頭壞死組織EPO、活化胱天蛋白酶3、Puma和Bcl-xImRNA表達水平

各組隨機取大鼠5只，取雙側(cè)股骨頭壞死組織，液氮至凍研磨后，按照Trizol試劑說明書步驟提取股骨頭組織總RNA，通過紫外分光光度計測定RNA的總含量，通過RT-PCR兩步法試劑盒將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后再將cDNA進行PCR擴增。引物見表1。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性1 min，94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40個循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳分離，通過凝膠分析系統(tǒng)對擴增條帶進行分析，以目的基因與GAPDH灰度值比值表示目的基因相對表達水平。

1.6 Western印跡法檢測股骨頭壞死組織EPO、活化胱天蛋白酶3、Puma和BCL-XL蛋白水平

將1.5提取RT-PCR后剩余物按400×g離心30 min，取上清為粗體蛋白，Bradford法測定蛋白質(zhì)濃度。取各組等量蛋白上樣，SDS-PAGE電泳，電泳后將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜后5%的脫脂奶粉4℃封閉4 h，加入EPO、活化胱天蛋白酶3、Puma、BCL-XL和GAPDH抗體（1∶1500稀釋），孵育12 h后洗膜，加入HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體（1∶1000）結(jié)合1 h，加入ECL顯影，洗片后采用圖像分析儀處理實驗結(jié)果。Quantity One-1-D軟件分析結(jié)果進行半定量分析，以目的蛋白條帶積分吸光度值與內(nèi)參條帶積分吸光度值的比值表示目的蛋白相對表達水平。

Tab.1 Sequences of primers

1.7 TUNEL法檢測股骨頭骨細(xì)胞凋亡率

各組另隨機取大鼠5只，取雙側(cè)股骨頭壞死組織，4%多聚甲醛固定，常規(guī)進行石蠟包埋及超薄切片（4 μm），制備股骨頭組織切片（均沿著股骨長軸同一方向縱向切片）。采用TMR-Red調(diào)亡試劑盒根據(jù)說明書進行股骨頭壞死組織細(xì)胞凋亡檢測。紅色表示調(diào)亡細(xì)胞核，藍色（DAPI）表示全部細(xì)胞核。隨機選取10個高倍視野計算股骨頭細(xì)胞凋亡率（%）（凋亡細(xì)胞核/全部細(xì)胞核×100%）。

1.8 行為學(xué)實驗測定大鼠活動總距離、自主活動次數(shù)和抓力

4周后，各組剩余的10只大鼠進行行為學(xué)檢測。每次實驗均在7∶00 am-12∶00 am進行。①開場實驗：在環(huán)境安靜下，實驗在立方形敞箱（40 cm×80 cm×80 cm）內(nèi)進行，周壁、底面為黑色，箱底面被白線劃分為25塊相等的面積，實驗前10 min將大鼠放入到測試實驗室內(nèi)進行適應(yīng)后，操作人員握住大鼠尾根部的1/3處，輕輕把大鼠放人到曠場箱的中央?yún)^(qū)中心方格內(nèi)，并開始同步進行攝像、計時，每只大鼠測定1次，每次測定10 min。記錄大鼠的平均速度及運動總長度以觀察其活動度。②大鼠自主活動次數(shù)測定：將大鼠置于自主活動儀內(nèi)，預(yù)適應(yīng)10 min，然后進行攝像記錄每只大鼠在3 min和5 min內(nèi)的活動次數(shù)，每只大鼠測定1次，代表大鼠的自主活動量。③大鼠抓力測試：抓持大鼠尾根處，待大鼠抓緊抓力板時同時加力后拉，測到最大抓力值，測定3次，取平均值。

1.9 HE染色觀察股骨頭形態(tài)及骨小梁面積百分?jǐn)?shù)、骨小梁寬度增加和骨小梁分離度的檢測

行為學(xué)實驗結(jié)束后，隨機取各組大鼠5只，取雙側(cè)股骨頭組織，10%甲醛固定，制備股骨頭組織切片（均沿著股骨長軸同一方向縱向切片）；經(jīng)過梯度乙醇逐級脫水后，石蠟包埋，4～5 μm連續(xù)切片，脫蠟后，進行HE染色，光學(xué)顯微鏡觀察各組大鼠股骨頭病理形態(tài)變化。通過半自動圖像數(shù)字化分析儀，包括光鏡和熒光顯微鏡、數(shù)字化板、電腦和形態(tài)學(xué)程序“Stereology”體視學(xué)軟件，測量大鼠股骨頭組織的骨小梁面積百分?jǐn)?shù)、骨小梁寬度增加和骨小梁分離度

1.10 熒光顯微鏡觀察移植的CFSE標(biāo)記EPC在股骨頭的分布

將1.9中切片熒光顯微鏡下觀察，通過CFSE標(biāo)記的EPC在股骨頭組織中的存活及分布。對每張組織切片在視野中隨機選取出3個視野并對其進行拍照記錄。通過Image J軟件對每個視野進行計數(shù)，3個視野計數(shù)后取均值。每組5只大鼠，測量后取均值，為熒光細(xì)胞平均數(shù)。

1.11 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 EPC形態(tài)觀察和轉(zhuǎn)染標(biāo)記

接種培養(yǎng)1周內(nèi)，顯微鏡下可見貼壁細(xì)胞逐漸增多且體積增大，細(xì)胞形態(tài)為紡綞形、多邊形或類圓形；培養(yǎng)1～2周，顯微鏡下可見貼壁細(xì)胞形態(tài)呈“鋪路石”樣外觀（圖1A）。第3代細(xì)胞可見EPC的標(biāo)記，CFSE標(biāo)記的EPC在熒光顯微鏡下綠色熒光（圖1B），表明CFSE標(biāo)記后，陽性標(biāo)記率合格，標(biāo)記細(xì)胞形狀完好，可見細(xì)胞在體外的誘發(fā)分化。

2.2 EPO-EPC中EPO蛋白的表達

Western印跡檢測結(jié)果顯示（圖2），較之空白對照及空載質(zhì)粒組，轉(zhuǎn)染后2周和4周，EPO蛋白在基因修飾組表達均顯著升高（P＜0.01）。由此可知，基因修飾處理可以使EPC高表達EPO至少持續(xù)4周。

Fig.1 EndotheIiaI progenitor ceII（EPC）morphoIogy（A） and carbox fIuorescenceindiacetate succinimidyIester（CFSE）IabeIing（B）.Arrows show the appearance of"paving stone"in Fig.A and CFSE labeled EPC in Fig.B.

Fig.2 EPO protein expression in EPCs at 2（A）and 4（B）weeks after EPO transfection by Western bIotting.C was the semi-quantitative result of A and B.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with blank control group；##P＜0.01，compared with empty plasmid group.

2.3 移植EPO-EPC對GIONFH大鼠股骨頭組織中EPO、活化胱天蛋白酶3、Puma和Bcl-xImRNA表達水平的影響

RT-PCR結(jié)果顯示（圖3），與模型組相比，EPC組大鼠股骨頭區(qū)組織活化胱天蛋白酶3和Puma mRNA明顯降低（P＜0.05），Bcl-xl和EPO mRNA表達明顯升高（P＜0.05）；與EPC組相比，EPO-EPC組大鼠股骨頭區(qū)組織活化胱天蛋白酶3和Puma mRNA明顯降低（P＜0.05），Bcl-xl和EPO mRNA表達明顯升高（P＜0.05）。

Fig.3 Effect of EPO gene-modified EPC（EPO-EPC）transpIantation on mRNA expressions of EPO，cIeavedcaspase 3，Puma and Bcl-xl in femoraI head necrosis tissue of rats with gIucocorticoid-induced osteonecrosis of the femoraI head（GIONFH）by RT-PCR.SD rats were injected with prednisolone acetate injection（49 mg·kg-1 intramuscular injection）for one week.They were randomly divided into 3 groups，model group（0.5 mL L-DMEM via tail vein injection），EPC group（0.5 mL EPCs 6×108L-1via tail vein injection）and EPO-EPC group（0.5 mL EPO modified EPCs 6×108L-1via tail vein injection），once per day for 7 d.B：the semi-quantitative result of A.±s，n=5.＊P＜0.05，compared with model group；#P＜0.05，compared with model+EPC group.

2.4 移植EPO-EPC對GIONFH大鼠股骨頭組織中EPO、活化胱天蛋白酶3、Puma和BCL-XL蛋白表達水平的影響

如圖4所示，移植后7 d，與模型組相比，EPC組活化胱天蛋白酶3和Puma蛋白表達增高（P＜0.05），BCL-XL和EPO蛋白表達顯著降低（P＜0.05）；與EPC組相比，EPO-EPC組活化胱天蛋白酶3和Puma蛋白顯著降低（P＜0.05），BCL-XL和EPO蛋白表達顯著升高（P＜0.01）。

2.5 移植EPO-EPC對GIONFH大鼠股骨頭骨細(xì)胞凋亡的影響

TUNEL結(jié)果（圖5）顯示，藍色熒光為DAPI標(biāo)記細(xì)胞核，紅色熒光為TUNEL凋亡細(xì)胞細(xì)胞核。模型組骨細(xì)胞凋亡率（64±9）%，EPC組骨細(xì)胞凋亡率（42±6）%（P＜0.01），EPO-EPC組細(xì)胞凋亡率（18±3）%（P＜0.01）。

Fig.4 Effect of EPO-EPC transpIantation on protein expressions of EPO，cIeaved-caspase 3，Puma and BCL-XL in femoraI head necrosis tissue of rats with GIONFH by Western bIotting.See Fig.3 for the rat treatment.B：the semi-quantitative result of A.±s，n=5.＊P＜0.05，compared with model group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with model+EPC group.

2.6 移植EPO-EPC對GIONFH大鼠行為的影響

EPO-EPC組大鼠10 min活動總距離顯著大于EPC組和模型組（P＜0.05），EPC組大于模型組（P＜0.05）；EPO-EPC組大鼠自主活動次數(shù)顯著大于EPC組和模型組（P＜0.05），EPC組大于模型組（P＜0.05）；EPO-EPC組大鼠抓力大于EPC組和模型組（P＜0.05），EPC組大于模型組（P＜0.05）（表2）。

2.7 移植EPO-EPC對GIONFH大鼠股骨頭壞死組織病理和形態(tài)的影響

由圖6所示，治療后4周，模型組大鼠骨小梁變窄，形態(tài)不規(guī)則，明顯變稀疏，骨小梁分割程度亦明顯下降，骨髓腔擴大（圖6A）。EPC組骨小梁變窄較之減輕，斷裂明顯減少，部分骨小梁較粗，骨小梁分割程度、骨小梁連接程度優(yōu)于股骨頭壞死組（圖6B）。EPO-EPC組上述病理變化進一步減輕，骨小梁壞死、缺失進一步減輕，骨陷窩內(nèi)骨細(xì)胞進一步增多（圖6C）。骨組織形態(tài)參數(shù)測定結(jié)果（表3）顯示，與模型組相比，EPC組和EPO-EPC組骨小梁面積百分?jǐn)?shù)、骨小梁寬度增加（P＜0.05），骨小梁分離度減少（P＜0.05）。

2.8 移植EPO-EPC對GIONFH大鼠壞死股骨頭組織CFSE標(biāo)記陽性細(xì)胞數(shù)量的影響

如圖7所示，模型組未見CFSE標(biāo)記的陽性細(xì)胞，EPC組高倍視野可見CFSE標(biāo)記的EPC為32±4，EPO-EPC組CFSE標(biāo)記的EPC為54±5，明顯多于EPC組（P＜0.01）。

Tab.2 Effect of EPO-EPC transpIantation on hindIimb motor abiIity of rats with GIONFH

Fig.6 Effect of EPO-EPC transpIantation on pathoIogicaI changes of femoraI head tissue of rats with GIONFH by HE stainning.See Fig.3 for the rat treatment.

Tab.3 Effect of EPO-EPC transpIantation on behavior of rats with GIONFH

Fig.7 Effect of EPO-EPC transpIantation on distribution of CFSE-IabeIed EPCs in femoraI head tissue of rats with GIONFH by fIuorescence microscope observation.See Fig.3 for the rat treatment.Arrows show CFSE-labeled EPCs.

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，真核表達質(zhì)粒pcDNA3-EPO轉(zhuǎn)染EPC后，EPO能夠穩(wěn)定表達4周；EPO-EPC移植能夠有效緩解大鼠GIONFH壞死區(qū)病理損傷，使得骨小梁面積百分?jǐn)?shù)、骨小梁寬度增加，骨小梁分離度減少，局部凋亡率降低，CFSE標(biāo)記的EPC移植后存活率升高。進一步研究發(fā)現(xiàn)，EPO-EPC組大鼠股骨頭區(qū)組織活化胱天蛋白酶3、Puma基因和蛋白明顯降低、BCL-XL和EPO基因和蛋白表達明顯升高，表明EPO-EPC移植治療大鼠GIONFH機制與移植EPC細(xì)胞的存活、高表達EPO及促進BCL-XL和抑制活化胱天蛋白酶3及Puma基因和蛋白表達有關(guān)。

臨床研究表明，人體骨髓EPC的數(shù)量與骨密度成顯著性正相關(guān)，表明EPC對骨組織新陳代謝可能有正調(diào)控作用，能夠有效促進成骨作用［14-16］。由此可以推測，若通過靜脈移植EPC提高體內(nèi)成骨細(xì)胞的數(shù)量，可能對GIONFH發(fā)揮治療作用。本研究結(jié)果顯示，EPC移植或者EPO-EPC移植后能夠有效緩解大鼠GIONFH區(qū)病理損傷，表明EPC移植具有修復(fù)壞死骨質(zhì)的作用。

EPO是一種多效性細(xì)胞因子。研究表明，其在促進紅細(xì)胞生成的同時能夠在多種疾病中通過其抗凋亡作用實現(xiàn)對組織細(xì)胞的保護作用，其對GIONFH有預(yù)防和治療作用［17-19］。另有研究表明，EPO可以協(xié)同其他生長因子加速紅系組細(xì)胞的增殖及成熟，并能促進骨髓中紅細(xì)胞的釋放［20-22］。本研究結(jié)果顯示，EPC在轉(zhuǎn)染人EPO基因后2和4周EPO高表達，表明轉(zhuǎn)染穩(wěn)定可靠。將EPO-EPC尾靜脈移植到大鼠GIONFH區(qū)，結(jié)果顯示，EPO-EPC組病理變化較EPC移植組進一步減輕。EPO-EPC組大鼠股骨頭壞死區(qū)組織活化胱天蛋白酶3和Puma基因和蛋白明顯降低，BCL-XL和EPO基因和蛋白表達進一步升高，細(xì)胞凋亡進一步減少。EPO-EPC組骨小梁面積百分?jǐn)?shù)、骨小梁寬度增加，骨小梁分離度減少，CFSE標(biāo)記細(xì)胞進一步增多。行為學(xué)實驗結(jié)果顯示，大鼠活動總距離、自主活動次數(shù)及抓力EPO-EPC組明顯高于模型組和EPC組。以上結(jié)果表明，EPO-EPC對GIONFH修復(fù)作用更為明顯。

Puma是近十多年來新發(fā)現(xiàn)的一個促凋亡基因［23-25］，在細(xì)胞凋亡中起到重要作用，其編碼的Puma蛋白是BCL-2家族成員之一，經(jīng)線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，與BCL-2/BCL-XL之間相互作用，促凋亡分子的釋放及胱天蛋白酶級聯(lián)效應(yīng)是Puma凋亡效應(yīng)的分子基礎(chǔ)［26-28］。本研究發(fā)現(xiàn)，EPC移植可以顯著下調(diào)活化胱天蛋白酶3、Puma基因和蛋白的表達，EPO-EPC組下調(diào)更為明顯，提示EPO基因修飾EPC，改善GIONFH可能與其下調(diào)活化胱天蛋白酶3和Puma基因和蛋白的表達有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn),骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的凋亡是GIONFH最早期的病理改變［29-30］。本研究發(fā)現(xiàn)，移植后7 d，成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞凋亡指數(shù)EPO基因修飾組最低，推測對骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的凋亡進行阻斷可能是GIONFH治療的有效途徑之一。EPO可能能通過抑制成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞凋亡，發(fā)揮對大鼠GIONFH的保護作用。同時行為學(xué)檢測結(jié)果表明，大鼠肢體活動能力明顯改善，EPO-EPC組更明顯，表明EPC移植對股骨頭壞死有治療作用，經(jīng)EPO-EPC移植能進一步提高治療效果。

綜述所述，EPO-EPC移植到大鼠激素性股骨頭壞死區(qū)，壞死病灶內(nèi)有新骨生成和血管形成，減少成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞凋亡指數(shù)，表明EPO-EPC移植治療股骨頭壞死的有效性。EPO-EPC移植對股骨頭壞死治療的具體作用機制尚需進一步探討。