曹羽明，張元珍，羅孟成

(武漢大學中南醫(yī)院生殖醫(yī)學中心 武漢大學基礎醫(yī)學院發(fā)育源性疾病湖北省重點實驗室，武漢 430071)

體外受精-胚胎移植(IVF-ET)作為解決不孕癥的有效手段，目前已獲得較大的成就，同時也遇到了諸多的挑戰(zhàn)。大約2/3的輔助生殖技術(ART)周期無法達成妊娠，大約4/5的移植胚胎無法成功植入[1]。研究顯示在新鮮胚胎移植失敗后采用解凍胚胎的輔助生殖周期，單個胚胎植入率和繼續(xù)妊娠率均有提高[2]，可能與優(yōu)質胚胎的選擇相關，而篩選優(yōu)質配子是獲得優(yōu)質胚胎的前提。目前，篩選配子及可移植胚胎仍是依據形態(tài)學評分，其局限性不僅源于胚胎學家的主觀性，還源于以靜態(tài)的方式來觀察一個動態(tài)變化的過程，且多次將配子或胚胎在培養(yǎng)箱中取出觀察會改變培養(yǎng)環(huán)境而不利于胚胎發(fā)育，另外持續(xù)觀察設備不僅價格昂貴且單次觀察標本數(shù)量有限。此外，目前評分標準尚不統(tǒng)一，形態(tài)學評估的局限促使學者探求基因組學、蛋白組學及代謝組學等輔助技術來評估配子及胚胎的發(fā)育潛能。

一、代謝組學概述

伴隨蛋白質組學等無創(chuàng)檢測手段的發(fā)展，代謝組學在生殖領域的研究也得以展開[3]。代謝組學是探求代謝物與生理病理變化相對關系的方法，它源于基因組學、轉錄組學和蛋白組學，是系統(tǒng)生物學的重要組成部分。基因組、轉錄組、蛋白組及代謝組的級聯(lián)關系描述了生物信息的流動。人類基因組由約250 000個基因組成，編碼了大約200 000個轉錄本和多于100萬個蛋白質，而代謝組由大約3 000個代謝物組成。較低的代謝物數(shù)量意味著其結果分析比基因組及蛋白組快，能很好地反映基因表達下游事件，并提供細胞內代謝的信息，這是其他“組學”技術所做不到的。生物體細胞內的代謝物與灌注細胞的生物流體中的代謝物是動態(tài)平衡的。因此，有機體所受到的影響可以反映在生物流體成分中，最終僅根據生物流體的代謝特征來預測不同病理生理狀態(tài)下有機體的代謝情況。本文總結卵泡液中代謝物預測卵母細胞質量及胚胎培養(yǎng)液中代謝物預測胚胎發(fā)育潛能的相關研究，分析有效檢測方法，總結有價值的評價指標，探索目前研究的局限并提出針對性解決方案，為盡早找到有效預測標志物提出建議。

二、卵泡液及胚胎培養(yǎng)液代謝物檢測對卵母細胞及胚胎質量評價的價值

細胞、器官或有機體中的低分子量代謝物是維持細胞正常功能和生長所必需的代謝終產物[4]。機體通過改變許多代謝物的濃度以維持穩(wěn)態(tài)，不孕可能導致代謝的不平衡，因此，代謝組學可用于研究不孕不育的原因及預測生殖結局，如對卵泡液、胚胎培養(yǎng)液及胚胎囊胚腔液中的代謝物進行分析，可以找到有效的生物標志物，以非侵入性方法識別優(yōu)質配子及胚胎，進而改善生殖結局。

卵泡液是卵母細胞生長的體內微環(huán)境，其包含卵泡生長和卵母細胞成熟所需組分，卵泡液中的代謝物變化可以反映卵母細胞的質量。在卵母細胞拾取過程中很容易獲得卵泡液，它是探求卵母細胞質量非侵入性生化指標的最佳來源。胚胎分泌代謝物到其培養(yǎng)環(huán)境中，可能是細胞內發(fā)生正常代謝的結果，也可能提示細胞損傷泄露。對人胚胎培養(yǎng)液進行代謝物分析，可以規(guī)避形態(tài)學觀察的缺陷，更有效地篩選出優(yōu)質胚胎。

1.葡萄糖代謝：卵母細胞質量與葡萄糖代謝相關性研究多應用質子核磁共振(NMR)以篩選出有價值的代謝物。高齡[5]、子宮內膜異位癥[6]、乳腺癌[7]及IVF卵裂失敗[8]患者卵母細胞質量下降與卵泡液中葡萄糖水平下降相關。厭氧糖酵解是哺乳動物卵泡內葡萄糖代謝的主要途徑，在卵泡發(fā)育過程中消耗葡萄糖并產生乳酸鹽[9]，但多囊卵巢綜合征(PCOS)患者卵母細胞質量下降是由于葡萄糖轉運障礙，體現(xiàn)為卵泡液中葡萄糖水平升高，這可能由于部分磷酸果糖激酶活性較低而使卵母細胞中葡萄糖的代謝能力降低[10]。葡萄糖消耗與卵母細胞質量下降的因果關系，以及PCOS患者卵母細胞質量下降與葡萄糖代謝的具體機制還有待進一步研究。

卵母細胞在細胞核和細胞質成熟過程中容易受到葡萄糖濃度變化的干擾，導致受精后胚胎發(fā)育不良[11]。胚胎發(fā)育過程中對葡萄糖的消耗量是逐漸增加的，優(yōu)質的囊胚對葡萄糖的攝取較劣質者多，妊娠成功率更高。然而，也有研究指出葡萄糖的消耗與胚胎的發(fā)育潛能無關[12]。葡萄糖是胚胎發(fā)育過程中所需的能量物質，但如何通過培養(yǎng)液中葡萄糖含量變化來預測胚胎發(fā)育潛能還存在分歧，葡萄糖代謝對胚胎體外發(fā)育的作用還需要深入研究。

2.氨基酸代謝：卵母細胞質量主要與卵泡液中谷氨酸[13]、谷氨酰胺[14]、精氨酸[15]、丙酮酸[11]、纈氨酸[11]、異亮氨酸[11]、天冬酰胺[7]和游離脂肪酸[16]的產生或消耗相關，與同型半胱氨酸水平無明顯相關性。氨基酸代謝與卵母細胞質量相關性的研究主要應用高效液相色譜(HPLC)、熱化學發(fā)光(TCL)、NMR等方法篩選代謝標志物。

值得注意的是HCG注射當天黃體酮水平升高會通過影響氨基酸代謝而導致高水平的8-羥基鳥苷和4-羥基壬烯醛，及低水平的ATP、雌二醇及L-肉堿，從而導致卵母細胞質量下降[17]。氨基酸是蛋白質合成的基礎，參與卵母細胞的發(fā)育及代謝，谷氨酸和纈氨酸代謝可能是影響卵母細胞質量的主要氨基酸代謝途徑，針對性探索其代謝過程可以快速有效地為獲取高質量卵母細胞篩選特異性標志物。氨基酸代謝與胚胎發(fā)育及植入潛能也存在相關性[18]，HPLC是氨基酸代謝預測胚胎發(fā)育潛能的有效檢測方法。發(fā)育潛能差的胚胎會消耗更多的谷氨酸及甘氨酸[19]，其靈敏度分別為88.2%和87%。胚胎培養(yǎng)液中的甘氨酸、天冬氨酸和亮氨酸的濃度改變與妊娠率和活產率相關[20]。對胚胎培養(yǎng)液中18種游離氨基酸進行檢測，發(fā)現(xiàn)發(fā)育至囊胚期的胚胎在卵裂早期對氨基酸的消耗量低于發(fā)育停滯的胚胎，發(fā)育阻滯的胚胎培養(yǎng)液中纈氨酸、蘇氨酸、賴氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸和一些有機酸的消耗量更大[21]。今后的研究應對胚胎培養(yǎng)液中谷氨酸、甘氨酸等成分進行定性及定量驗證。

3.膽固醇代謝：7β-羥基膽固醇可能是PCOS患者卵母細胞發(fā)育障礙的影響因素[22]。高齡不孕患者卵泡液中硫脲內酯和磷脂酰膽堿水平與卵母細胞質量下降相關[23]。溶血性磷脂酰膽堿上調和植物鞘氨醇的下調可能成為早期無創(chuàng)評估子宮內膜異位癥患者卵母細胞發(fā)育潛能的新工具[24]。不明原因反復種植失敗患者卵泡液中膽固醇水平降低[25]。膽固醇代謝與卵母細胞質量的相關性研究主要應用超高效液相色譜(UPLC)檢測，其次是理論質譜的序列窗口獲取(SWATHTM)及氣相色譜-質譜(GC/MS)。膽固醇是所有類固醇激素合成的前體，其如何通過影響顆粒細胞激素合成進而影響卵母細胞質量是未來的研究方向，且應關注膽固醇代謝預測胚胎的發(fā)育潛能。

4.維生素代謝：維生素E是參與卵母細胞發(fā)育過程的重要代謝物。卵泡液中低水平的25-羥基維生素D3及B-胡蘿卜素[26]與卵母細胞發(fā)育相關。高水平維生素E與高質量卵母細胞相關[27]。通過頂空氣相色譜-質譜法(HS/GC-MS)檢測卵泡液中維生素A，發(fā)現(xiàn)卵泡的發(fā)育與卵泡液中視黃醇及其生物活性代謝物全反式維甲酸濃度相關[28]。敲除維生素D受體的小鼠不能產生成熟的卵母細胞，但補充高水平的鈣可恢復其生育能力[29]。HPLC是檢測維生素代謝與卵母細胞質量相關性的有效方法，維生素D及其受體在人卵母細胞發(fā)育中的作用應進一步深入研究。

5.脂質代謝：卵泡液中棕櫚酸和硬脂酸等濃度改變能提高卵母細胞質量，而高水平飽和脂肪酸不利于卵母細胞的成熟[30]。高水平的磷脂酸與卵母細胞發(fā)育相關[31]。低水平磷脂酰甘油磷酸酯(PGP)和甘油三酯(TG)與PCOS患者低卵母細胞發(fā)育潛能及低受精率相關[32]。GC/MS是檢測脂質代謝的最有效的方法，其次是基質輔助激光解析電離飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS)及液相色譜/質譜聯(lián)用(UPLC-MS)。對動物卵泡發(fā)育不同階段的脂質代謝進行實驗分析，發(fā)現(xiàn)硬脂酸及非脂化脂肪酸升高會降低卵母細胞發(fā)育潛能[33]，檢測不同發(fā)育階段的代謝物濃度變化可能是更科學的研究方法。

氣相色譜分析植入前胚胎培養(yǎng)液中脂肪酸的代謝，發(fā)現(xiàn)發(fā)育正常的胚胎不飽和脂肪酸濃度升高，飽和脂肪酸濃度降低[34]。胚胎發(fā)育的過程中可能需要脂肪酸的存在，但其作用尚不明確，未來需要更多的研究驗證。

6.氧氣消耗：胚胎在體外培養(yǎng)過程中進行呼吸所消耗的氧氣量可以直接反映胚胎的呼吸效率并間接反映胚胎的代謝水平，與胚胎發(fā)育潛能及妊娠結局都相關[35-36]。長期培養(yǎng)人胚胎干細胞時發(fā)現(xiàn)，低氧環(huán)境培養(yǎng)獲得的優(yōu)質胚胎數(shù)目和可用胚胎數(shù)目更多[37]。在生理情況下，胚胎進行新陳代謝產生活性氧(ROS)，而ROS過高會對胚胎產生氧化損傷，影響胚胎早期發(fā)育[38]。當氧含量過高時，細胞內會形成活性氧基團，其會破壞細胞的DNA、脂肪和蛋白質進而影響胚胎發(fā)育[39]。胚胎自身存在一種抵抗活性氧基團的抗氧化能力，當其抗氧化能力降低或ROS升高均會影響胚胎發(fā)育潛能進而導致IVF-ET妊娠率降低[40]。胚胎呼吸作用正常與否對胚胎發(fā)育至關重要，可以通過間接檢測培養(yǎng)基中活性氧及氧化應激指標評價氧耗，進而評價胚胎發(fā)育潛能。

三、囊胚腔液代謝物檢測預測胚胎發(fā)育潛能

檢測胚胎本身的代謝活動不能被認為是非侵入性的，當前面臨的挑戰(zhàn)是在檢測代謝的同時如何確保對胚胎沒有明顯影響。胚胎植入前遺傳學診斷/篩查(PGD/PGS)采集活組織檢查通常選擇6～8細胞期卵裂球、囊胚球和極體，其中選擇囊胚球的準確率更高且對胚胎的傷害更小。Haggarty等[41]利用氣相色譜分析技術對植入前4～8細胞胚胎和尚未發(fā)育至4細胞階段胚胎的脂肪酸攝取量進行測定，發(fā)現(xiàn)植入前胚胎發(fā)育對飽和脂肪酸有一定的需求。冷凍儲存之前在囊胚腔中可以抽出囊胚液對胚胎進行直接代謝評估，而不是間接評估胚胎培養(yǎng)液，且不影響囊胚功能。囊胚腔液檢測胚胎代謝應深入定量研究以期應用于直接預測胚胎發(fā)育潛能。

四、結論與展望

總結所有關于卵泡液及胚胎培養(yǎng)液中代謝標志物的研究，可以看出代謝組學方法的不斷演變，從拉曼光譜(Raman)、TCL和近紅外光譜(NIR)，到HPLC及NMR。總結并分析相關研究得到有價值的預測指標主要有葡萄糖、氨基酸、膽固醇、維生素等。檢測手段從針對單一或兩三個已知代謝物的差異分析發(fā)展到對單一樣本同時檢測多種代謝物，代謝組學對配子及胚胎發(fā)育潛能的評估取得了初步的進展。發(fā)育潛能好或較差的卵母細胞在代謝譜上存在差異。

但目前的研究樣本量小，各研究結果之間存在爭議。其原因可能是各生殖中心使用了不同類型和體積的培養(yǎng)液，并在取卵及胚胎移植的操作上也存在差異；另外，內膜的準備和激素的使用均可能導致差異。未來我們應使用未采取藥物療法的自然周期和不使用沖洗介質的體外受精患者的卵泡液進行研究。在卵母細胞成熟前后和發(fā)育過程中均存在著代謝差異，做好各個發(fā)育階段的針對性檢測更有意義。胚胎發(fā)育是一個動態(tài)的過程，檢測不同發(fā)育階段培養(yǎng)液中的代謝物差異，納入多參數(shù)建模是一個可行的方向，在早期臨床試驗階段，將代謝譜與形態(tài)學觀察聯(lián)合，應用顯微鏡成像系統(tǒng)及計算機深度學習，如決策樹、人工智能網絡等，找到可以應用于臨床的預測配子及胚胎的代謝標志物，不僅可以更好地選擇優(yōu)質配子及高發(fā)育潛能胚胎，還可以基于個體卵母細胞及優(yōu)質胚胎的選擇預測IVF結局。

綜上所述，生殖領域代謝組學研究尚不足，不同研究之間的結果不一致，針對不孕因素的婦科疾病代謝組分析的研究缺乏。在預測配子及胚胎發(fā)育過程中，多參數(shù)建模是頗具潛能的應用方法。在無創(chuàng)評估的最初階段，形態(tài)觀察和靶向代謝物分析是評估配子及胚胎發(fā)育的互補方法，未來仍需要更大規(guī)模的研究來探索生殖相關體液的代謝組學特征，然后通過大型多中心隨機對照試驗(RCT)進行驗證隨訪，最終實現(xiàn)將代謝物標志物應用于臨床實踐。