葛 晨，朱征海，張曉鑫，程 杰，周 英，許紫鵬，張銀超*

（1.無錫市錫山人民醫(yī)院普外科，江蘇 無錫 214000；2.無錫市人民醫(yī)院普外科，江蘇 無錫 214000）

胃癌（gastric cancer，GC）是全球最常見的惡性腫瘤之一，我國是胃癌高發(fā)的國家[1-2]。胃癌早期往往無癥狀或僅有輕微癥狀，容易被忽視，當(dāng)臨床癥狀典型時(shí)，多已屬中晚期，錯(cuò)過了最佳的治療機(jī)會(huì)。盡管近年來，手術(shù)方式、放化療、靶向治療以免疫治療等治療方式得到飛速發(fā)展，胃癌患者5年生存率仍只有40%[3]。 因此，尋找早期診斷的生物標(biāo)志物、預(yù)后判斷指標(biāo)以及藥物治療的有效靶點(diǎn)尤為重要。

中心體相關(guān)蛋白激酶2（NIMA-related expressed kinase 2, NEK2）是NEKs家族的一員，是一種絲氨酸-色氨酸激酶，與細(xì)胞周期G2/M期的中心體分裂密切相關(guān)[4-5]。研究表明，NEK2不僅能通過調(diào)節(jié)中心體間接調(diào)控細(xì)胞分裂，還能通過作用于染色質(zhì)直接參與細(xì)胞分裂[6- 7]。NEK2的異常表達(dá)導(dǎo)致中心體分離障礙，中心體異常和非整倍體的出現(xiàn)，使細(xì)胞惡化，最終導(dǎo)致腫瘤發(fā)生[8]。而且，NEK2過表達(dá)能激活多個(gè)腫瘤相關(guān)信號(hào)通路和ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，從而促進(jìn)腫瘤增殖、侵襲和耐藥[9]。已有研究發(fā)現(xiàn)NEK2在多種腫瘤中異常表達(dá)，如：乳腺癌、結(jié)腸癌、肝癌、前列腺癌等。NEK2異常表達(dá)與腫瘤分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及患者不良預(yù)后密切相關(guān)。目前NEK2在胃癌組織中的表達(dá)情況鮮有報(bào)道。

本研究旨在通過免疫組化方法明確NEK2在胃癌組織中的表達(dá)情況，探討NEK2表達(dá)與臨床病理特征以及預(yù)后的關(guān)系。本研究的開展為NEK2基因功能及胃癌研究提供思路。

1 資料和方法

1.1 臨床資料

收集無錫市錫山人民醫(yī)院2006年至2009年間76例胃癌患者的癌及癌旁組織，并且具有完備的病理資料和隨訪信息。所有標(biāo)本均經(jīng)病理診斷為胃癌，同時(shí)患者術(shù)前未接受任何放化療，術(shù)后根據(jù)診療規(guī)范進(jìn)行化療。樣本收集前均通過無錫市錫山人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)及患者知情同意。術(shù)后每三個(gè)月隨訪一次，隨訪時(shí)間為0-101月，對(duì)在本院治療和復(fù)查的病人進(jìn)行詳細(xì)登記，其余病人進(jìn)行電話隨訪。

1.2 主要試劑

Envision免疫組織化學(xué)檢測試劑盒購自上海今邁生物科技有限公司，NEK2兔抗人單克隆抗體購自上海信裕科技有限公司，DAB酶底物顯色試劑盒購自福建邁新有限公司，磷酸鹽緩沖液（PBS） 、牛血清白蛋白（BSA）、3 %H202溶液 等購自碧云天生物科技有限公司。

1.3 免疫組化檢測

常規(guī)石蠟切片二甲苯脫蠟， 梯度濃度酒精脫水。用3%H2O2200ml浸泡10min，抗原修復(fù)液修復(fù)2次，滴加5% BSA封閉液，室溫放置35min。滴加適量的NEK2一抗，4℃過夜。用PBS洗4次，滴加二抗，37℃下放置35min，用PBS洗滌4次。根據(jù)試劑盒說明，配制顯色液。顯色完后水洗，滴加蘇木素染液，浸染2min，然后水洗，無水乙醇脫水，二甲苯中透明。

1.4 結(jié)果判讀

免疫組化的結(jié)果根據(jù)染色強(qiáng)度和表達(dá)比例來綜合判定。本研究由兩位專業(yè)的病理醫(yī)師來判讀，當(dāng)出現(xiàn)結(jié)果不一致時(shí)經(jīng)商議決定。表達(dá)強(qiáng)度：每張切片上觀察5個(gè)高倍視野（×400），無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。積分綜合計(jì)量：每種陽性強(qiáng)度對(duì)應(yīng)的值×該強(qiáng)度細(xì)胞的百分比，即1×弱陽性百分比+2×中等陽性百分比+3×強(qiáng)陽性百分比。按照積分綜合計(jì)量中位值分為高表達(dá)組和低表達(dá)組。

1.5 數(shù)據(jù)下載

登錄GEO數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/），在GEO數(shù)據(jù)集中搜索并下載GSE84437的芯片數(shù)據(jù)及對(duì)應(yīng)的臨床樣本信息。根據(jù)患者的樣本編號(hào)、隨訪時(shí)間及生存狀態(tài)是否完成，共獲得434位胃癌患者的數(shù)據(jù)。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件處理分析數(shù)據(jù)。配對(duì)差值非參數(shù)檢驗(yàn)（Wilcoxon符號(hào)秩和檢驗(yàn)）比較胃癌組織和癌旁組織中NEK2蛋白的表達(dá)差異；用四格表卡方檢驗(yàn)以及Fisher精確檢驗(yàn)分析NEK2蛋白表達(dá)與臨床指標(biāo)的關(guān)系；用Kaplan-Meier法和Logrank檢驗(yàn)分析各變量與預(yù)后的關(guān)系，應(yīng)用多因素COX比例風(fēng)險(xiǎn)模型評(píng)估對(duì)生存影響的獨(dú)立因素。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 NEK2蛋白在胃癌組織及癌旁組織中的表達(dá)

在胃癌及癌旁組織中，NEK2蛋白主要在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，呈棕黃色（圖1）。通過秩和檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，NEK2蛋白在胃癌組織中的表達(dá)明顯低于癌旁組織（Z=-4.333，P=0.000，圖2）。根據(jù)積分綜合計(jì)量中位值，胃癌組織中NEK2蛋白高表達(dá)組37例，低表達(dá)組39例（表1）。

表1 NEK2表達(dá)與胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系

2.2 NEK2表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系

從表1我們看出，NEK2的表達(dá)與性別、年齡，浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、M分期、TNM分期、腫瘤直徑以及腫瘤位置無關(guān)（表1）。有趣的是，我們通過亞組分析發(fā)現(xiàn)，在非胃竇部胃癌中，NEK2低表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.041）、TNM分期（P=0.004）呈負(fù)相關(guān)，但是與性別、年齡，浸潤深度、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、腫瘤直徑無相關(guān)性（表2）。

2.3 NEK2表達(dá)與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系

我們采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，并采用Logrank檢驗(yàn)分析來研究NEK2表達(dá)與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系。NEK2低表達(dá)組總生存率明顯低于NEK2高表達(dá)，且結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.022，圖3）。為了進(jìn)一步驗(yàn)證NEK2表達(dá)在胃癌患者預(yù)后的影響，我們從GEO數(shù)據(jù)庫下載GSE84437數(shù)據(jù)，并采用Kaplan-Meier及Log-rank檢驗(yàn)進(jìn)行，再次證實(shí)NEK2低表達(dá)組較NEK2高表達(dá)組的總生存率低（P=0.027，圖 4）。而且我們對(duì)影響腫瘤預(yù)后的因素進(jìn)行COX多因素分析，結(jié)果顯示腫瘤直徑（P=0.033）以及N E K 2 表達(dá)（P=0.0 4 6）是胃癌預(yù)后的獨(dú)立影響因素（表3）。

表2 NEK2表達(dá)與非胃竇部胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系

表3 單因素與多因素Cox風(fēng)險(xiǎn)回歸分析對(duì)胃癌患者總體生存獨(dú)立因子的檢驗(yàn)

3 討 論

胃癌是全球最常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重危害人類健康。目前針對(duì)胃癌早期診斷、預(yù)后判斷及靶向治療方面開展了大量的研究，但臨床轉(zhuǎn)化的標(biāo)志物少之又少，因此，亟需進(jìn)一步研究。本研究系統(tǒng)地分析了NEK2在76例胃癌患者組織中的表達(dá)情況，探討了NEK2的表達(dá)與臨床病理特征以及預(yù)后的關(guān)系。已有研究表明，NEK2在多種腫瘤中呈高表達(dá)，而且NEK2高表達(dá)提示不良預(yù)后。但是，在我們的研究中發(fā)現(xiàn)，NEK2在胃癌組織較癌旁組織中低表達(dá)（P=0.000）。同時(shí)，在非胃竇部胃癌中，NEK2的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.041）、TNM分期（P=0.004）呈負(fù)相關(guān)。此外，Kaplan-Meier法分析結(jié)果顯示，NEK2低表達(dá)預(yù)示不良預(yù)后（P=0.022），而且這一結(jié)果在GSE84437（P=0.027）中得到進(jìn)一步證實(shí)。COX多因素分析結(jié)果提示，腫瘤直徑（P=0.033）以及NEK2表達(dá)（P=0.046）是預(yù)后良好的獨(dú)立影響因素。

NEK2是細(xì)胞周期G2期的關(guān)鍵蛋白，調(diào)控染色質(zhì)的分離。細(xì)胞周期紊亂是腫瘤細(xì)胞的特征之一，異常的細(xì)胞周期促進(jìn)腫瘤的增殖[10- 11]。異常表達(dá)的NKE2可引起中心體不穩(wěn)定及非整倍體的出現(xiàn)，誘發(fā)細(xì)胞癌變。研究表明，NEK2通過MAPK信號(hào)通路調(diào)控肝癌細(xì)胞增殖、凋亡[12]。NEK2過表達(dá)促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖，下調(diào)NEK2表達(dá)影響中心體分裂過程，導(dǎo)致非整倍體的出現(xiàn)，同時(shí)增加半胱天冬酶3切割，增加抑癌蛋白R(shí)b的活性，降低組蛋白H3的活性，抑制腫瘤生長[13]?？辜?xì)胞凋亡是NEK2介導(dǎo)的細(xì)胞周期紊亂帶來的另一個(gè)的結(jié)果。在骨髓瘤體內(nèi)和體外模型中發(fā)現(xiàn)，NEK2抑制導(dǎo)致切割的腺苷二磷酸核糖聚合酶表達(dá)增高，同時(shí)活化半胱天冬酶3/8/9[14]。這些結(jié)果提示NEK2有可能通過影響細(xì)胞周期來調(diào)控胃癌的發(fā)生、發(fā)展。

NEK2的表達(dá)與腫瘤轉(zhuǎn)移以及耐藥亦密切相關(guān)。NEK2過表達(dá)能上調(diào)β調(diào)連接蛋白的表達(dá)以及核內(nèi)蓄積，激活β活連接蛋白信號(hào)通路，促進(jìn)肺癌、多發(fā)性骨髓瘤的轉(zhuǎn)移。NEK2活化蘇氨酸激酶/核轉(zhuǎn)錄因子及基質(zhì)金屬蛋白酶促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移，活化的IL-8協(xié)同氨酸激酶/核轉(zhuǎn)錄因子通路促進(jìn)血管生成，同時(shí)上調(diào)ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)家族蛋白10表達(dá)，增強(qiáng)腫瘤耐藥[15]。我們的研究發(fā)現(xiàn)在非胃竇部胃癌中，NEK2的表達(dá)與淋巴轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)。這一結(jié)果提示我們，NEK2可能通過影響胃癌轉(zhuǎn)移相關(guān)通路發(fā)揮作用。

綜上所述，NEK2在胃癌組織中低表達(dá)，在非胃竇部胃癌中與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期呈負(fù)相關(guān)。NEK2低表達(dá)與胃癌患者不良預(yù)后顯著相關(guān)，且是獨(dú)立的影響因素，有可能成為胃癌預(yù)后判斷指標(biāo)之一。而進(jìn)一步研究NEK2在胃癌發(fā)生、發(fā)展中的機(jī)制，將為NKE2作為臨床靶向藥物開發(fā)的潛在靶點(diǎn)提供思路和理論基礎(chǔ)。

圖1 免疫組化檢測NEK2在胃癌和癌旁組織中的表達(dá)（×200）。A、C為癌旁組織，B、D為癌組織，A、B為NEK2低表達(dá)，C，D為NEK2高表達(dá)

圖2 NEK2在胃癌和癌旁組織中表達(dá)積分的秩次評(píng)分

圖3 NEK2表達(dá)與胃癌患者總生存的關(guān)系

圖4 GSE84437中NEK2表達(dá)與胃癌患者總生存的關(guān)系