楊卓瀅 趙源征 何遠(yuǎn)宏 孫若楠 苑和平

鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科（鄭州450052）

腦梗死是目前導(dǎo)致全球人口死亡的主要原因之一，其特點(diǎn)是高發(fā)病率、高致殘率和高病死率等。目前腦梗死的主要治療仍然是超早期的溶栓治療，條件有限且時(shí)間窗嚴(yán)格，只有少數(shù)病人能得到治療［1-2］。因此很多腦梗死患者都遺留有不同程度的神經(jīng)功能缺失，此時(shí)機(jī)體出現(xiàn)代償機(jī)制，使得功能恢復(fù)，其中突觸可塑性的作用，尤為關(guān)鍵。突觸素（synaptophysin，SYP）是一種特異性的位于突觸囊泡膜上的蛋白，它參與突觸發(fā)生。生長(zhǎng)相關(guān)蛋白43（growth associated protein 43，GAP43）是一種胞膜磷酸蛋白，由神經(jīng)元胞體合成，主要集中于生長(zhǎng)錐末端，促進(jìn)軸突再生，且具有軸突導(dǎo)向作用，二者都是突觸可塑性標(biāo)志物［3-4］。

KATP 通道是一種ATP 敏感型鉀離子通道，廣泛遍布于大腦區(qū)域，腦梗死時(shí)，人體處于缺氧或營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)輸送不足的病理狀態(tài)，ATP 水平降低，KATP 通道被激活，進(jìn)而可通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡，減少興奮性毒性，減少鈣超載和調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激來(lái)減少損傷［5-7］。因此，KATP 通道可能是治療腦梗死的重要治療靶點(diǎn)。尼可地爾，化學(xué)名為N?（2?羥乙基）?煙酰胺硝酸鹽酯，是首個(gè)應(yīng)用于臨床的KATP通道開(kāi)放劑，有研究表明，尼可地爾對(duì)血管性癡呆、亨廷頓病有改善作用［8-9］。也有研究證明，在腦梗死中，尼可地爾可以通過(guò)增加腦血流量，減輕炎癥等來(lái)減輕腦損傷［10］。然而，尼可地爾對(duì)腦梗死后突觸可塑性方面的作用尚不清楚。

本研究采用大鼠MCAO 模型，通過(guò)研究尼可地爾對(duì)腦梗死后突觸形成相關(guān)因子SYP 和GAP43表達(dá)的影響，來(lái)探討其作為腦梗死治療靶點(diǎn)的可行性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑選取SPF 級(jí)雄性SD 大鼠（200 ～240 g，6 ～8 周齡），購(gòu)于鄭州大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。所有老鼠飼養(yǎng)于（22±1）℃的恒溫條件下，自由飲食。試劑：尼可地爾（北京四環(huán)科寶制藥有限公司，中國(guó)），尼氏染液（北京索萊寶科技有限公司，中國(guó)），SYP、GAP43 及GAPDH 引物合成（上海生工生物工程有限公司，中國(guó)），兔抗SYP（abcam，美國(guó)），兔抗GAP43（abcam，美國(guó)），山羊抗兔二抗（abcam，美國(guó)），辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔二抗（上海生工生物工程有限公司，中國(guó)）。

1.2 模型制備與分組根據(jù)完全數(shù)字隨機(jī)表法將大鼠分為三組：假手術(shù)+溶劑組，腦梗死+溶劑組和腦梗死+尼可地爾組，每組34 只。造模后，腦梗死+尼可地爾組大鼠行尼可地爾灌胃處理，劑量為7.5 mg/（kg·d）。另外兩組給予等量生理鹽水。模型制備：采用10%水合氯醛（3.5 mL/kg）給予大鼠腹腔注射麻醉后，取仰臥位固定，在顯微鏡下分離右側(cè)頸總動(dòng)脈和頸內(nèi)外動(dòng)脈，結(jié)扎頸總動(dòng)脈，在動(dòng)脈間剪一小口，用線栓插至大腦中動(dòng)脈起始段，長(zhǎng)度約（20.0± 2.0）mm。固定線栓，縫合結(jié)扎。1.5 h后移除線栓。假手術(shù)組大鼠線栓插入大腦中動(dòng)脈起始段后，立馬拔出。其余操作同腦梗死組［11］。采用Zea?Longa 評(píng)分法評(píng)估模型，1 ～3 分視為造模成功，將評(píng)分為0 或4 分的大鼠剔除。

1.3 尼氏染色術(shù)后第7 天，腦梗死+溶劑組和腦梗死+ 尼可地爾組各取6 只大鼠，深度麻醉后，經(jīng)PBS、4%多聚甲醛灌注后，取腦，置于4%多聚甲醛過(guò)夜，后于30%蔗糖中脫水至沉底，包埋，切成20 μm 的冰凍切片。切片置于載玻片上，進(jìn)行尼氏染色［12］。計(jì)算公式為：腦梗死體積百分比=［（左側(cè)體積?右側(cè)非梗死體積）/左側(cè)體積］×100%。

1.4 神經(jīng)功能評(píng)分采用改良神經(jīng)功能評(píng)分（modified neurological severity scores，mNSS）法［13］，腦梗死+溶劑組和腦梗死+尼可地爾組各取8 只大鼠，在造模后1、3、7、14 天，進(jìn)行神經(jīng)功能缺損的評(píng)估。評(píng)分為0 ～18 分，評(píng)分越高，代表神經(jīng)功能缺損越嚴(yán)重。

1.5 水迷宮術(shù)后9 ～14 d采用Morris水迷宮對(duì)大鼠進(jìn)行學(xué)習(xí)記憶能力測(cè)試［14］。圓形水池高50 cm，直徑150 cm，深30 cm，水溫20 ～22 ℃，水池等分為四個(gè)象限，圓形逃逸平臺(tái)（直徑12 cm）沒(méi)入第三象限中央水平面下2 cm。在前五天，每只大鼠被隨機(jī)置于其中一個(gè)象限放入水中，記錄在120 s 內(nèi)大鼠找到隱藏平臺(tái)的時(shí)間，若大鼠120 s 內(nèi)未找到平臺(tái)，則引導(dǎo)其到平臺(tái)并停留10 s，逃逸潛伏期被記錄為120 s，測(cè)試每天1 次。第14 天將隱藏的平臺(tái)移開(kāi)，進(jìn)行空間探索試驗(yàn)，大鼠從第一象限同一入水點(diǎn)下水，記錄大鼠在120 s 內(nèi)停留在原平臺(tái)象限的時(shí)間。

1.6 RT?PCR分別于術(shù)后第7 天和14 天檢測(cè)海馬區(qū)GAP43 和SYP 的mRNA 表達(dá)。取腦梗側(cè)海馬區(qū)組織于液氮中快速研磨，采用Trizol 試劑盒提取總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA 水平，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，后進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)［15］，設(shè)計(jì)產(chǎn)物見(jiàn)表1。PCR 產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，以GAPDH 作為內(nèi)參，紫外燈下攝像并分析各組間SYP、GAP43 的相對(duì)表達(dá)量。

1.7 Western blot分別檢測(cè)手術(shù)后7 天和14 天海馬區(qū)GAP43 和SYP 的蛋白表達(dá)，取腦梗側(cè)海馬區(qū)組織［16］，與適量組織裂解液充分混勻后，置于勻漿機(jī)上充分勻漿后離心（4 ℃，14 000 r/min）。吸取上清液，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。BCA 法測(cè)總蛋白含量，用12%SDS?PAGE 凝膠電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，5%脫脂牛奶封閉1 h 后，加入兔抗大鼠SYP 一抗（1∶20 000），或兔抗大鼠GAP43 一抗（1∶1 000），4 ℃冰箱過(guò)夜。TBST 漂洗后，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗（1∶2 000）室溫孵育1 h，把GAPDH 作為內(nèi)參，用ECL 發(fā)光法查看條帶情況。使用ImageJ 軟件量化條帶光密度。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)使用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。腦梗死體積比較采用t檢驗(yàn)，mNSS 評(píng)分及水迷宮結(jié)果比較采用重復(fù)測(cè)量方差分析，各組大鼠SYP 和GAP43 的PCR 以及Western blot 結(jié)果比較采用單因素方差分析，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

圖1 各組大鼠腦梗死體積、神經(jīng)功能缺損評(píng)分分析結(jié)果Fig.1 Results of cerebral infarction volume and neurological deficit score of rats in each group

2.1 尼可地爾對(duì)腦梗死大鼠梗死體積以及mNSS評(píng)分的影響尼氏染色結(jié)果顯示，腦梗死+尼可地爾組腦梗死體積［（15.77 ± 4.25）%］較腦梗死+溶劑組［（31.23 ± 3.16）%］明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t= 7.16，P< 0.05，見(jiàn)圖1A）。神經(jīng)功能評(píng)分結(jié)果顯示，術(shù)后第3、7、14 天，腦梗死+尼可地爾組的評(píng)分明顯低于腦梗死+溶劑組，尼可地爾顯著改善腦梗死大鼠的神經(jīng)功能缺損，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=13.847，P<0.05，見(jiàn)圖1B）。

2.2 各組大鼠水迷宮試驗(yàn)結(jié)果腦梗死+溶劑組大鼠逃逸潛伏期的下降情況整體高于假手術(shù)+溶劑組和腦梗死+ 尼可地爾組（P< 0.05，見(jiàn)圖2A）；腦梗死+ 溶劑組大鼠的停留時(shí)間較假手術(shù)+溶劑組明顯減少，腦梗死+ 尼可地爾組大鼠的停留時(shí)間較腦梗死+ 溶劑組明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，見(jiàn)圖2B）。

2.3 觀察各組大鼠SYP、GAP43 mRNA的表達(dá)與假手術(shù)+溶劑組（0.93±0.08）相比，腦梗死+溶劑組SYP 水平（0.44 ± 0.10）明顯下降，而與腦梗死+溶劑組相比，腦梗死+尼可地爾組SYP 水平（0.63 ±0.13）升高（P<0.05，見(jiàn)3A、C）。與假手術(shù)+溶劑組（0.62 ± 0.05）相比，腦梗死+ 溶劑組GAP43 水平（0.84±0.07）增加。而與腦梗死+溶劑組相比，腦梗死+尼可地爾組GAP43 水平（1.04±0.10）進(jìn)一步升高（P<0.05，見(jiàn)圖3B、D）。

圖2 各組大鼠水迷宮試驗(yàn)分析結(jié)果Fig.2 Results of morris water maze test of rats in each group

圖3 各組大鼠SYP、GAP43 mRNA 分析結(jié)果Fig.3 Results of SYP and GAP43 mRNA of rats in each group

2.4 尼可地爾對(duì)各組大鼠SYP、GAP43 蛋白表達(dá)量的影響與假手術(shù)+溶劑組（1.04 ± 0.08）相比，腦梗死+溶劑組SYP 水平（0.67 ± 0.10）下降，而與腦梗死+溶劑組相比，腦梗死+尼可地爾組SYP 水平（0.97 ± 0.12）則有所升高（P< 0.05，見(jiàn)4A、C）。與假手術(shù)+溶劑組（0.59±0.07）相比，腦梗死+溶劑組GAP43 水平（0.79±0.10）增加。而與腦梗死+溶劑組相比，腦梗死+尼可地爾組GAP43 水平（0.99±0.12）進(jìn)一步升高（P<0.05，見(jiàn)圖4B、D）。

3 討論

腦缺血后，軸突遭到破壞，機(jī)體產(chǎn)生代償，與突觸生長(zhǎng)和重建有關(guān)的蛋白水平會(huì)發(fā)生變化，通過(guò)蛋白之間的相互作用，共同完成信息的傳遞作用，進(jìn)而提高突觸可塑性，促進(jìn)神經(jīng)功能的修復(fù)。其中，SYP 和GAP43 便是會(huì)隨之變化的與突觸傳遞有密切關(guān)系的蛋白［17］。因此，本研究把研究點(diǎn)著力于這兩個(gè)因子的表達(dá)變化上。

圖4 各組大鼠SYP、GAP43 蛋白分析結(jié)果Fig.4 Results of SYP and GAP43 protein of rats in each group

SYP 廣泛存在于神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)末梢中，與其他突觸蛋白互相作用，完成信息傳遞，具有調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)釋放的作用，影響突觸可塑性［18］。研究表明，腦缺血會(huì)破壞突觸，降低SYP 的表達(dá)［19-20］。與這些研究的結(jié)果一致，本研究中，腦梗死組大鼠SYP 水平較假手術(shù)組明顯降低。而應(yīng)用了尼可地爾的大鼠SYP 水平有所提高，提示尼可地爾可以抑制腦缺血后SYP 的減少。在成熟神經(jīng)元中，軸突的生長(zhǎng)處于一種抑制狀態(tài)，GAP43 的水平很低。突觸遭到破壞后，誘發(fā)大腦可塑性修復(fù)結(jié)構(gòu)并進(jìn)行功能性補(bǔ)償，軸突被誘導(dǎo)生長(zhǎng)和重建，許多與軸突生長(zhǎng)有關(guān)的蛋白合成會(huì)增加，GAP43 則是其中之一［21］。有研究表明，腦缺血后，GAP43 水平會(huì)有不同程度的增長(zhǎng)，第7 天達(dá)到高峰，第21 天則又明顯降低，這可能和當(dāng)建立代償性突觸連接時(shí)，GAP43 的表達(dá)會(huì)降低至基礎(chǔ)水平有關(guān)系［22-23］。本研究選擇了術(shù)后第7 天的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行觀察，結(jié)果顯示，腦梗死組GAP43 水平較假手術(shù)組增加，尼可地爾則又進(jìn)一步促進(jìn)了GAP43 的增加。尼可地爾增加了SYP 和GAP43 的含量，說(shuō)明其可能會(huì)促進(jìn)腦梗死后突觸的重建、再生，對(duì)腦梗死后的神經(jīng)功能缺損有改善作用。

在mNSS 實(shí)驗(yàn)中，與腦梗死+溶劑組的比較，腦梗死+尼可地爾組神經(jīng)功能缺損評(píng)分在術(shù)后第3、7、14 天有明顯改善，說(shuō)明在腦缺血后神經(jīng)功能恢復(fù)過(guò)程中，尼可地爾促進(jìn)了其進(jìn)程，這可能與KATP 通道減輕鈣離子超載，抑制細(xì)胞凋亡，擴(kuò)張腦血管，增加腦血流量等作用有關(guān)［24］。同時(shí)，在尼氏染色的結(jié)果比較中，尼可地爾可以減少梗死體積，該結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究中，服用了尼可地爾的大鼠在水迷宮試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)隱藏平臺(tái)的潛伏期更短，說(shuō)明大鼠學(xué)習(xí)和記憶能力有所改善，進(jìn)一步證實(shí)了尼可地爾對(duì)促進(jìn)腦梗死后的功能恢復(fù)是有效的。曾有研究顯示尼可地爾能激活海馬KATP 通道并參與學(xué)習(xí)和記憶，這一發(fā)現(xiàn)與該研究結(jié)果一致。該有益作用可能與神經(jīng)元損傷的減少，中樞膽堿能功能障礙的預(yù)防和氧化損傷的減少有關(guān)［8］。這表明尼可地爾可能改善了突觸重塑，在MCAO 后的學(xué)習(xí)記憶功能恢復(fù)中起著重要的作用。

綜上所述，本文通過(guò)對(duì)腦梗死模型大鼠實(shí)驗(yàn)的研究，發(fā)現(xiàn)尼可地爾可以改善腦梗死后功能缺損，這可能和提高了腦梗死后SYP 和GAP43 的表達(dá)，改善了突觸可塑性有關(guān)。本研究為臨床上運(yùn)用尼可地爾治療腦梗死提供一定的理論依據(jù)。本研究的不足在于沒(méi)有進(jìn)一步研究尼可地爾具體是通過(guò)何種信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)的保護(hù)作用，這有待在后續(xù)研究中進(jìn)行探討和驗(yàn)證。