劉 嘎， 蒙小剛，2， 史量全，2， 東彥新， 潮洛蒙， 劉 鍇，2， 徐 靜

(1.內(nèi)蒙古民族大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)肉牛疾病防控工程技術(shù)研究中心，內(nèi)蒙古 通遼028000)

牛腐蹄病也叫趾(指)間壞死桿菌病、趾(指)間蜂窩織炎，是指牛蹄部趾間皮膚以及深部組織發(fā)生的急性或亞急性炎癥[1].引起牛腐蹄病的原因很多.飼養(yǎng)管理方面， 主要是草料中鈣、磷不平衡， 導(dǎo)致牛角質(zhì)疏松，蹄變形和不正；牛舍不干凈、潮濕， 運(yùn)動(dòng)場(chǎng)泥濘， 蹄部經(jīng)常浸泡于糞尿、泥漿，致使局部組織軟化；石子、鐵屑及堅(jiān)硬的草木、玻璃碴等刺傷軟組織而引起蹄部發(fā)炎[2].病原微生物方面，壞死梭桿菌、節(jié)瘤擬桿菌、結(jié)節(jié)狀類桿菌、酵母菌、產(chǎn)黑色素類桿菌和某些球菌等都能引起腐蹄病.其中，壞死梭桿菌是一種人畜共患病病原，可以引起人和牛、羊、豬等多種動(dòng)物局部組織的化膿、壞死性疾病，在腐蹄病中較為常見[3-4].內(nèi)蒙古通遼市某牛場(chǎng)中飼養(yǎng)的一頭牛發(fā)生腐蹄病，主要表現(xiàn)為蹄部嚴(yán)重腐爛、骨外露，腐爛部位最初呈現(xiàn)膿皰狀，之后膿皰破裂形成膿洞，最后每個(gè)膿洞連在一起導(dǎo)致整個(gè)蹄部腐爛.本研究從該牛場(chǎng)的發(fā)病犢牛蹄部分離并鑒定出一株黃腐短桿菌(Brevibacterium luteolum)，是牛腐蹄病致病菌的新發(fā)現(xiàn)，可為生產(chǎn)中該病的預(yù)防及科研人員的研究提供理論基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料及試驗(yàn)動(dòng)物 通遼市某養(yǎng)牛場(chǎng)送檢的一只犢牛，牛左前肢蹄部腐爛.BALB/c 小白鼠(20 g 左右)10 只，購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司.

1.1.2 主要試劑及儀器 2×Taq master Mix、DNA 提取試劑盒(TIANamp Bacteria DNA Kit)，均購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；抗菌藥物藥敏紙片，購(gòu)自杭州市濱和有限公司；dNTPs，購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司；C600 凝膠成像系統(tǒng)，購(gòu)自北京深藍(lán)云生物科技有限公司；PCR 儀，購(gòu)自美國(guó)Thermo 公司；DL2 000 DNA Marker，購(gòu)自上海生工股份有限公司；BD phoenixTMNMIC/ID-4 鑒定卡、BD phoenixTM100 全自動(dòng)微生物鑒定儀、革蘭氏陰性菌鑒定板及鑒定肉湯，均購(gòu)自于美國(guó)BD 醫(yī)療器械有限公司.

1.2 方法

1.2.1 菌株的分離和培養(yǎng) 用接種環(huán)無(wú)菌采集牛犢左前肢蹄部腐爛組織，分別劃線接種于普通瓊脂培養(yǎng)基和血平板上，在37 ℃恒溫箱厭氧培養(yǎng)24 ～36 h，分離菌落經(jīng)革蘭氏染色，觀察染色情況[5].挑取單菌落放入LB 液體培養(yǎng)基中，在37 ℃恒溫?fù)u床(150 r·min-1)下擴(kuò)增培養(yǎng)12 h，后在4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?

1.2.2 致病性試驗(yàn) 將小白鼠分成試驗(yàn)組和對(duì)照組，每組5 只，試驗(yàn)組每只小白鼠腹腔注射2.0×1010CFU·mL-1分離菌0.5 mL，對(duì)照組每只小白鼠注射0.5 mL 生理鹽水.每隔4 h 觀察一次小白鼠.

1.2.3 生化試驗(yàn) 用無(wú)菌棉簽蘸取純培養(yǎng)的單個(gè)菌落并接種于ID 肉湯鑒定培養(yǎng)管中，調(diào)成1.8×109CFU·mL-1的菌懸液，將液體倒入革蘭氏陰性菌鑒定板上對(duì)應(yīng)的生化鑒定孔，放入BD phoenixTM100 全自動(dòng)微生物鑒定儀中，錄入信息，反應(yīng)結(jié)束后記錄結(jié)果.試驗(yàn)重復(fù)3 次[6].

1.2.4 藥敏試驗(yàn) 吸取200 μL 菌液均勻涂布在普通培養(yǎng)基表面，室溫放置4～7 min 后，選取慶大霉素、卡那霉素、青霉素、多西環(huán)素等12 種抗生素藥敏片，貼在平板表面，37 ℃恒溫孵育24 h，測(cè)量抑菌圈直徑.根據(jù)藥敏片判別標(biāo)準(zhǔn)判斷該菌的藥物敏感性:抑菌圈直徑≥6 mm 為敏感，抑菌圈直徑＜6 mm 為耐藥.

1.2.5 16S rRNA 基因PCR 擴(kuò)增 根據(jù)細(xì)菌核酸提取試劑盒說(shuō)明書提取分離菌的核酸，以此為模板，采用16S rRNA 通用引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，上游引物為27F 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，下游引物為1492R 3′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-5′，上、下游引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成.PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系(25 μL):PCR Mastermix 12.5 μL，模板3 μL，上、下游引物各1 μL，ddH2O 7.5 μL.擴(kuò)增程序:94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35 個(gè)循環(huán)數(shù)；72 ℃延伸10 min.PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，觀察并記錄結(jié)果.

1.2.6 菌株遺傳進(jìn)化樹及遺傳距離分析 將PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物送至北京生工生物股份有限公司測(cè)序，將測(cè)得的序列在NCBI 上進(jìn)行BLAST 比對(duì)分析，選取同源性較高的序列，用MEGA 6.0 軟件構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹和遺傳距離表.

2 結(jié)果與分析

2.1 分離菌培養(yǎng)特征

分離菌厭氧培養(yǎng)24 h 后，才開始有菌落生長(zhǎng)，說(shuō)明分離菌生長(zhǎng)緩慢；菌落在普通培養(yǎng)基和血平板上均呈現(xiàn)黃色、圓形，表面光滑且濕潤(rùn)，邊緣整齊(圖1).經(jīng)染色后鏡檢可知，分離菌為革蘭氏陰性桿菌，無(wú)芽孢莢膜(圖2).純化后的菌株被命名為L(zhǎng)G-01.

圖1 菌株LG-01 在普通瓊脂培養(yǎng)基(A)和血平板(B)上的生長(zhǎng)情況Fig.1 Growth of strain LG-01 on common agar medium (A) and fresh blood medium (B)

2.2 分離菌的致病性

小白鼠腹腔注射分離菌液8 h 后開始產(chǎn)生病變，爪部出現(xiàn)紅腫，血管膨脹(圖3A)；12 h 左右開始出現(xiàn)膿包(圖3B)；16 h左右腿部腐爛(圖3C～D)，小鼠死亡.將死亡小鼠解剖，對(duì)肝臟及脾臟進(jìn)行涂片、染色，在顯微鏡下觀察的菌落形態(tài)和染色結(jié)果與所接種菌一致，說(shuō)明該菌為牛腐蹄病的致病菌.

2.3 分離菌的生化特性和藥物敏感性

菌株LG-01 對(duì)L-亮氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、L-苯丙氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、L-脯氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、L-色氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素為陽(yáng)性反應(yīng)，其余為陰性反應(yīng)(表1).BD phoenixTM100 鑒定結(jié)果顯示，該分離菌為黃腐短桿菌.

圖2 菌株LG-01 革蘭氏染色結(jié)果(1 000×)Fig.2 Gram staining result of strain LG-01(1 000×)

圖3 菌株LG-01 引起小鼠的病變特征Fig.3 Pathological characteristics of mice infected with strain LG-01

表1 菌株LG-01 生化特性1)Table 1 Biochemical characteristics of strain LG-01

藥敏試驗(yàn)結(jié)果(表2)顯示，分離菌對(duì)卡那霉素、丁胺卡那、紅霉素產(chǎn)生了耐藥性，但對(duì)其余9 種抗生素敏感.

表2 菌株LG-01 對(duì)12 種抗生素的敏感性1)Table 2 Sensitivity of strain LG-01 to 12 antibiotics

2.4 16S rRNA 基因PCR 擴(kuò)增結(jié)果

16S rRNA 基因PCR 擴(kuò)增結(jié)果顯示，在1 000～2 000 bp間有一條清晰的條帶，經(jīng)測(cè)序，確定其長(zhǎng)度為1 434 bp(圖4).

2.5 16S rRNA 基因遺傳進(jìn)化樹分析及遺傳距離比較

將所得序列經(jīng)BLAST 比對(duì)發(fā)現(xiàn)，菌株LG-01 與B.luteolum的同源性達(dá)到99%；遺傳進(jìn)化樹(圖5)顯示，菌株LG-01 與登錄號(hào)為AB210988.1 的B.luteolum聚在同一分支上，親緣關(guān)系最近，兩者的遺傳距離為0.003，小于LG-01 與其他菌株的遺傳距離(表3).因此，最終確定所分離的菌株為黃腐短桿菌(B.luteolum).

圖4 16S rRNA 基因PCR 擴(kuò)增結(jié)果Fig.4 PCR amplification of 16S rRNA genes

圖5 基于16S rRNA 基因構(gòu)建的菌株LG-01 與其同源性較高菌株的遺傳進(jìn)化樹Fig.5 Genetic evolution tree of strain LG-01 and strains with high homology based on 16S rRNA gene

3 討論

注射分離菌液后大多數(shù)小鼠的發(fā)病過程表現(xiàn)為:初期蹄部紅腫；中期蹄部出現(xiàn)膿皰，之后膿皰增多并破裂，整個(gè)蹄部腐爛壞死，有黃色濃汁流出并結(jié)痂，散發(fā)惡臭味；后期大腿部肌肉僵硬壞死，致使其行動(dòng)不便，最后死亡.發(fā)病癥狀與送檢犢牛的情況相符，由此可以判斷該分離菌是引發(fā)此次犢牛腐蹄病的主要致病菌.通過菌落形態(tài)觀察、生化特性測(cè)定和16S rRNA 基因分析，將該菌確定為黃腐短桿菌.

表3 菌株LG-01 與其同源性較高菌株的遺傳距離Talbe 3 Genetic distances between strain LG-01 and others sharing high homology

牛腐蹄病是一種發(fā)病率高、接觸傳染性強(qiáng)的危害養(yǎng)牛業(yè)的三大疾病之一[7].為有效控制該病在牛群中傳播，需要對(duì)致病原因進(jìn)行準(zhǔn)確把握[8].節(jié)瘤擬桿菌和壞死梭桿菌是導(dǎo)致牛腐蹄病的主要病原微生物，節(jié)瘤擬桿菌通過Ⅳ型纖毛和細(xì)胞外蛋白酶產(chǎn)生致病作用，而壞死梭桿菌由病原體產(chǎn)生白細(xì)胞毒素、內(nèi)毒素脂多糖及溶血素而產(chǎn)生致病作用，混合感染情況下， 僅少量的壞死梭桿菌即可誘發(fā)腐蹄病發(fā)生[9].本次從犢牛病變部位分離的黃腐短桿菌，是一種革蘭氏陰性短桿菌，其對(duì)家畜的感染情況尚未見報(bào)道，有關(guān)該菌的致病性有待進(jìn)一步研究.Jorge[10]和Thankaswamy et al[11]研究表明，黃腐短桿菌可用于微生物降解和生物催化劑等方面，所以對(duì)該菌的用途還有待探索.

此外，營(yíng)養(yǎng)、環(huán)境等都是造成牛腐蹄病發(fā)生的重要因素[12].養(yǎng)殖人員應(yīng)對(duì)畜舍進(jìn)行定期消毒滅菌，及時(shí)修剪牛蹄部，適當(dāng)對(duì)牛蹄進(jìn)行藥浴，以預(yù)防該病的發(fā)生.