詹玫琦， 周珊珊， 萬曉剛

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510450；2.湖北中醫(yī)藥大學(xué)，湖北武漢 430065；3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東廣州 510405）

肥胖已成為2 型糖尿病發(fā)病的危險(xiǎn)因素之一。肥胖導(dǎo)致脂肪組織中脂肪含量增加、游離脂肪酸（NEFA）清除率降低，從而促使機(jī)體循環(huán)中的NEFA濃度升高[1]，長期高水平的NEFA在非脂肪組織（如胰腺、骨骼肌、肝臟）中對(duì)葡萄糖穩(wěn)態(tài)的毒害作用被稱為脂毒性[2]。已有越來越多的研究表明，脂毒性參與2型糖尿病的發(fā)病機(jī)制，并與大血管相關(guān)的糖尿病并發(fā)癥（如冠心病、中風(fēng)等）密切相關(guān)[3]。中藥黃連運(yùn)用于治療糖尿?。ㄏ剩┮延? 400多年歷史[4]，既往臨床研究亦證明了黃連具有改善糖脂代謝紊亂的作用[5-6]?，F(xiàn)代藥理研究報(bào)道，在中藥黃連中已發(fā)現(xiàn)100 多種有效成分[7]，其中，小檗堿[8-9]、黃連堿[10]、黃連多糖[11]等能通過多種信號(hào)通路改善2型糖尿病糖脂代謝紊亂，減輕糖毒性作用，但黃連對(duì)于脂毒性的作用機(jī)制尚不明確。為此，本研究通過建立高脂高糖飼料喂養(yǎng)聯(lián)合腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ）建立2 型糖尿病大鼠模型，研究黃連對(duì)2型糖尿病大鼠胰腺脂毒性的調(diào)控作用，并探討其相關(guān)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激機(jī)制，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)健康雄性Wistar大鼠100只，體質(zhì)量（140 ± 20）g，購于湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，許可證號(hào)：SCXK（鄂）2015-0018。飼養(yǎng)在湖北中醫(yī)藥大學(xué)SPF 級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，室溫為（25±3）℃，相對(duì)濕度為（55±5）℃，12 h 光照周期，自由進(jìn)食飲水。本實(shí)驗(yàn)獲得湖北中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2藥物取黃連藥材2 kg（購于廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科，經(jīng)萬曉剛教授鑒定為正品，產(chǎn)地四川，批號(hào)：160201），加8 倍蒸餾水浸泡時(shí)間達(dá)1 h，煎煮3 次，混勻后用旋蒸儀將煎煮物濃縮成膏狀，再將其冷凍為干燥粉末。1 g 黃連可提取0.23 g黃連藥粉，密封冷藏保存。鹽酸二甲雙胍片，購于中美上海施貴寶制藥有限公司，批號(hào)：H20023370。

1.3試劑STZ（美國Sigma 公司）；NEFA、甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、總低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）等檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）；多聚甲醛、蘇木素染色液（武漢阿斯本生物技術(shù)有限公司）；活化轉(zhuǎn)錄因子4（ATF4）抗體、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78）抗體（上海艾博抗貿(mào)易有限公司）；C/EBP同源蛋白（CHOP）抗體（美國CST公司）。

1.4儀器JPS-5血糖儀和試紙（北京怡成生物電子技術(shù)股份有限公司）；DR-200Bs酶標(biāo)儀（無錫華衛(wèi)德朗儀器有限公司）；TGL16c 臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；TGL-16冷凍離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器）；計(jì)數(shù)儀（中國科技大學(xué)中佳科技實(shí)業(yè)有限公司）；JT-12K 脫水機(jī)、JB-P5 包埋機(jī)、JB-L5冷凍臺(tái)、JK-5攤片機(jī)（武漢俊杰電子有限公司）；RM2016 切片機(jī)（上海徠卡儀器有限公司）；DHG-9123A 烘干箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；CX-21 光學(xué)顯微鏡（深圳奧林巴斯工業(yè)有限公司）。

1.5造模、分組及給藥將100 只Wistar 大鼠隨機(jī)抽取20 只設(shè)為正常組，其余80 只設(shè)為造模組。正常組給予普通飼料喂養(yǎng)10 周。造模組給予高脂高糖飼料（其成分按質(zhì)量分?jǐn)?shù)配比：10%豬油、20%蔗糖、2%膽固醇、1%膽酸鹽、67%普通飼料）喂養(yǎng)10周后，禁食不禁水12 h，一次性給予大鼠腹腔注射STZ 30 mg/kg[12]。造模5 d后尾靜脈采血檢測空腹血糖（FBG），重復(fù)測定3次FBG ≥11.1 mmol/L的大鼠即判斷為糖尿病大鼠。成功造模大鼠共60 只。按血糖值隨機(jī)分為3 組，分別為模型組、黃連組和二甲雙胍組。分組后次日起所有大鼠稱質(zhì)量后給藥。黃連組：根據(jù)《中藥藥理研究方法學(xué)》[13]及相應(yīng)臨床研究用量總結(jié)[14]評(píng)估，60 kg 成人的黃連給藥用量為10 g/d，大鼠的用藥劑量等于標(biāo)準(zhǔn)體質(zhì)量與人使用劑量相乘，經(jīng)過前期預(yù)實(shí)驗(yàn)研究探索，取預(yù)實(shí)驗(yàn)的中劑量，即成人與大鼠的折算系數(shù)為10，按60 kg成人的每日用藥劑量計(jì)算得大鼠黃連粉灌胃劑量為0.4 g·kg-1·d-1；二甲雙胍組：劑量參照具有較好的降糖降脂作用的相應(yīng)研究[15]，給予鹽酸二甲雙胍0.2 g·kg-1·d-1灌胃給藥；模型組和正常組：給予等體積蒸餾水灌胃。每日1 次，灌胃5 周。干預(yù)期間均采用普通飼料喂養(yǎng)，自由進(jìn)食飲水。

1.6標(biāo)本采集首次給藥前空腹12 h，尾靜脈采血測FBG。灌胃期間每周尾尖采血測一次FBG 并稱質(zhì)量。5 周后，空腹12 h，20 g/L 戊巴比妥鈉腹腔麻醉，腹主動(dòng)脈采血制備血清標(biāo)本，靜置2 h，以3 000 r/min 離心15 min，所得血清用于測定血脂，剩余血清-80 ℃冰箱凍存待測。將大鼠仰臥固定，沿腹中線剪開，取出各組大鼠胰腺。

1.7血清生化指標(biāo)檢測將離心所得血清采用全自動(dòng)生化分析儀測定TC、TG、HDL-C、LDL-C、NEFA的濃度，操作方法同說明書。

1.8免疫組織化學(xué)法檢測大鼠胰腺CHOP、ATF4、GRP78蛋白的表達(dá)將胰腺組織切片進(jìn)行脫蠟，置于四乙銨二乙酸鈉（EDTA）緩沖液中修復(fù)，后在室溫下放置于體積分?jǐn)?shù)3%過氧化氫溶液避光孵育。用體積分?jǐn)?shù)5%牛血清白蛋白（BSA）封閉20 min。用一抗（CHOP 1∶50，ATF4 1∶50，GRP78 1∶300 稀釋）50 μL覆蓋組織4 ℃過夜。隔天給予相應(yīng)的二抗50 ～100 μL 37 ℃覆蓋50 min。予50 ～100 μL新鮮配制的3，3’-二氨基聯(lián)苯胺（DAB）溶液顯色，蘇木素復(fù)染，體積分?jǐn)?shù)1%鹽酸酒精分化1 s，自來水沖洗，氨水返藍(lán)，流水沖洗。乙醇脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固，進(jìn)行采圖。使用軟件Image-Pro Plus對(duì)光密度值進(jìn)行分析。

1.9統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。先對(duì)計(jì)量資料進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)，如符合正態(tài)分布，多樣本組間差異的分析方法選用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較，數(shù)據(jù)方差齊者使用LSD法，方差不齊者釆用Dunnett’s T3法；若不符合正態(tài)分布，則采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)Kruskal-Wallis 檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2. 1各組大鼠灌胃前后體質(zhì)量和FBG值的比較表1結(jié)果顯示：治療前，3 組糖尿病大鼠體質(zhì)量均低于正常組（P＜0.05），F(xiàn)BG值均高于正常組（P＜0.05）。治療后，3組糖尿病大鼠體質(zhì)量仍有不同程度的下降。與正常組比較，模型組大鼠體質(zhì)量明顯下降，F(xiàn)BG 值明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，黃連組體質(zhì)量上升，二甲雙胍組體質(zhì)量下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），黃連組、二甲雙胍組FBG 值均下降（P＜0.05）。

表1 各組大鼠治療前后體質(zhì)量、空腹血糖（FBG）值比較Table 1 Comparison of body mass and FBS value in various groups before and after treatment （±s）

表1 各組大鼠治療前后體質(zhì)量、空腹血糖（FBG）值比較Table 1 Comparison of body mass and FBS value in various groups before and after treatment （±s）

①P<0.05，與正常組比較；②P<0.05，與模型組比較

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2. 2各組大鼠治療后血清TG、TC、HDL-C、LDL-C、NEFA水平的比較表2 結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組大鼠血清TG、TC、LDL-C、NEFA 水平明顯上升（P＜0.05），HDL-C 水平明顯下降（P＜0.05），表明模型組大鼠表現(xiàn)為高血脂；與模型組比較，黃連組血清TG、TC、LDL-C、NEFA 水平下降（P＜0.05），HDL-C 水平升高（P＜0.05），二甲雙胍組血清LDL-C、NEFA 水平下降（P＜0.05），HDL-C水平升高（P＜0.05），且2個(gè)治療組之間比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

2.3各組大鼠胰腺組織中GRP78、CHOP、ATF4蛋白表達(dá)水平的比較圖1 ～4 結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組大鼠胰腺組織中GRP78、CHOP、ATF4蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P<0.01）；經(jīng)黃連和二甲雙胍干預(yù)后，大鼠胰腺組織中的GRP78、CHOP、ATF4蛋白表達(dá)水平均明顯下降（P<0.01），且2 個(gè)治療組之間比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

表2 各組大鼠治療后血清TG、TC、HDL-C、LDL-C、NEFA水平的比較Table 2 Comparison of serum TG，TC，HDL-C，LDL-C and NEFA in various groups after treatment（±s，mmol·L-1）

表2 各組大鼠治療后血清TG、TC、HDL-C、LDL-C、NEFA水平的比較Table 2 Comparison of serum TG，TC，HDL-C，LDL-C and NEFA in various groups after treatment（±s，mmol·L-1）

①P<0.05，與正常組比較；②P<0.05，與模型組比較

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圖1 各組大鼠胰腺GRP78的表達(dá)分布（免疫組織化學(xué)法，×200）Figure 1 Comparison of distribution of GRP78 expression in pancreas of rats from various groups（by immunohistochemical method，×200）

圖2 各組大鼠胰腺CHOP的表達(dá)分布（免疫組織化學(xué)法，×200）Figure 2 Comparison of distribution of CHOP expression in pancreas of rats from various groups（by immunohistochemical method，×200）

圖3 各組大鼠胰腺ATF4的表達(dá)分布（免疫組織化學(xué)法，×200）Figure 3 Comparison of distribution of NEFA expression in pancreas of rats from various groups（by immunohistochemical method，×200）

圖4 各組大鼠胰腺GRP78、CHOP、ATF4蛋白表達(dá)水平比較Figure 4 Comparison of expression levels of GRP78，CHOP，ATF4 proteins in pancreas of rats from various groups

3 討論

在現(xiàn)今許多2型糖尿病患者中，多數(shù)都處于超重或肥胖狀態(tài)，經(jīng)?？梢姼哐c高血糖并存[16]。這些患者體內(nèi)長期存在脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)失衡（以TG、LDL-C升高和HDL-C降低為特征）[17]，會(huì)加快動(dòng)脈粥樣硬化的形成，顯著增加糖尿病相關(guān)的心、腦血管風(fēng)險(xiǎn)。本研究采用的高糖高脂飲食合STZ注射誘導(dǎo)的2型糖尿病大鼠模型[18]，模擬了糖脂代謝紊亂的環(huán)境，能有效地構(gòu)建與人發(fā)病時(shí)相同的模型，利于觀察與干預(yù)。祖國醫(yī)學(xué)將2型糖尿病納入“消渴”范疇，中藥黃連在消渴中的運(yùn)用歷史悠久，歷代醫(yī)家皆認(rèn)為黃連是治療消渴之良藥，單用有效?！睹t(yī)別錄》記載黃連“止消渴”，《肘后備急方》用一味黃連蜜丸治消渴尿多，《千金要方》《普濟(jì)方》《外臺(tái)秘要》等均有關(guān)于黃連治療消渴的記載?，F(xiàn)代醫(yī)家中，仝小林[19]、閆鏞[20]等均有使用黃連治療糖尿病的經(jīng)驗(yàn)。根據(jù)最新藥理研究，中藥黃連能有效改善肝臟脂毒性[21]，但對(duì)胰腺脂毒性的研究尚未明確。因此，本研究使用中藥黃連進(jìn)行干預(yù)，探討黃連對(duì)2型糖尿病大鼠胰腺脂毒性的作用。

眾所周知，β細(xì)胞功能障礙是2型糖尿病發(fā)病機(jī)制之一，而糖脂毒性能加重β細(xì)胞功能障礙。加拿大1項(xiàng)為期6年的隨訪研究中[22]顯示，血清NEFA水平與胰島β 細(xì)胞功能之間存在負(fù)相關(guān)性，且NEFA 的血清濃度是預(yù)測β細(xì)胞功能降低的有力指標(biāo)。同時(shí)，許多體外研究也證明，高脂狀態(tài)不僅減少機(jī)體循環(huán)中NEFA的清除率，同時(shí)還釋放更多的NEFA 進(jìn)入循環(huán)中[23]，而高糖狀態(tài)也會(huì)刺激β 細(xì)胞內(nèi)脂解，促使NEFA 直接在胰腺中生成并蓄積，對(duì)胰島β細(xì)胞產(chǎn)生脂毒性作用，加重胰島β細(xì)胞功能障礙[24]。本研究通過構(gòu)建以高糖高脂飲食誘導(dǎo)的2 型糖尿病大鼠模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型組的血清FBG、TG、TC、LDL-C 和NEFA 水平顯著高于正常組，HDL-C 水平低于正常組，而二甲雙胍組血清中FBG、TG、TC、LDL-C 和NEFA 水平較模型組明顯下降，HDL-C 水平較模型組升高，以上結(jié)果表明經(jīng)高糖高脂飲食誘導(dǎo)的2型糖尿病大鼠存在血糖和血脂代謝紊亂，且模型組NEFA水平較正常組上升，也證實(shí)了NEFA 引起的脂毒性對(duì)2型糖尿病發(fā)病機(jī)制的影響。而應(yīng)用中藥黃連灌胃后，糖尿病大鼠血清FBG、TG、TC、LDL-C和NEFA水平顯著下降，HDL-C 水平顯著升高，這提示黃連能夠有效地改善2型糖尿病大鼠血糖及血脂水平，并降低循環(huán)中NEFA水平，減輕脂毒性的作用。

目前，脂毒性作用影響2型糖尿病加劇發(fā)生發(fā)展的機(jī)制較為復(fù)雜，主要與炎癥反應(yīng)[25]、線粒體功能障礙[26]、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[25]和氧化應(yīng)激[27]相關(guān)。越來越多的證據(jù)表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在2型糖尿病的發(fā)病機(jī)制中占據(jù)重要位置，并與糖脂毒性有關(guān)[28]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在脂質(zhì)生物合成以及分泌蛋白的合成和折疊中起著核心作用。正常生理狀態(tài)下的胰島β細(xì)胞通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)促使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)折疊合成胰島素原，但在糖脂毒性的激發(fā)下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中容易積累未折疊或者錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)，這種未折疊的蛋白反應(yīng)（UPR）即是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中的一種表現(xiàn)。UPR有3條經(jīng)典信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，研究較多的是蛋白激酶RNA樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（PERK）通路。GRP78是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的分子伴侶，是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活的標(biāo)志物[29]。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)出現(xiàn)應(yīng)激反應(yīng)時(shí)，PERK蛋白磷酸化，介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子ATF4 翻譯增加，當(dāng)ATF4 進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，激活下游相關(guān)因子，促使CHOP蛋白的表達(dá)[30]，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞走向凋亡進(jìn)程。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠胰腺中GRP78、CHOP、ATF4 蛋白的表達(dá)水平較正常組顯著上升，這提示2型糖尿病大鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)已被激活；而經(jīng)黃連灌胃后的大鼠胰腺GRP78、CHOP、ATF4 蛋白的表達(dá)水平較模型組均明顯下降，表明黃連組可改善內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)。因此，推測中藥黃連對(duì)胰腺脂毒性的調(diào)控作用可能通過改善內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激機(jī)制減少NEFA在胰腺細(xì)胞中的堆積來實(shí)現(xiàn)。

綜上所述，應(yīng)用中藥黃連進(jìn)行干預(yù)后可有效改善高糖高脂飲食誘導(dǎo)的2型糖尿病大鼠糖脂代謝紊亂，減輕胰腺脂毒性程度，且其作用機(jī)制可能與減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，進(jìn)一步減少胰島細(xì)胞走向凋亡有關(guān)。本研究的意義在于初步探討了中藥黃連對(duì)高糖高脂飲食誘導(dǎo)的2型糖尿病大鼠胰腺脂毒性的調(diào)控作用及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，這為黃連的臨床應(yīng)用提供良好的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。但本研究仍存在一定的不足，今后有待深入分析內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡途徑中的ASK1/JNK 及Caspase-12的激活途徑、就中藥黃連中具體哪一有效部分對(duì)血脂有切實(shí)改善作用進(jìn)行有效驗(yàn)證、就中藥黃連的有效成分如何進(jìn)入細(xì)胞影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路進(jìn)行研究，等等。