張曉寒，趙 江，韓 英，刁翠茹，王 浩

（天津科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，食品營養(yǎng)與安全國家重點實驗室，天津 300457）

衰老是機體的一種退化，機體功能的下降以及調(diào)節(jié)系統(tǒng)的弱化導(dǎo)致對環(huán)境抵御能力減弱和與年齡相關(guān)的發(fā)病率增加[1-2]。隨著人們生活水平的提高，人口老齡化的現(xiàn)象越發(fā)嚴峻，世界人口統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，2000—2050年，60 歲以上人口的比例將從11%增長到22%，延緩衰老是應(yīng)對人口老齡化危機的一個重要方向[3-4]。衰老的發(fā)生常伴隨著體內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平的異常升高[5]。在生物體內(nèi)，ROS是一種特殊的信號分子，可調(diào)節(jié)人體的新陳代謝。如果ROS水平超過一定范圍，則會導(dǎo)致應(yīng)激損傷，破壞蛋白結(jié)構(gòu)并引起DNA突變，損害免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致疾病的出現(xiàn)并縮短壽命[6]。迄今為止，藥物干預(yù)在延緩衰老方面已經(jīng)取得了一定的效果，但目前仍沒有獲得國家藥監(jiān)局批準(zhǔn)的抗衰老藥物，因此尋找天然有效的抗衰老藥物十分重要[7]。

根皮素是一種二氫查耳酮類黃酮，具有廣泛的抗氧化、抗炎、抗腫瘤等生物活性，已在醫(yī)藥等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[8]。Shu Gang等[9]研究發(fā)現(xiàn)根皮素可通過調(diào)控胰島素敏感性緩解脂肪細胞功能障礙，提高葡萄糖和非酯化脂肪酸的利用率，減輕代謝疾病發(fā)生。Choi[10]研究發(fā)現(xiàn)，根皮素可阻斷細胞周期蛋白和周期蛋白依賴性激酶來抑制腫瘤細胞生長。已有研究發(fā)現(xiàn)根皮素可以提高機體的抗氧化能力，抵御他克林誘導(dǎo)人肝癌細胞的細胞毒性[11]，抑制化學(xué)致癌物引起的倉鼠體內(nèi)自由基異常積累[12]，而對于其延緩衰老機制鮮有研究，因此本實驗將對根皮素的延緩衰老機制做進一步研究。

秀麗隱桿線蟲由于其較短的壽命周期、透明的外表、高度保守的基因和擁有與人相似的衰老通路，常被用作衰老研究的模式生物[13]。本實驗以秀麗隱桿線蟲為模式生物，分析根皮素對線蟲壽命、運動能力、抗氧化性、抵抗應(yīng)激能力的影響，并通過逆轉(zhuǎn)錄熒光實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse transcription quantitative real-time polymerase chain reaction，RT-qPCR）檢測抗氧化基因mRNA的表達水平和基因突變體線蟲的壽命，探討在線蟲體內(nèi)根皮素延緩衰老機制，為基于根皮素的深入研究提供了一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

N2型線蟲由天津科技大學(xué)食品添加劑與營養(yǎng)調(diào)控研究室提供；突變體線蟲TJ356daf-16::GPF（zls356）IV、CB1370daf-2（e1370）、DA1116eat-2（ad1116）II、CF1038daf-16（mu86）、VC199sir-2.1（ok434）IV由中國科學(xué)院昆明植物研究所羅華榮教授實驗室提供。

根皮素（純度＞98%） 天津尖峰天然產(chǎn)物研究開發(fā)有限公司；五氟尿嘧啶 美國Sigma公司；雙氧水、2',7'-二乙酸二氯熒光素（2',7'-dichlorofluorescin diacetate，H2DCF-DA） 上海碧云天生物技術(shù)公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒、過氧化氫酶（catalase，CAT）試劑盒、丙二醛（malonaldehyde，MDA）試劑盒 南京建成生物工程研究所；TRIzol試劑、cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

MyCycler PCR儀、MyiQ2 qPCR儀 美國Bio-Rad公司；752型紫外-可見分光光度計 上海菁華科技儀器有限公司；G:box凝膠圖像采集分析系統(tǒng) 英國Syngene公司；智能恒溫培養(yǎng)箱 寧波海曙賽福實驗儀器廠；Neofuge 13R臺式高速冷凍離心機 力康發(fā)展有限公司；NewClassic MS電子天平 上海奕宇電子科技有限公司；SMZ-168顯微鏡 麥克奧迪實業(yè)集團有限公司；U-RFLT50型熒光顯微鏡 日本Olympus公司。

1.3 方法

1.3.1 線蟲同期化處理

用M9緩沖液收集生長健康無染菌線蟲到EP管中，反復(fù)離心清洗3～5 次，棄上清液。每管線蟲加入裂解液（0.5 mol/L氫氧化鈉溶液和體積分數(shù)2.5%次氯酸溶液），裂解8 min，1 000 r/min離心1 min，棄上清液，用M9緩沖液反復(fù)清洗5 次，加入M9緩沖液在20 ℃恒溫靜置12 h，1 000 r/min離心1 min，棄上清液，轉(zhuǎn)移至含有OP50大腸桿菌的線蟲培養(yǎng)基（nematode growth medium，NGM），20 ℃恒溫培養(yǎng)2 d，即得同期化L4期幼蟲。

1.3.2 線蟲壽命實驗

將同期化線蟲隨機分成7 組，每組2 板，每板60 條，分別為空白組（0 μg/mL）和根皮素組（10、25、50、75、100、150 μg/mL）。實驗過程中，線蟲每2 d更換一次NGM培養(yǎng)基（包含滅活OP50大腸桿菌和150 μmol/L五氟尿嘧啶，后者用于抑制線蟲繁殖）并統(tǒng)計壽命，直到所有線蟲死亡為止[14]。根皮素溶于二甲基亞砜，二甲基亞砜的最終質(zhì)量分數(shù)維持在0.1%，對秀麗隱桿線蟲無副作用[15]。

1.3.3 線蟲運動和吞咽實驗

收集同期化線蟲，線蟲培養(yǎng)同1.3.2節(jié)方法，線蟲運動測定參考Yang Jie等[16]的研究方法。用線蟲針輕輕觸碰線蟲，觀察在30 s內(nèi)線蟲是否連續(xù)一致做正弦運動，如果是，則記為快速運動；相反，則記為緩慢運動。當(dāng)使用尺子測量線蟲頭部運動的直線距離時，快速運動相當(dāng)于每10 s移動1 mm。線蟲每2 d在顯微鏡下進行一次計數(shù)，直到線蟲無快速運動能力為止。線蟲吞咽評價，在顯微鏡下用鉑絲輕輕觸碰線蟲，觀察線蟲咽部吞咽次數(shù)，每條線蟲至少統(tǒng)計3 次，取其平均值作為最終結(jié)果[17]。在立體顯微鏡下分別對線蟲在第2、4、6、8、10天的吞咽活動次數(shù)進行30 s的統(tǒng)計。每個獨立實驗至少做3 次重復(fù)。

1.3.4 線蟲急性應(yīng)激實驗

秀麗隱桿線蟲培養(yǎng)方法如1.3.2節(jié)所述，預(yù)先培養(yǎng)7 d后進行應(yīng)激實驗。在急性氧化應(yīng)激實驗中，線蟲暴露于30 mmol/L雙氧水，每30 min統(tǒng)計一次存活情況，直到線蟲全部死亡為止。在高溫應(yīng)激實驗中，線蟲暴露于30 ℃，培養(yǎng)1 h后轉(zhuǎn)移到36 ℃下進行應(yīng)激，每小時統(tǒng)計一次存活情況，直到所有線蟲死亡為止。在紫外應(yīng)激實驗中，線蟲暴露于75 μW/cm2的紫外燈下，每小時統(tǒng)計一次存活情況，直到所有線蟲死亡為止。

1.3.5 線蟲內(nèi)源性ROS和脂褐素?zé)晒鈴姸葴y定

線蟲培養(yǎng)方法如1.3.2節(jié)所述。線蟲培養(yǎng)15 d后，用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）沖洗滌3 次。ROS水平測定：避光H2DCF-DA處理20 min，PBS洗滌3 次，轉(zhuǎn)移到含有1%的瓊脂載玻片上，在熒光顯微鏡下觀察（激發(fā)波長485 nm、發(fā)射波長530 nm）。脂褐素水平評估：用NaN3麻醉，置于1%瓊脂糖載玻片上，熒光顯微鏡下觀察（激發(fā)波長340～380 nm、發(fā)射波長430 nm）[18]。脂褐素、ROS熒光強度用Image J軟件分析。

1.3.6 線蟲SOD、CAT活力及MDA水平的測定

秀麗隱桿線蟲培養(yǎng)如1.3.2節(jié)方法，預(yù)先培養(yǎng)7 d后（約2 000 條），用PBS清洗線蟲表面大腸桿菌，加入200 μL生理鹽水，冰上勻漿，4 000 r/min離心15 min，取上清液，根據(jù)試劑盒說明測定SOD、CAT活力和MDA水平。

1.3.7 線蟲抗氧化基因測定

收集培養(yǎng)7 d后的秀麗隱桿線蟲，用PBS沖洗。采用TRIzol提取總RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒合成cDNA。qPCR采用SYBR Green PCR Master Mix和Applied Bio-systems Plus Real-Time PCR系統(tǒng)進行。擴增條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共40 個循環(huán)。引物如表1所示，act-1為管家基因，基因表達以PCR的2－ΔΔCt值表示[14]。

表1 線蟲抗氧化基因qPCR引物Table 1 Real-time quantitative polymerase chain reaction primers for C.elegans antioxidant genes

1.3.8daf-16::GFP核易位測定

本實驗采用TJ356突變體線蟲，該品系線蟲特異性標(biāo)記了daf-16::GFP（zls356）[19]。daf-16::GFP（zls356）突變體線蟲培養(yǎng)方法如1.3.2節(jié)所述，線蟲預(yù)先培養(yǎng)48 h后，用PBS清洗，NaN3麻醉后轉(zhuǎn)移到含有1%的瓊脂糖載玻片上，在熒光顯微鏡下觀察（激發(fā)波長460～495 nm、發(fā)射波長510～550 nm）。daf-16::GFP熒光強度用Image J軟件分析。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用Prism 5軟件進行統(tǒng)計分析，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用單因素方差分析比較多組間的差異顯著性；用t檢驗法分析兩兩組間差異。P＜0.05為具有顯著差異，P＜0.01為具有極顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 根皮素對線蟲壽命的影響

圖1 秀麗隱桿線蟲壽命曲線Fig.1 Lifespan curves of C.elegans

由圖1可知，線蟲經(jīng)不同質(zhì)量濃度（10、25、50、75、100、150 μg/mL）的根皮素處理后，壽命顯著延長，且呈質(zhì)量濃度依賴趨勢，但根皮素質(zhì)量濃度在0～75 μg/mL范圍內(nèi)延壽效果最為顯著，故研究選取25、50、75 μg/mL質(zhì)量濃度梯度進行實驗。其中，與空白組相比，給予根皮素質(zhì)量濃度為25、50、75 μg/mL時，線蟲平均壽命分別延長了7.97%、16.98%和21.52%，最長壽命分別延長了4.77%、8.47%和15.99%。其中，給予根皮素的質(zhì)量濃度為75 μg/mL時，平均壽命從（13.43±1.06）d延長到（16.32±1.14）d，最長壽命從（17.82±0.71）d延長到（20.67±0.71）d（表2），以上結(jié)果表明根皮素在一定濃度范圍內(nèi)顯著延長了線蟲的壽命。

表2 根皮素對線蟲壽命的影響Table 2 Effect of phloretin on lifespan of C.elegans

2.2 根皮素對線蟲運動和吞咽能力的影響

隨著機體衰老，運動能力也會逐漸減弱。為了探究根皮素是否可以減緩因衰老所致的運動能力下降。本實驗以線蟲是否做連續(xù)一致的正弦運動作為衡量標(biāo)準(zhǔn)，通過統(tǒng)計快速爬行的數(shù)量來評估線蟲的運動能力[20]。

圖2 根皮素對線蟲運動能力（A）和吞咽頻率（B）的影響Fig.2 Effect of phloretin on motility (A) and pharynx pumping (B)of C.elegans

如圖2A所示，給予一定量的根皮素后，線蟲的運動能力顯著增強，并呈現(xiàn)出劑量依賴關(guān)系。其中，根皮素的質(zhì)量濃度為75 μg/mL，運動能力較空白組相比增加了37.72%。

為探究根皮素延長壽命是否受飲食量的影響，測定了線蟲的咽部吞咽頻率，通過線蟲的咽部吞咽頻率來衡量攝食量。如圖2B所示，與空白組相比，經(jīng)根皮素處理后，線蟲吞咽頻率無顯著差異（P＞0.05），結(jié)果表明根皮素延長線蟲壽命不受攝食量的影響。

2.3 根皮素對線蟲抵抗應(yīng)激能力的影響

圖3 根皮素對線蟲應(yīng)激抵抗能力的影響Fig.3 Effect of phloretin on stress resistance of C.elegans

表3 根皮素對線蟲應(yīng)激抵抗能力的影響Table 3 Stress resistance in C.elegans treated with phloretin

雙氧水可產(chǎn)生羥自由基，促進細胞內(nèi)氧化損傷，導(dǎo)致機體功能下降[21]。如圖3A所示，在雙氧水急性應(yīng)激實驗中，經(jīng)不同質(zhì)量濃度根皮素處理后，線蟲在經(jīng)歷雙氧水急性應(yīng)激時生存能力顯著高于空白組（P＜0.05），并呈現(xiàn)出劑量依賴關(guān)系。其中，與空白組相比，給予根皮素質(zhì)量濃度為25、50、75 μg/mL時，線蟲平均壽命分別延長了41.71%、46.86%和49.14%（表3）。

高溫會導(dǎo)致組織內(nèi)部的新陳代謝、酶的調(diào)節(jié)、氧氣的傳遞受阻，并促進活性氧的增加，導(dǎo)致熱應(yīng)激，進而縮短壽命[22]。如圖3B所示，經(jīng)根皮素處理后，線蟲在36 ℃急性應(yīng)激下的生存能力顯著增強（P＜0.05），其中給予根皮素的質(zhì)量濃度為25、50、75 μg/mL時，與空白組相比，線蟲平均壽命分別延長了1.47%、13.68%和18.11%（表3）。

紫外線可以穿透皮膚，擾亂免疫系統(tǒng)，破壞體內(nèi)自由基的平衡，引起蛋白質(zhì)變性和DNA損傷，破壞細胞的正常功能和結(jié)構(gòu)，加速衰老和病理變化[23]。如圖3C所示，線蟲給予一定質(zhì)量濃度根皮素后可以緩解紫外應(yīng)激導(dǎo)致的壽命降低。其中，經(jīng)25、50、75 μg/mL質(zhì)量濃度根皮素處理后，與空白組相比，線蟲平均壽命分別延長了32.02%、33.99%和35.96%（表3）。

如表3所示，根皮素能夠有效保護線蟲抵抗雙氧水、熱應(yīng)激和紫外損傷。在熱應(yīng)激抵抗的保護作用評價中，50 μg/mL和75 μg/mL組較空白組線蟲熱應(yīng)激抵抗能力顯著提高（P＜0.05）；50 μg/mL和75 μg/mL組較25 μg/mL組亦顯著提高（P＜0.05）。雙氧水和紫外應(yīng)激實驗評價中，25、50、75 μg/mL組較空白組線蟲應(yīng)激抵抗能力顯著提高（P＜0.05）；各劑量組間無顯著差異（P＞0.05）。

2.4 根皮素對ROS、脂褐素的影響

隨著機體逐漸衰老，其調(diào)節(jié)能力下降，ROS出現(xiàn)異常積累，導(dǎo)致氧化應(yīng)激，損害細胞結(jié)構(gòu)和功能的完整性，破壞機體氧化還原的平衡，進而細胞代謝減慢，影響正常壽命[24]。

圖4 根皮素對線蟲ROS和脂褐素積累的影響Fig.4 Effect of phloretin on ROS and lipofuscin accumulation of C.elegans

如圖4A所示，隨著機體衰老，線蟲體內(nèi)ROS在正常生理過程中處于穩(wěn)定狀態(tài)，當(dāng)?shù)竭_15 d時體內(nèi)ROS穩(wěn)態(tài)失衡，出現(xiàn)異常堆積。如圖4B所示，經(jīng)根皮素處理后，線蟲體內(nèi)ROS堆積水平顯著減少（P＜0.05），并呈現(xiàn)出劑量依賴關(guān)系，其中75 μg/mL根皮素處理線蟲后，ROS水平較空白組相比減少了32.55%（圖4D）。如圖4C所示，經(jīng)根皮素處理后，線蟲體內(nèi)脂褐素水平顯著減少，且呈現(xiàn)出劑量依賴關(guān)系（P＜0.05），其中75 μg/mL根皮素處理線蟲后，脂褐素水平較空白組相比減少了36.96%（圖4E）。

2.5 根皮素對SOD、CAT活力和MDA含量的影響

表4 根皮素對線蟲SOD、CAT活力和MDA含量的影響Table 4 Effect of phloretin on SOD and CAT activity and MDA content in C.elegans

壽命的延長通常伴隨著內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)的增強[25]。如表4所示，經(jīng)根皮素處理后，線蟲體內(nèi)SOD和CAT活力顯著提高，MDA含量顯著下降（P＜0.05）。其中，給予根皮素的質(zhì)量濃度為25、50、75 μg/mL時，線蟲體內(nèi)SOD活力較空白組相比分別提高了17.98%、23.04%和31.41%；CAT活力較空白組相比分別提高了9.2%、14.03%和25.37%；MDA含量較空白組相比分別降低了13.73%、23.68%和35.62%。

2.6 根皮素對線蟲胰島素通路的影響

胰島素通路作為一種典型的進化保守的壽命通路，其主要起調(diào)節(jié)作用的信號基因有daf-2、age-1和daf-16[26]。由圖5A可知，經(jīng)根皮素處理后，線蟲體內(nèi)daf-2和age-1的相對表達量均顯著下調(diào)，其中給予75 μg/mL根皮素時，線蟲體內(nèi)daf-2和age-1mRNA表達量較空白組相比分別減少了47.2%和42.43%，daf-16 mRNA相對表達量較空白組相比升高了39.94%。由圖5B可知，經(jīng)根皮素處理后，daf-2缺失型線蟲（e1370）平均壽命與空白組相比無顯著差異（P＞0.05），與N2型線蟲相比，壽命延長。由圖5C可知，經(jīng)根皮素處理后，daf-16缺失型線蟲（mu86）平均壽命與空白組相比無顯著差異（P＞0.05），與N2型線蟲相比壽命縮短。以上結(jié)果顯示，根皮素可以下調(diào)daf-2基因和上調(diào)daf-16基因進而延長線蟲的壽命。

圖5 根皮素對線蟲胰島素信號因子的影響Fig.5 Effect of phloretin on insulin signaling factors in C.elegans

daf-16是胰島素通路中起關(guān)鍵作用的基因，DAF-16核定位可促進下游靶基因sod-3、ctl-1和hsp-16.2的表達，提高機體抵抗能力，進而延緩衰老[19]。本實驗選取zls356轉(zhuǎn)基因線蟲（特異性標(biāo)記了daf-16::GFP）進行測定。如圖5D所示，經(jīng)根皮素處理后，daf-16::GFP（zls356）轉(zhuǎn)基因線蟲壽命顯著延長，并呈現(xiàn)出劑量依賴關(guān)系（P＜0.05）。如圖5F～G所示，根皮素促進了DAF-16核定位。如圖5E所示，經(jīng)根皮素處理后，線蟲體內(nèi)daf-16下游靶基因sod-3、ctl-1和hsp-16.2mRNA的相對表達水平顯著升高（P＜0.05），并呈現(xiàn)出劑量依賴關(guān)系。以上結(jié)果表明，根皮素促進了DAF-16核定位，增強機體抵抗能力和抗氧化能力，延長線蟲壽命。

2.7 根皮素對線蟲飲食限制的影響

圖6 根皮素對線蟲飲食限制的影響Fig.6 Effect of phloretin on dietary restriction of C.elegans

飲食限制通路可以減少能量限制和脂肪積累，增加對生長因子的敏感性從而延長壽命[27]。本實驗使用eat-2缺失型線蟲（ad1116）來評估根皮素延長壽命是否受飲食限制的影響[15]。如圖6A所示，經(jīng)根皮素處理后，N2型線蟲eat-2mRNA表達水平較空白組相比無顯著差異（P＞0.05）。eat-2突變體線蟲（ad1116）給予一定質(zhì)量濃度根皮素后，生存能力顯著增加（P＜0.05），并呈現(xiàn)出劑量依賴關(guān)系，當(dāng)給予根皮素的質(zhì)量濃度為75 μg/mL，與空白組相比，平均壽命延長了19.58%（圖6B），說明eat-2不參與根皮素延壽過程。以上結(jié)果顯示，根皮素延長壽命不受飲食限制的影響。

2.8 根皮素對線蟲SIR-2.1信號通路的影響

sir-2.1作為一個長壽基因，可通過提高機體的抗氧化能力，延長線蟲的壽命[28]。本實驗通過sir-2.1mRNA的表達水平和sir-2.1缺失型線蟲（ok434）評估了根皮素延長線蟲壽命是否受SIR-2.1信號通路的影響。

圖7 根皮素對線蟲SIR-2.1信號因子的影響Fig.7 Effect of phloretin on SIR-2.1 signaling factors of C.elegans

如圖7A所示，經(jīng)根皮素處理后，N2型線蟲sir-2.1的mRNA表達水平與空白組相比顯著升高（P＜0.05），當(dāng)給予根皮素的質(zhì)量濃度為75 μg/mL時，sir-2.1mRNA表達水平較空白組相比升高了28.70%，并呈現(xiàn)出劑量依賴關(guān)系。如圖7B所示，經(jīng)根皮素處理后，sir-2.1突變體線蟲（ok434）壽命較空白組相比無顯著延長（P＞0.05）。以上結(jié)果顯示，根皮素可通過調(diào)控SIR-2.1信號通路延長線蟲壽命。

3 討 論

衰老常常伴隨著功能的喪失和對外界壓力的抵抗或適應(yīng)性的降低[29]。衰老導(dǎo)致機體功能敏感度下降，中樞神經(jīng)傳遞受阻，調(diào)節(jié)能力下降，進而表現(xiàn)為運動能力下降[30]。本研究結(jié)果顯示，給予一定質(zhì)量濃度根皮素后，線蟲的平均壽命顯著延長，并呈現(xiàn)出劑量依賴關(guān)系（表2）；通過運動能力分析發(fā)現(xiàn)，根皮素可以改善因衰老引起的運動能力下降（圖2）。許多環(huán)境刺激因素包括紫外線輻射、化療藥物、高溫等，能夠刺激機體產(chǎn)生過量的ROS擾亂正常的氧化還原平衡，誘導(dǎo)細胞氧化應(yīng)激，加速衰老[31]。通過對線蟲進行氧化應(yīng)激實驗，實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)根皮素可增強線蟲抵抗外界刺激壓力，提高生存能力（表3）。以上結(jié)果表明，根皮素在線蟲體內(nèi)可發(fā)揮一定的延緩衰老作用。

自由基一直被公認為是機體衰老的一個重要因素，ROS的過度積累會引起脂質(zhì)過氧化、蛋白和DNA破壞，細胞信號通路的激活或改變，從而導(dǎo)致細胞凋亡或壞死，進而造成機體衰老[32]。ROS生成與抗氧化防御之間的平衡決定了氧化應(yīng)激的程度[33]。由正常生理代謝引發(fā)ROS異常增多而引起的氧化應(yīng)激，大部分被人體的抗氧化防御系統(tǒng)所抵消，主要發(fā)揮作用的抗氧化酶有SOD和CAT[34]。經(jīng)根皮素處理后的線蟲可以明顯改善因衰老引起ROS和脂褐素的異常堆積（圖4），提高內(nèi)源性抗氧化酶SOD和CAT的酶活力，減少脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的生成（表4）。以上結(jié)果表明，根皮素可以提高線蟲的抗氧化能力和清除自由基的能力，從而延長線蟲的壽命。這與Ghumatkar等[35]研究發(fā)現(xiàn)根皮素可以提高SOD和CAT活力，減少MDA的生成，改善小鼠的神經(jīng)退行性疾病發(fā)生的結(jié)果相一致。

胰島素信號通路是影響動物衰老的重要調(diào)控信號通路之一[36]。在胰島素信號通路中，受體激動劑胰島素樣肽與受體daf-2結(jié)合，招募胰島素受體底物，活化age-1上調(diào)PIP3水平，進而刺激一系列激酶級聯(lián)導(dǎo)致磷酸化，促使DAF-16轉(zhuǎn)錄因子失活[37]。本實驗結(jié)果顯示，經(jīng)根皮素處理后，線蟲體內(nèi)的daf-2和age-1的mRNA相對表達水平顯著降低（P＜0.05），且daf-16的mRNA相對表達水平顯著升高（圖5A）。此外，通過對兩種基因突變體線蟲daf-2（e1370）和daf-16（mu86）進一步研究，發(fā)現(xiàn)根皮素不能延長突變體線蟲的壽命，線蟲缺失daf-2或daf-16后，根皮素延長壽命的效果消失（圖5B、C）。以上結(jié)果表明，根皮素可通過胰島素通路daf-2/daf-16延長線蟲的壽命。DAF-16是胰島素信號通路調(diào)控應(yīng)激抵抗和長壽的關(guān)鍵因子，當(dāng)被激活后，DAF-16翻譯后修飾會誘發(fā)其核定位和轉(zhuǎn)錄程序，從而激活其下游靶基因sod-3、clt-1和hsp-16.2，進而介導(dǎo)應(yīng)激抵抗，延長壽命[38]。進一步研究發(fā)現(xiàn)，線蟲經(jīng)根皮素處理后促進了DAF-16核定位，并激活其下游靶基因sod-3、clt-1和hsp-16.2的mRNA表達（圖5E、F），結(jié)果表明根皮素可促進DAF-16核定位，激活下游靶基因提高抗氧化和壓力抵抗能力，延長了線蟲壽命。Wang Xue等[39]研究發(fā)現(xiàn)，松果菊苷可通過激活daf-16核定位，促進下游靶基因的表達，提高應(yīng)激抵抗能力并延長壽命，這與本實驗研究結(jié)果相似。

飲食限制通路是一個重要的延壽通路，該通路可以限制胰島素生長因子，進而延長壽命[40]。研究發(fā)現(xiàn)，飲食限制可改變線蟲代謝方式，延遲發(fā)育進而延長壽命[41]。由于eat-2（ad1116）突變體線蟲吞咽能力受阻，常被用來研究飲食限制的影響[42]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)根皮素處理后eat-2缺失型線蟲（ad1116）與N2型線蟲壽命相比無顯著差異（P＞0.05），且N2型線蟲給予根皮素后，eat-2基因mRNA表達水平較空白組相比無顯著變化（P＞0.05），推測eat-2不參與根皮素延壽過程（圖6）；同時，經(jīng)根皮素處理后線蟲吞咽頻率也無顯著變化（P＞0.05）（圖2B），這與Yang Jie等[16]研究發(fā)現(xiàn)的青陽參苷B延長線蟲的壽命沒有通過eat-2缺失型線蟲調(diào)控得到的結(jié)果相類似。以上結(jié)果表明，根皮素延長線蟲壽命不受eat-2飲食限制的影響。

sir-2.1作為一個長壽基因，可通過調(diào)控機體的應(yīng)激抵抗能力延長機體的壽命[43]。本實驗結(jié)果顯示，經(jīng)根皮素處理后，線蟲sir-2.1mRNA相對表達水平較空白組相比顯著升高，且sir-2.1（ok434）突變體線蟲給予根皮素后，壽命無顯著差異（P＞0.05）（圖7）。結(jié)果表明，根皮素延長線蟲壽命受SIR-2.1信號通路的影響[44]。Heidler等[19]研究發(fā)現(xiàn)，sir-2.1可以促進daf-16入核，提高抗氧化能力，延長線蟲壽命。本實驗已驗證根皮素促進了daf-16核定位，故推測根皮素可能通過sir-2.1作用于daf-16發(fā)揮其延長壽命的作用。

綜上所述，線蟲給予一定質(zhì)量濃度的根皮素后，壽命、運動能力和抗應(yīng)激能力顯著上調(diào)，其內(nèi)部機理是調(diào)控胰島素信號通路和SIR-2.1信號因子，促進DAF-16核定位并激活其下游靶基因的mRNA表達，提高相關(guān)抗氧化酶活力和應(yīng)激抵抗能力，使得線蟲壽命得到有效延長。

4 結(jié) 論

本研究以秀麗隱桿線蟲作為模式生物，在行為表現(xiàn)、生理狀態(tài)、內(nèi)源性抗氧化水平、抵抗應(yīng)激能力和相關(guān)衰老基因表達水平以及衰老通路等方面對根皮素的延長壽命潛在機制進行了初步探究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)根皮素可通過提高機體的抗氧化能力，降低因衰老導(dǎo)致的ROS和脂褐素水平的異常積累，且能夠通過調(diào)控衰老相關(guān)通路和基因表達水平，增強機體應(yīng)激抵抗和抗氧化能力，進而延長線蟲的壽命。本研究結(jié)果為根皮素的研究和開發(fā)提供了有力的理論參考，但壽命調(diào)控機制錯綜復(fù)雜，有待于繼續(xù)深入探究。