代 巖，景世鈺，吳杰軍，陳景才*，趙軟金*

（1.河南開懷藥業(yè)有限公司，河南 鄭州 450000；2.美國佛羅里達(dá)Sarasota中醫(yī)藥中心，河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450000）

隨著社會的發(fā)展，越來越多的人意識到不治已病治未病是健康管理之導(dǎo)向?！八幨惩础薄搬t(yī)食同源”等理念逐漸成為人們信奉的養(yǎng)生信條，并發(fā)展成為自成體系的食療養(yǎng)生文化[1]。植物飲料是指以植物或植物提取物，添加或不添加其他食品原輔料和食品添加劑，經(jīng)加工或發(fā)酵制成的飲料，植物飲料中最具代表性的是涼茶飲料[2]。目前植物功能性飲料還沒有統(tǒng)一的定義，這里主要強調(diào)的是植物來源的功能性飲料，通常來說，是以含有某種對人體有益的具有特殊功效成分的植物為原料，經(jīng)過加工、科學(xué)配比、專業(yè)品評制成的適合大眾需要的植物飲料產(chǎn)品[3]。以藥食同源為原料制成的產(chǎn)品的一大優(yōu)勢是其既可加工成食品供日常食用，起到食療的功效，又可以制成藥供臨床使用。

病毒是一類由核酸（DNA或RNA）與蛋白質(zhì)構(gòu)成的非細(xì)胞結(jié)構(gòu)微生物。病毒感染是指病毒通過多種途徑侵入機體，并在易感的宿主細(xì)胞中增殖的過程，其實質(zhì)是病毒與機體、病毒與易感細(xì)胞相互作用的過程。對人體致病病毒能夠侵入人體細(xì)胞并利用宿主細(xì)胞中的酶、細(xì)胞器及營養(yǎng)物質(zhì)結(jié)合自身遺傳物質(zhì)達(dá)到自我增殖的目的，最終將導(dǎo)致宿主細(xì)胞死亡，是一類嚴(yán)重危害人體生命健康的病原體[4]。如傳染性極強的艾滋病病毒、埃博拉病毒、SARS病毒[5-6]以及2020年初暴發(fā)的病毒性傳染病[7-10]等。然而，目前對大多數(shù)病毒感染缺乏特效藥物治療。

本研究選用藥食同源中藥材金銀花、菊花、菊苣、蒲公英、代代花、甘草、砂仁、淡竹葉為原料，通過優(yōu)化的配比及工藝，制備成無菌上清液KH-0004，然后利用體外細(xì)胞學(xué)實驗測試其抗冠狀病毒、呼吸道合胞病毒、單純皰疹病毒、乙型肝炎病毒的活性，并評價其急性經(jīng)口毒性[11]、遺傳毒性[12-14]、28天經(jīng)口毒性[15]。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

電子天平（上海容威儀器有限公司），實驗室多功能提取機組（山東精誠醫(yī)藥裝備有限公司），超純水機（四川優(yōu)普超純科技有限公司），CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher公司），顯微鏡（日本Olympus公司），微孔板快速振蕩器（江蘇省海門市其林貝爾儀器制造有限公司），多標(biāo)記讀板儀（美國Perkin Elmer公司Envision plate reader），熒光定量PCR儀（美國ABI公司），真空泵（美國INTEGRA Biosciences公司），12道移液器，單道移液器（美國Eppendorf公司）。

1.2 試藥

雌、雄ICR小鼠：購自浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心。

SPF級SD大鼠：上海杰思捷實驗動物有限公司。

組氨酸營養(yǎng)缺陷型鼠傷寒沙門氏菌TA1535，TA97，TA98，TA100和TA102：購自浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院。

HepG2.2.15表達(dá)HBV病毒的人肝細(xì)胞[16-17]：購自上海復(fù)祥生物科技有限公司；Vero細(xì)胞，HEp2細(xì)胞ATCC CCL-23，人肝癌細(xì)胞Huh7細(xì)胞：購自美國ATCC。

金銀花、菊花、菊苣、蒲公英、代代花、甘草、砂仁、淡竹葉：購自河北省安國市一方藥業(yè)有限公司。

DMEM/F12，臺盼藍(lán)，0.4%（w/v），DMEM：購自美國G i b c o。胎牛血清（F B S）：購自法國Biosera。1XDPBS，0.25% Trypsin-EDTA，青霉素-鏈霉素雙抗（100×P/S），非必須氨基酸（NEAA），丙酮酸鈉（100mM）：購自美國Invitrogen。二甲基亞砜（DMSO），環(huán)磷酰胺：購自美國Sigma。CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay Kit：購自美國Promega。TB GreenTM Premix Ex TaqTM (TIi RNaseH Plus)：購自日本Takara。利巴韋林注射液：購自天津金耀集團湖北天藥藥業(yè)股份有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 KH-0004的制備

稱取金銀花1～30份、菊花1～30份、蒲公英1～30份、菊苣1～30份、代代花1～30份、甘草1～30份、砂仁1 ～3 0 份、淡竹葉1 ～3 0 份，先將金銀花、菊花、蒲公英、菊苣、代代花、甘草、砂仁、淡竹葉混合在一起，加入10～250倍純凈水浸泡30～60 min，然后煮沸25～60 min，待澄清冷卻到室溫（23±2?C），過濾、滅菌，即得KH-0004。

2.2 KH-0004抗單純皰疹病毒（HSV-1, HSV-2）活性檢測

2.2.1 細(xì)胞毒實驗：Vero 細(xì)胞用完全培養(yǎng)基DMEM（10% FBS+1% P/S）培養(yǎng)并按1:4維持傳代。實驗前一天Vero細(xì)胞加入96-孔細(xì)胞培養(yǎng)板10000細(xì)胞/孔。實驗當(dāng)天，棄去細(xì)胞培養(yǎng)板里的培養(yǎng)基，加入100 μL/孔配制好的待測樣品。加入100 μL/孔含有2% FBS的檢測培養(yǎng)基。將細(xì)胞培養(yǎng)板放入37?C，5% CO2，90%濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4天后用CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay Kit檢測細(xì)胞活性[18]。細(xì)胞毒實驗結(jié)果由至半數(shù)細(xì)胞死亡濃度（CC50）表示，結(jié)果見表1。

2.2.2 抗H S V-1 實驗：Ve r o 細(xì)胞用完全培養(yǎng)基DMEM（10% FBS+1% P/S）培養(yǎng)并按1:4維持傳代。實驗前一天Vero細(xì)胞加入96-孔細(xì)胞培養(yǎng)板10000細(xì)胞/孔。實驗當(dāng)天，棄去細(xì)胞培養(yǎng)板里的培養(yǎng)基，加入100 μL/孔配制好的化合物及待測樣品。冰上融化HSV-1病毒儲存液，用含有2% FBS的檢測培養(yǎng)基配制成大約10000倍的病毒稀釋液，充分混勻。細(xì)胞檢測板每孔加入100 μL病毒稀釋液，共200 μL每孔，20000倍的病毒稀釋液（MOI=0.004）。HEP（100%作用）加入200 μL每孔檢測培養(yǎng)基，不加病毒，ZPE（0%作用）加入20000倍的病毒稀釋液200 μL每孔。將細(xì)胞培養(yǎng)板放入37?C，5% CO2，90%濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4天后用CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay Kit檢測細(xì)胞活性?？共《緦嶒灲Y(jié)果由至半數(shù)病毒生長抑制濃度（EC50）表示，結(jié)果見表1。結(jié)果表明，KH-0004具有較強的抗HSV-1活性，選擇指數(shù)SI=3.3。

2.2.3 抗HSV-2實驗：實驗過程同2.2.2抗HSV-1實驗步驟，冰上融化HSV-2病毒儲存液，用含有2% FBS的檢測培養(yǎng)基配制成大約1 0 0 0 倍的病毒稀釋液充分混勻，病毒稀釋液加入細(xì)胞檢測板后最終為2 0 0 0 倍稀釋（MOI=0.007）?？共《緦嶒灲Y(jié)果由至半數(shù)病毒生長抑制濃度（EC50）表示，結(jié)果見表1。結(jié)果表明，KH-0004具有很強的抗HSV-2活性，選擇指數(shù)SI=20。

表1 KH-0004抗單純皰疹病毒實驗結(jié)果

2.3 KH-0004抗乙型肝炎病毒（HBV）活性檢測

2.3.1 細(xì)胞毒實驗：96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中鋪HepG2.2.15細(xì)胞20000個/孔，每孔200 μL細(xì)胞培養(yǎng)基。在37℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天至細(xì)胞長至滿孔。在測試第0天，棄去細(xì)胞培養(yǎng)板里的培養(yǎng)基加入100 μL/孔配制好的化合物。加入100 μL/孔含有2% FBS的檢測培養(yǎng)基，最終200 μL每孔，化合物最高檢測濃度2倍稀釋。培養(yǎng)基對照孔作為ZPE孔加入200 μL檢測培養(yǎng)基。將細(xì)胞培養(yǎng)板放入37?C，5% CO2，90%濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4天后用CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay Kit檢測細(xì)胞活性。細(xì)胞毒實驗結(jié)果由至半數(shù)細(xì)胞死亡濃度（CC50）表示，結(jié)果見表2。

2.3.2 抗乙肝病毒實驗：9 6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中鋪HepG2.2.15細(xì)胞20000個/孔，每孔200 μl細(xì)胞培養(yǎng)基。在37?C，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天至細(xì)胞長至滿孔。在測試第0天，棄去細(xì)胞培養(yǎng)板里的培養(yǎng)基加入100 μL/孔配制好的化合物。再加入100 μL每孔含有2% FBS的檢測培養(yǎng)基，最終200 μL每孔，化合物最高檢測濃度2倍稀釋。ZPE（0%作用）孔加入200 μL檢測培養(yǎng)基，HPE（100%作用）孔，每孔加入200 μL含有1 μL 0.2 mM的陽性對照化合物的檢測培養(yǎng)基。96孔細(xì)胞測試板在37?C CO2培養(yǎng)箱中孵育7天，每隔一天（第2，4，6天）換一次液（2% FBS），并加入新鮮配置的樣品。在第7天每孔取150 μL上清作病毒DNA的qPCR檢測。結(jié)果見表2。結(jié)果表明，KH-0004具有較強的抗乙型肝炎病毒活性，選擇指數(shù)SI=4.95。

表2 KH-0004抗乙型肝炎病毒實驗結(jié)果

2.3.3 qPCR方法檢測病毒基因組DNA：qPCR引物如表3。按以下成分配制qPCR反應(yīng)體系：TB Premix Ex TaqTM II（2×）5 μL，HBV-For-202（10 μM）0.4 μL，HBVRev-315（10 μM）0.4 μL，ROX Reference Dye（50×）0.2μL，病毒上清1 μL，加水至10 μL。按以下條件設(shè)置ABI ViiA7 qPCR儀：階段1：Reps：95?C，30秒，一個循環(huán)；階段2：Reps：95?C，5秒和60?C，34秒，40個循環(huán)。

表3 HBV引物序列

2.4 KH-0004抗呼吸道合胞病毒（RSV）活性檢測

2.4.1 細(xì)胞毒實驗：HEp2細(xì)胞用完全培養(yǎng)基DMEM/F12（10% FBS+1% P/S）培養(yǎng)并按1:4維持傳代。實驗前一天HEp2細(xì)胞加入96-孔細(xì)胞培養(yǎng)板5000細(xì)胞/孔。實驗當(dāng)天，棄去細(xì)胞培養(yǎng)板里的培養(yǎng)基，加入100 μL/孔配制好的化合物。加入100 μL每孔含有2% FBS的檢測培養(yǎng)基，最終200μL每孔，化合物最高檢測濃度2倍稀釋。ZPE孔加入200 μL每孔檢測培養(yǎng)基。將細(xì)胞培養(yǎng)板放入37?C，5% CO2，90%濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4天后用Promega CellTiter Cell Viability kit檢測細(xì)胞活性。細(xì)胞毒實驗結(jié)果由至半數(shù)細(xì)胞死亡濃度（CC50）表示，結(jié)果見表4。

2.4.2 抗呼吸道合胞病毒實驗：HEp2細(xì)胞用完全培養(yǎng)基DMEM/F12（10% FBS+1% P/S）培養(yǎng)并按1:4維持傳代。實驗前一天HEp2細(xì)胞加入96-孔細(xì)胞培養(yǎng)板5000細(xì)胞/孔。實驗當(dāng)天，棄去細(xì)胞培養(yǎng)板里的培養(yǎng)基，加入100 μL/孔配制好的化合物。冰上融化RSV病毒儲存液，用含有2% FBS的檢測培養(yǎng)基配制成大約4000倍的病毒稀釋液，充分混勻。細(xì)胞檢測板每孔加入100 μL病毒稀釋液，共200 μL每孔，最終病毒稀釋8000倍（MOI=0.1）。HEP（100 %作用）加入200μL每孔檢測培養(yǎng)基，不加病毒，ZPE（0%作用）加入8000倍的病毒稀釋液200 μL每孔。將細(xì)胞培養(yǎng)板放入37?C，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天后用CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay Kit檢測細(xì)胞活性?？共《緦嶒灲Y(jié)果由至半數(shù)病毒生長抑制濃度（EC50）表示，結(jié)果見表4。結(jié)果表明，KH-0004具有很強的抗RSV活性，選擇指數(shù)SI=21.7。

表4 KH-0004抗乙型肝炎病毒實驗結(jié)果

2.5 KH-0004抗冠狀病毒活性檢測

實驗在傳代Huh7細(xì)胞中進(jìn)行，細(xì)胞以1.5×104個/孔接種于96孔板中，過夜培養(yǎng)后將100 TCID50 HCoV-229E病毒液感染96孔板內(nèi)細(xì)胞，待測樣品用培養(yǎng)液液稀釋，于感染同時給藥進(jìn)行測定，待測樣品以三倍稀釋8個劑量的樣品進(jìn)行實驗，每個劑量設(shè)2個平行孔，待病毒對照組病變達(dá)4+號時觀察結(jié)果，記錄并用Reed-Muench法計算待測樣品對病毒的半數(shù)抑制濃度及選擇指數(shù)（SI=EC50/CC50）。結(jié)果見表5。結(jié)果表明，KH-0004具有一定的抗冠狀病毒活性，選擇指數(shù)SI＞1.3。

表5 KH-0004抗冠狀病毒實驗結(jié)果

2.6 KH-0004急性經(jīng)口毒性試驗

20只ICR小鼠，雌雄各半，采用最大限量法，灌胃劑量為原液10031.4 mg/kg，試驗前禁食4小時，試驗開始后，對動物用經(jīng)口灌胃法一次染毒，染毒后繼續(xù)禁食1小時，觀察并記錄染毒存活動物并進(jìn)行解剖。結(jié)果表明，實驗動物在染毒14天內(nèi)未見任何中毒癥狀和中毒死亡；雌雄動物的平均體重重未見異常。實驗觀察結(jié)束，對受試動物進(jìn)行大體解剖也未見異常變化。LD50>10031.4 mg/kg。按照《GB15193.3-2014-食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 急性經(jīng)口毒性試驗》標(biāo)準(zhǔn)，該樣品對IC小鼠的急性經(jīng)口LD50>5000 mg/kg。根據(jù)急性毒性分級，屬于實際無毒級。檢測結(jié)果來自寧波海關(guān)技術(shù)中心。

2.7 KH-0004遺傳毒性試驗

2.7.1 細(xì)菌回復(fù)突變試驗：實驗中所用到的菌株為組氨酸營養(yǎng)缺陷型鼠傷寒沙門氏菌TA1535，TA97，TA98，TA100和TA102。實驗劑量設(shè)置：分別在加和不加S9的情況下選擇0.05 mg/皿，0.16 mg/皿，0.50 mg/皿，1.58 mg/皿共5個劑量為正式試驗劑量，選擇0.01 mg/皿，0.04 mg/皿，0.20 mg/皿，1.00 mg/皿，5.00 mg/皿共5個劑量為驗證試驗劑量，同時空白對照組，陰性對照組，陽性對照組。菌株增菌后加入受試品、增菌液、S9混合液，涂布均勻，37?C培養(yǎng)48小時，計算每皿的回變菌落數(shù)。結(jié)果表明，受試物各劑量組回變菌落數(shù)均未超過未處理對照菌落數(shù)2倍，不同劑量組間無劑量-反應(yīng)關(guān)系。經(jīng)驗證試驗確證受試物結(jié)果依然為陰性。檢測結(jié)果來自寧波海關(guān)技術(shù)中心。

2.7.2 哺乳動物紅細(xì)胞微核試驗：實驗動物為ICR清潔級小鼠，隨機分為5組，每組10只，雌雄各半，經(jīng)口灌胃給藥，灌胃體積為20 ml/kg體重。三組受試樣品組的濃度分別為2500 mg/kg體重、5000 mg/kg體重、10000 mg/kg體重，陰性對照組為純水，陽性對照組為40 mg/kg體重的環(huán)磷酰胺。實驗采用30小時受試物法，兩次給受試物間隔24小時，第2次給藥6小時后頸脫臼處死小鼠，去股骨，以小牛血清清洗骨腔，制成細(xì)胞懸液，涂片、染色、鏡檢。結(jié)果表明，各受試樣品組的嗜多染紅細(xì)胞微核率與陰性對照組比無顯著性差異（P＞0.05），在劑量≦10000 mg/kg體重的情況下，該樣品的微核試驗為陰性。檢測結(jié)果來自寧波海關(guān)技術(shù)中心。

2.7.3 哺乳動物骨髓細(xì)胞染色體畸變試驗：實驗動物為ICR清潔級小鼠，隨機分為3組，每組10只，雌雄各半，經(jīng)口灌胃給藥，灌胃體積為20 ml/kg體重。受試樣品組的濃度分別為10000 mg/kg體重，陰性對照組為純水，陽性對照組為40 mg/kg體重的環(huán)磷酰胺。實驗采用兩次給與受試物，每次間隔24小時，于末次給與受試物后18小時處死動物采樣。處死動物前4小時，按4 mg/kg體重腹腔注射秋水仙素，頸脫臼處死小鼠，取骨髓細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，涂片、染色、鏡檢。結(jié)果表明，受試樣品組的染色體結(jié)構(gòu)畸變細(xì)胞百分率與陰性對照組比無顯著性差異（P＞0.05），在劑量≦10000 mg/kg體重的情況下，該樣品的哺乳動物骨髓細(xì)胞染色體畸變試驗為陰性。檢測結(jié)果來自寧波海關(guān)技術(shù)中心。

2.8 KH-0004 28天經(jīng)口毒性試驗

根據(jù)GB 15193.22-2014食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)28天經(jīng)口毒性試驗規(guī)范，及KH-0004人體推薦攝入量1000 ml/天，進(jìn)行KH-0004 SD大鼠28天經(jīng)口毒性試驗，受試樣品為10倍濃縮液。試驗選擇5周齡健康SPF級SD大鼠（雌雄均未交配過），試驗初始雄性SD大鼠體重（83.4±3.6）g，雌性SD大鼠體重（85.1±3.5）g。試驗設(shè)置4個劑量組，分別為5 g/kg·BW、10 g/kg·BW和20 g/kg·BW劑量組，分別相當(dāng)于人體攝入的30倍、60倍和120倍，同時設(shè)立溶媒對照組（給予最大灌胃容量溶媒），每個試驗組20只SD大鼠，雌雄各半，灌胃受試樣品28天，灌胃容量20 ml/kg·BW；同時設(shè)置恢復(fù)期，即對照組和20 g/kg·BW劑量組（每組5雌5雄）在染毒28天后進(jìn)行14天恢復(fù)期觀察。染毒期限：28天，染毒頻率：1次/天，染毒途徑：灌胃，灌胃容量：2.0 ml/100g·BW。

結(jié)果表明，未見受試樣品對SD大鼠存在潛在的毒性效應(yīng)，未見受試樣品對SD大鼠存在明顯的靶器官毒性；14天恢復(fù)期結(jié)束未見各項檢測指標(biāo)變化；受試樣品對SD大鼠28天經(jīng)口毒性試驗的未觀察到有害作用劑量（NOAEL）為大于20 g/kg·BW。檢測結(jié)果來自寧波海關(guān)技術(shù)中心。

3 討 論

由病毒感染引起的疾病長期以來一直困擾著人類，然而由于其結(jié)構(gòu)的特殊性，對于由病毒引起的疾病至今仍缺乏特異性的有效治療藥物。因此，面對威脅著人類生命健康的病毒，我們迫切地需要研制出療效確切、安全性較高的藥物。相比西藥，中藥具有許多優(yōu)勢，比如毒性較低，藥性溫和，材料豐富，價格低廉等[19]。因此，越來越多的人將抗病毒藥物的研究投向傳統(tǒng)的中草藥。

本研究以八種中草藥為原料，研制出了一款口感適宜，具有體外抗HSV-1，HSV-2，HBV，RSV，HCoVOC43，HCoV-229E作用的安全的功能性植物飲料，為進(jìn)一步研究抗病毒藥物提供依據(jù)，有望成為廣譜抗病毒的新產(chǎn)品。組方中金銀花、菊花、菊苣、蒲公英、代代花、淡竹葉氣味辛涼，甘淡，清熱解毒，砂仁和甘草溫通陽氣，調(diào)和諸藥，制約了清熱藥的寒涼，不傷胃氣，可以長期服用。既有五味消毒飲[20]的方義，又融入了封髓丹[21]的精神。配方和選藥完全符合中醫(yī)學(xué)的藥學(xué)理論。

中草藥是我國的瑰寶，社會的發(fā)展促使人們對疾病的認(rèn)識，從治療轉(zhuǎn)換為預(yù)防，中藥治療病毒感染性疾病也已有了數(shù)千年的經(jīng)驗，以藥食同源中草藥為原料加工制得食品以用于對疾病的預(yù)防及治療，值得我們進(jìn)一步的深入探索，從而挖掘出更多有效的抗病毒的食品或藥物。

感謝為本研究提供研發(fā)外包服務(wù)的單位：上海輝源生物科技有限公司提供抗單純皰疹病毒實驗、抗乙型肝炎病毒實驗、抗呼吸道合胞病毒實驗；中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)生技所提供抗冠狀病毒實驗；浙江省寧波海關(guān)技術(shù)中心提供急性經(jīng)口毒性試驗、三項遺傳毒性試驗、28天經(jīng)口毒性實驗。